抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定

目的 筛选具有较好结合能力的抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体(scFv),并进行可溶性表达和鉴定.方法 前期实验室构建了抗木瓜凝乳蛋白酶全套鼠源scFv噬菌体抗体文库,对抗体文库进行4轮富集后,采用ELISA筛选抗木瓜凝乳蛋白酶阳性scFv;将ELISA最强阳性克隆pFAB5C-scFv的重组噬粒切除gene 3 singal后进行表达,SDS-PAGE分析、双抗体夹心ELISA分析、鉴定表达产物,并将阳性克隆可变区序列与Gene Bank数据库进行同源性比较.结果 经4轮噬菌体展示富集,筛选到3株亲和力相对较高的阳性克隆;去除gene 3 singal后的重组scFv在宿主菌E.coli XL1-blue中主要以可溶性的形式进行了表达,且对木瓜凝乳蛋白酶有较好的亲和力.基因序列分析表明阳性克隆所包含的重链可变区基因(VH)与小鼠免疫球蛋白γ重链基因同源性达96％,轻链可变区基因(VL)和小鼠免疫球蛋白轻链κ基因同源性达98％.结论 成功筛选出结合能力较好的抗木瓜凝乳蛋白酶scFv并进行了可溶性表达,所克隆的scFv基因符合小鼠抗体序列的特征.     

提高抗地高辛人单链抗体在大肠杆菌分泌型表达的研究

目的:提高从半合成噬菌体抗体库中克隆的抗地高辛(Dig) 人单链抗体(ADA scFv)在大肠杆菌(E.coli)的分泌表达水平.方法:①通过PCR从表达质粒pHEN2-ADA scFv扩增ADA scFv基因并重组于质粒p3MH构建表达质粒p3MH-ADA scFv后,转化到E.coli XL1-blue及HB2151; ②ADA scFv分别在带有上述2种表达质粒的E.coli HB2151 以及带有表达质粒p3MH-ADA scFv的E.coli XL1-blue进行表达,通过ELISA分析培养基上清中的可溶性ADA scFv;③在培养基中加入蔗糖、甘氨酸及Triton X-100,通过ELISA分析培养基上清中的可溶性ADA scFv.结果:①ADA scFv 在含表达质粒p3MH-ADA scFv的E.coli HB2151 及XL1-blue的分泌型表达水平比pHEN2-E.coli HB2151 表达系统高约 5 倍;②在培养基中加入蔗糖,可使ADA scFv 在含有表达质粒p3MH-ADA scFv的E.coli HB2151 及XL1-blue表达系统的分泌型表达提高 5 倍多.结论:通过采用不同的载体-E.coli表达系统以及在培养基中加入不被代谢的蔗糖,可使ADA scFv的分泌型表达提高 25 倍多.     

β淀粉样多肽人源性抗体的筛选与鉴定

目的：制备β淀粉样多肽(Aβ)人源性抗体并进行鉴定。方法：以Aβ1-42为抗原，利用噬菌体抗体库技术，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集反应，筛选出阳性克隆，进行ELISA检测。将单克隆噬菌粒转化大肠杆菌HB2151，诱导表达可溶性单链抗体(scFv)。结果：经过4轮筛选，获得56个能与AB结合的ELISA阳性克隆。经蛋白印迹检测(western blot)，表达的可溶性scFv抗体片段能够特异性地与A131-42结合，而与牛血清白蛋白(BSA)没有交叉反应。结论：该技术便捷有效，可不经免疫制备出高特异性的人源性抗体，为开展阿尔茨海默病的免疫疗法奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

人canstatin基因克隆及其重组蛋白表达

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,重组表达canstatin蛋白.方法从人胎盘组织中提取总RNA做模板,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增canstatin cDNA,转入克隆载体pUCm-T,再转化E.coli DH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列.酶切克隆载体目的基因,插入表达载体pET-22b( ),转化E.coli BL21,诱导表达重组蛋白.结果RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实与目的基因长度一致.RT-PCR产物与pUCm-T的连接产物转化E.coli DH 5α,篮白斑筛选后,选6个白色菌落做酶切鉴定,证实其中1个为阳性克隆,测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致.将pUCm-T上目的基因片段酶切后插入pET-22b( ),转化E.coli BL21,挑选7个菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中1个克隆表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白条带.结论成功克隆出canstatin基因,重组表达出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础.     

