基于DNA测序技术的市售地龙类药材基原调查与考证研究

目的:进行地龙商品基原调查和本草考证,澄清商品地龙品种情况,提高中药质量。方法:通过随机采集安国、亳州等7大主流药材市场的地龙商品药材,进行DNA提取和COI片段PCR扩增与核酸测序,与建立的地龙参考核酸数据库进行比对;对主流本草进行调查和梳理。结果:我国商品地龙主要来源于34个物种,22%的基原物种为参环毛蚓(参状远盲蚓Amynthas aspergillum),22%为通俗环毛蚓(通俗腔蚓Metaphire vulgaris),稀见栉盲环毛蚓和威廉环毛蚓(1%),55%的市售地龙均非2015年版《中华人民共和国药典》规定基原,而以保宁腔蚓M.magna为主;各市场主流商品地龙品种具有很大区别,具有显著的地域性特征;本草考证结果表明,历代本草中地龙基原并非一种,而是以具有"白颈"特征的环毛类蚯蚓入药,且历代本草、标准中多有变迁。结论:应建立合理、有效的地龙基原与质量控制方法。     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

地龙的本草考证及现代研究概况

地龙药用历史悠久,始载于《神农本草经》,被列为下品,原名蚯蚓,别名有土龙、曲蟮等。2015年版《中国药典》收载了广地龙与沪地龙2个品种,但由于地龙品种众多,市面上存在混有非药典收载科属地龙的现状。笔者在系统翻阅古今文献的基础上,对地龙的名称、基原、产地分布、道地产区、采收时间及炮制方法等方面进行考证。通过分析各类本草古籍和现代研究文献及其附图后,发现古籍中所提的"蚯蚓""白颈蚯蚓"是环毛蚓属的统称,古代药用蚯蚓可能为广地龙一类;古人认为白颈蚯蚓为质量较好的药用药材,与现代研究发现广地龙药材质量较土地龙好的观点相同。古今文献对地龙产地的记载较为一致,但由于环境的变化,野生地龙产量减少,现地龙输出以人工养殖为主。古时采收应尽量在春、夏、秋季,现代最佳采收时间是秋季。不同年代、地域流行的地龙炮制方法有所不同,应注重遵循和传承古法炮制,并结合现代研究技术,制定地龙炮制的量化标准,使地龙药材得到全面有效的应用。该文可为地龙的正本清源、资源开发、临床使用、道地产区及炮制方法确定等提供依据。     

基于COI和16SrRNA基因的地龙药材及其混淆品的DNA条形码鉴定

目的 利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（COI）和16S核糖体RNA（16SrRNA）对地龙药材及常见混伪品进行分子鉴定,探讨快速、准确鉴定地龙药材及其混伪品基原物种的方法。方法 收集地龙药材的药典收载品种及其易混品种10种,提取DNA,得到其COI和16SrRNA序列。所得序列经DNAStar校正后,用MEGA6.0自带的Clustal W多重比对,除去冗余位点,比对结果经MEGA6.0分析,构建地龙药材及其混淆品的邻接（N-J）树。结果 地龙药材的正品来源参环毛蚓（Pheretima aspergillum）、通俗环毛蚓（P. vulgaris）、威廉环毛蚓（P. guillelmi）及栉盲环毛蚓（P. pectinifera）与其混淆品种间COI和16SrRNA基因序列均存在较多变异位点。由所构建的N-J系统聚类树图显示所测物种的单系性,即16SrRNA、COI可以很好的将地龙药材区别于其他混伪品。结论 所获得的COI和16SrRNA序列可作为不同状态的地龙类药材物种鉴定的分子依据,并为进一步建立地龙等动物类中药物种真实性鉴定体系奠定了重要的实验基础。     

中药地龙的药源调查与商品鉴定

经对我国地龙药材的药源调查与商品鉴定,结果表明,地龙的原动物主要有13种和变种。分别隶属于钜蚓科和正蚓科的3个属。其中90％以上的商品地龙来源于药典收载品种参环毛蚓Pherctimaaspergillum（E．perrier）和威廉环毛蚓P．guillelmi（Michaelsen）、栉盲坏毛蚓P．pectinifera（Michaelsen）及通俗环毛蚓P.vulgaris（Chien）。其它品种如背暗异唇蚓Allolobophoracaliginosatrapezoides（Ant．Duges）、湖北环毛蚓P.hypeiessis（Michaelsen）、秉前环毛蚓P．praepinguis（Gates）等9种蚯蚓仅在少数地区使用。     