抗人Endoglin胞外段单链抗体的可溶性表达和鉴定

目的用E.coli HB 2151表达抗人Endoglin胞外段单链可变区片段（single chain variable fragment,scFv）,并鉴定其抗原结合活性,为卵巢癌的体内诊断和治疗研究提供靶向载体分子。方法用呈现scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB 2151进行抗体的可溶性表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定可溶性scFv的表达,竞争性ELISA检测可溶性scFv的抗原结合活性。结果抗人Endoglin胞外段scFv得到了可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,其分子量约为29kD。该周质提取物中scFv能与抗Endoglin单克隆抗体竞争性结合同一抗原表位,且竞争作用随scFv浓度增加而加强。结论用E.coliHB2151成功表达了具有抗原结合活性的抗人Endoglin胞外段scFv,为其应用研究奠定了基础。     

人源抗Rh(D)单链抗体基因的克隆和表达

目的:构建人源抗红细胞Rh(D)抗原单链噬菌体抗体库。方法:应用噬菌体展示技术,从分泌抗Rh(D)抗体的细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,多次PCR扩增和克隆抗体可变区基因(VH/VLcDNA),经重叠延伸拼接(SOE)用编码连接肽(Gly4Ser)3的互补序列组成scFv基因,经酶切克隆入载体pCANTAB5E,使之呈现于噬菌体表面。使用完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,ELISA对所获抗体进行初步鉴定。结果:构建的噬菌体抗体库库容为1.2×107,噬菌体DNA中全长scFv基因的插入率为0.80,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为3×108pfu/ml的初级噬菌体抗体库。以完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,出现特异性富集。经DotELISA实验鉴定,得到1株与Rh+型红细胞特异结合的scFv噬菌体抗体。结论:运用噬菌体抗体库技术构建了人源抗红细胞Rh(D)抗原的噬菌体抗体库,为进一步对所获克隆株进行序列分析、可溶性抗体表达和纯化奠定了基础。     

人源甲状腺髓样癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的：应用噬菌体抗体展示技术,构建大容量天然人源甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）噬菌体单链抗体库。方法：提取ＭＴＣ病人癌周淋巴结总RNA,通过RT-PCR方法获得抗体可变区基因VH和VL基因片断,以它们为模板分别扩增VH-Linker和VL-Linker,再用剪切重叠延伸ＰＣＲ技术将之拼接组装成单链抗体可变区基因片段（single chain fragment variable,scFv）后引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E后经电转入大肠杆菌Ecoli TG1,之后经辅助噬菌体M13K07超感染,构建人源MTC噬菌体单链抗体库。PCR鉴定scFv片段阳性插入率,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆双酶切产物。结果：MTC周围淋巴结总RNA的琼脂糖电泳结果可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp。用pUC19标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg,scFv的阳性插入率为87.5％（21/24）。结论：成功地构建了人源MTC噬菌体展示文库,为进一步筛选具有MTC细胞特异性的人源噬菌体单链抗体奠定了实验基础。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究

目的 利用噬菌体肽库技术,构建HIF1 α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响.方法 提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RT-PCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库.以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行淘选.SDS-PAGE电泳检测scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK-8检测scFv联合X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放疗存活曲线.结果 成功制备HIF1α人源喉癌单链抗体scFv,SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为34×103,Western blot表明其能下调HIF1α蛋白的表达.ELISA检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率高达79％,细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合.CCK-8检测结果显示scFv联合X线照射后,较单纯X线照射组明显降低了HEP2细胞的存活率(P＜0.05),克隆形成实验结果显示scFv对放射的增敏比为1.89.结论 成功构建了HIF1α人源喉癌单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放疗的敏感性.     

抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库,并筛选出阳性克隆。方 法用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体库,并以ＨＲＰ－Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附 一援救一感染扩增”的富集,挑取单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫 ＨＲＰ－Ⅱ的 单链抗体库,库容为 １０６,并从中筛选出８株阳性克隆。结论 噬菌体抗体库技术具有高效的筛选性能,抗 ＨＲＰ－Ⅱ单链 抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFV-M97基因克隆及分泌性表达

目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体.方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×109pfu/ml单链抗体库.对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体.结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732 bp.其中VH 351 bp,编码117个氨基酸;VL 336 bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gly4Ser)3相连.阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20 h,培养液上清中有2 μg/ml可溶性单链抗体.免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力.结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础.     