地龙（参环毛蚓）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为保障临床用药的安全性和有效性，建立地龙（参环毛蚓）药材及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法 根据地龙氧化酶亚基1（COⅠ）基因序列筛选出地龙配方颗粒的稳定引物区间，并根据区间内筛选获得地龙的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据SNP位点设计地龙特异性鉴别引物dlshmy-F及dlshmy-R，分别采集地龙及其混伪品，建立地龙配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系，对该方法进行耐受性和适用性考察。结果 退火温度为62 ℃，循环次数为36次，地龙及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后，可在约170 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带，其他近源伪品如通俗环毛蚓、保宁腔蚓、栉盲环毛蚓等20种伪品及阴性对照均无条带。结论 该研究建立的特异性PCR鉴别方法可快速准确的鉴别出地龙药材、配方颗粒、冻干粉中的参环毛蚓源性成分，准确鉴定出全国广地龙中药材及饮片以及地龙的基原，也可为其他的中药配方颗粒质量标准研究提供了参考。     

中药地龙的药源调查与商品鉴定

经对我国地龙药材的药源调查与商品鉴定,结果表明,地龙的原动物主要有１３种和变种。分别隶属于矩蚓蝌的３个属,其中９０％以上的商品地龙来源于药典收载品种参环毛蚓Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ａｓｐｅｒｇｉｌｌａｍ和威廉环毛蚓Ｐ．ｇｕｉｌｌｅｌｍｉ、栉盲环毛ｐｅｃｔｉｎｉｆｅｒａ及通俗环毛．ｖｕｌｇｏｒｉｓ其它品种如背暗异唇Ａｌｌｏｌｂｏｐｈｏｒａ ｃａｌｉｇｉｎｏｓａ ｔｒａｐｒｚｏｉｄｅｓ、湖北环毛蚓Ｐ、ｈｕ     

斑点免疫印迹法快速测定地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物

目的测定参环毛蚓、秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓和天锡杜拉蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物,建立斑点免疫印迹法评价相应生药材药效成分明确的中药炮制品质量新方法。方法以兔抗蚓激酶单抗为一抗,应用斑点免疫印迹法对地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物作定性检测,杂交信号应用Quantity One软件作定量分析。结果现行中药材参环毛蚓与山东产地方品种:秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓、天锡杜拉蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物的质量分数分别为125.23、118.34、81.05、72.13μg/g。结论秉氏环毛蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物与现行地龙炮制品参环毛蚓无显著差异,理论上可作为广地龙的替代品。斑点免疫印迹法简便快捷,结果准确,无需大型设备,可用于地龙与类似中药材炮制品的品质评价。     

经典名方中黄精的本草考证

通过查阅历代本草及医书典籍，结合现代文献资料、实地调查，笔者拟对经典名方中地龙药材的名称、基原、产地、品质、采收加工等方面进行考证，梳理古今药用地龙基原关系，为相关经典名方的开发与利用提供参考依据。经考证可知，地龙别名众多，本草类书籍以“蚯蚓”或“白颈蚯蚓”为正名。宋代及之后的方剂类书籍中处方名多用“地龙”之名。民国从《药物出产辨》开始，以“地龙”为正名。地龙在我国资源分布较广，全国各地均有出产，多为野生。根据古代地龙以“白颈蚯蚓”“颈白身紫”“大条”为入药原则，结合历史渊源、产地及易获取等方面确定，古代至今使用的地龙以参环毛蚓Pheretima aspergillum为主流，兼有其他多种蚯蚓作地龙入药。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）根据历史渊源和产地采收实际情况，自1995年版始，统一了地龙的基原，将参环毛蚓P. aspergillum加工的药材称为“广地龙”；将通俗环毛蚓P. vulgaris、威廉环毛蚓P. guillelmi和栉盲环毛蚓P. pectinifera加工的药材称为“沪地龙”。自此，之后出版的各本草书籍均与当时实行的《中国药典》为准。“广地龙”的道地产区为广东、广西等地；“沪地龙”的主产地为江苏、上海、浙江、安徽等地。且以广东、广西等地所产的“广地龙”品质最佳。采收后，去除泥土和内脏，洗净，干燥。临床切段入药，或依方炮制入药。古代地龙以“白颈蚯蚓”“颈白身紫”“大条”为主要质量评判标准，根据历史渊源，参环毛蚓P. aspergillum是地龙的主流基原，其品质较其他种类优良。因此建议身痛逐瘀汤中的地龙使用产于广东、广西等地的参环毛蚓P. aspergillum。采后及时剖开腹部，除去内脏和泥沙，洗净，干燥。     