提高抗地高辛人单链抗体在大肠杆菌分泌型表达的研究

目的：提高从半合成噬菌体抗体库中克隆的抗地高辛（Dig）人单链抗体（ADAscFv）在大肠杆菌（E．coli）的分泌表达水平。方法：①通过PCR从表达质粒pHEN2－ADAscFv扩增ADAscFv基因并重组于质粒p3MH构建表达质粒p3MH－ADAscFv后，转化到E.coliXl1-blue及2151；②ADAscFv分别带有上述2种表达质粒的E.coliHB2151以及带有表达质粒p3MH－ADAscFv的E.coliXL1－blue进行表达，通过ELISA分析培养基上清中的可溶性ADAscFv；③在培养基中加入蔗糖、甘氨酸及TritonX-100，通过ELISA分析培养基上清中的可溶性ADAscFv。结果：①ADAscFv在含表达质粒p3MH－ADSAscFv的E.coliHB2151及XL1－blue的分泌型表达水平比pHEN2－E.coliHB2151表达系统高约5倍；②在培养其中加入蔗糖，可使ADAscFv在含有表达质粒p3MH-ADAscFv的E.coliHB2151及XL1－blue表达系统的分泌型表达提高5倍多。结论：通过采用不同的载体－E.coli表达系统以有在培养基中加入不被代谢的蔗糖，可使ADAscFv的分泌型表达提高25倍多。     

利用噬菌体展示技术筛选人源抗肝癌单链抗体

目的:利用噬菌体展示技术,从Griffinl Library人源噬菌体单链抗体库中筛选出人源抗肝癌单链抗体.方法:扩增Griffinl Library人源噬菌体单链抗体库后,以甲胎蛋白(AFP)为包被抗原,用免疫试管法富集筛选人源抗肝癌单链抗体,用ELISA法鉴定获得的阳性克隆,对其基因进行测序.将淘选出的阳性单链抗体...     

A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库的构建

目的　构建A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库。　方法　利用全套噬菌体抗体表面展示技术 ,从A型流感病毒核蛋白免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA ,利用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链基因的扩增。经重叠延伸反应 ,在体外随机装配成单链抗体。将其克隆到噬菌粒载体PCANTAB5E中 ,电转化TG1细菌 ,以辅助噬菌体M13 K0 7超感染噬菌体文库 ,构建全套ScFv抗体库。　结果　成功利用噬菌体表面展示技术 ,构建了A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,库容量达到 8 2× 10 7。　结论　构建全套A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,为利用亲和富集筛选技术 ,获得具有A型流感病毒核蛋白结合活性的完整重组噬菌体克隆奠定了基础。     

大容量天然人源单链抗体库的构建及抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体的淘选

目的：从大容量抗体库中淘选全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体。 方法：以60例健康供者的外周血淋巴细胞为来源,构建了10¹⁰人源天然单链抗体库,并以PreS1抗原肽进行淘选。3轮淘选后,单克隆经ELISA检测,富集的特异性单克隆经E.coli HB2151表达后进行Western检测并测序。 结果：3轮淘选之后,噬菌体的投入/产出比提高了100倍。抗原抗体反应结果显示,A₄₁₀=1.0的抗PreS1的单链抗体得到富集。Western结果显示其插入的单链抗体片段正确。该抗体基因序列的DNAPLOT软件分析结果进一步表明该抗体是人抗体,其V_H属于V_H1亚族,V_λ属于V_λ1亚族。结论：这一技术是获得全人源化抗PreS1的单链抗体的有效途径,同时为基因工程抗体用于临床治疗乙型肝炎奠定基础。     

大库容量人源性天然单链抗体库的构建

目的：构建一个大库容量（＞10^8）的人类天然单链抗体库。方法：从正常人400mL外周血分离林巴细胞,提取mRNA后反转录出cDNA第一链, 行半套式PCR扩增VH和VL基因片段,依次插入含Loxp和Loxp511序列的pDNA5,电转化TG1大肠杆菌,构建初级库进一步用初级库感染BS1365使其VH,VL发生重组从而获得次级库。结果：所有VH,VL亚类基因都得到了扩增,scFv克隆效率为99．9％,重组效率为每个单克隆BS1365中含至少8种不同的scFv基因。初级库容量为10^7,次级库容量至少为10^11。结论：我们采用细胞内重组的方法构建了10^11的人类天然抗体库。