地龙治疗心脑血管疾病研究概况

地龙俗称蚯蚓,为钜蚓科动物参环毛蚓,通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉盲环毛蚓的干燥体.在我国已有数千年的用药历史,早在《诗经》中有了关于蚯蚓的记录,如《礼记.月令》中所述孟夏之月“蚯蚓出”,仲冬之月“蚯蚓结”的观察记载.最早的本草学著作《神农本草经》中记载地龙药性咸、寒,归肝、脾、膀胱经,具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效.用于高热神昏,惊痫抽搐,关节麻痹,肢体麻木,半身不遂,肺热喘咳,水肿尿少等.现代研究发现地龙还有抗血栓、抗肿瘤、调节免疫、降压、抗心律失常、镇痛消炎等作用,其药用价值越来越受到重视,临床应用也日益广泛.     

中药材地龙

 《中药大辞典》将蚯蚓分为广地龙与土地龙两大类，其基原为巨蚓科参环毛蚓或正蚓科背暗异唇蚓等全体。但在医疗实践中，医家应用的种类很多，历代医著记载的“白颈蚯蚓”非指一种而是指 一类蚯蚓，现今药用的地龙种类更加广泛，本文对此略加概述。蚯蚓能传播寄生虫病，切勿生用蚯蚓。     

地龙的研究进展

通过对近年来国内外有关地龙研究文献的整理和分析,总结归纳了地龙的品种鉴定、药材质量控制、化学成分、药理作用及地龙人工养殖的最新研究进展。根据2015年版《中国药典》记载,地龙包括参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓。目前的研究表明,已有很多学者以地龙线粒体中细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)与16S r DNA基因作为DNA条形码进行地龙品种的鉴别,还运用了X射线衍射Fourier谱法及线粒体中12S rRNA基因作为分子标记来鉴定地龙品种,其鉴定方法还需进一步研究。目前已建立起多种地龙药材质量的控制方法,包括地龙HPLC指纹图、高效毛细管电泳特征图谱、酶活性为指标评价地龙药材质量及以灰关联度模型评价地龙药材质量等方法。地龙主要的化学成分包括蛋白质、氨基酸、酶类、脂类、微量元素、核苷酸等化合物,其主要药理作用有平喘降压、解热镇痛、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、增强免疫等。地龙的主要药效成分包括地龙蛋白、酶类、氨基酸、微量元素等,在有的药理作用中具体哪种成分发挥作用及其作用机制尚未明确,还需进一步深入研究。有关地龙的人工养殖鲜有报道,其养殖技术尚未成熟,规范化人工养殖地龙还处于摸索阶段。目前对地龙的研究还不足,使其具有广阔的研究和开发的前景。本文综述了近年来地龙的研究进展,为地龙的进一步研究提供参考依据。     

地龙的药理研究

地龙(又名蚯蚓)为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或栉肓环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen及正蚓科动物背暗异唇蚓Allolobophora caliginosa trapezoids(Ant.Duges)等的干燥全体,是重要的动物药材之一,其性咸寒,具有清热定惊、通络平喘、利尿等功效.现代研究表明,地龙有溶栓、抗肿瘤、降压等药理活性,其药用价值备受重视.近年来国内外学者对地龙的临床应用、药理作用,尤其是生物工程技术方面的研究空前热门,而制剂及其质量控制、剂型发展等方面的综合分析较少,故笔者对此作一综述,为地龙制剂的开发和质量控制提供依据.     

中药地龙研究进展

地龙作为药用在我国有着悠久的历史。近年来,药理研究与临床应用越来越广泛深入,并取得了可喜的成果和进展。1来源地龙(又名蚯蚓)为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima     

地龙的研究概况

地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或栉肓环毛蚓Pheretima pec-tinifera Michaelsen的干燥体,前一种习称＂广地龙＂,后三种习称＂泸地龙＂,广地龙春季至秋季捕捉,泸地龙夏季捕捉,及时剖开腹部,除去内脏和泥沙,洗净,晒干或低温干燥;性寒,味辛、苦,清热利湿,祛风止痒;用于小便涩痛,阴痒带下,风疹,湿疹,皮肤瘙痒[1]。     

地龙临床应用概况

地龙,亦名蚯蚓,俗称曲蟮。为巨蚓科动物参环毛蚓(广地龙)或正蚓科动物背暗异唇蚓(土地龙)的全体,味咸性寒,无毒。现代药理研究认为有解热、镇静、抗惊厥、降压及舒张支气管等作用。临床应用较为广泛,现据有关文献,概述如下。一、慢性气管、支气管炎地龙止喘有效成分为琥珀酸,临床证明有宽胸化痰、平喘作用。穴位注射复方地龙注射液(地龙、白前)治疗慢性气管炎     

HPLC法测定沪地龙中次黄嘌呤

沪地龙是钜蚓科通俗环毛蚓P heretim a vu l-garis Chen、威廉环毛蚓P. gu illelm i M ichaelsen或栉盲环毛蚓P. p ectin if era M ichaelsen的干燥体。夏季捕捉,及时剖开腹部,除去内脏及泥砂,洗净,晒干或低温干燥。地龙具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功能,用于高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肢体麻木、半身不遂、肺热喘咳、尿少水肿及高血压[1]。地龙分为广地龙与沪地龙,过去主要使用广地龙,而近年来上海也养殖地龙,但对沪地龙的研究较少,据报道次黄嘌呤是地龙扩张支气管成分,从地龙中分离出的次黄嘌呤有抗组胺、降血压等作用[1]。…     

参环毛蚓中溶栓活性蛋白酶的纯化和检测

参环毛蚓Pheretima aspergillum (E．Perrier)为《中华人民共和国药典》2000年版一部中收载的地龙药材来源之一。地龙始载于《神农本草经》，具有通络、利尿、清热、定惊、平喘之功，临床常用于高热神昏、惊厥抽搐、关节痹痛、半身不遂、高血压等。日本学者从赤子爱胜蚓中提取出类似尿激酶的物质，     

鲜蚯蚓糖浆的制备及临床应用

蚯蚓属巨蚓科动物参环毛蚓 (广地龙 )或正蚓科动物背暗异唇蚓等 (土地龙 )的全体。现代研究表明蚯蚓主要成分及药理作用为 1蚯蚓解热碱、花生四稀酸 ,具有解热作用。 2次黄嘌呤 ,为降压成分之一 ,并有抗组织胺及舒张支气管作用。3琥珀酸 ,为平喘有效成分。此外还有谷氨酸等多种氨基酸及胆碱、胍等 ,在临床上使用较为广泛 ,民间亦用于多种疾病的治疗。现将民间常用的活蚯蚓糖浆的制备及使用介绍如下。1　鲜蚯蚓糖浆的制备取体长 2 0 cm左右的鲜活蚯蚓若干条 ,置于清水中吐净泥土 ,清洗干净。再用消毒敷料吸尽体内外水分 ,放入清洁容器中加入 …     

不同产地地龙药材的微性状鉴别及品质研究

目的:通过对市场上地龙及其混伪品进行微性状区分,结合灰分、重金属及浸出物的检测,研究和规范市场上地龙的品种,为地龙的鉴别提供依据,提高市场上地龙药材的品质。方法:通过查阅相关资料,收集市场上不同品种的地龙药材。使用体视显微镜观察样品,拍摄不同景深的图片,利用景深合成技术合成一张高清的微性状图片来对其进行鉴别;根据中国药典方法对其灰分、重金属和浸出物进行检测。结果:通过微性状鉴别发现不同药材市场上同一产地地龙有不同程度的非正品存在,其受精囊孔周围的乳突情况和所处的环节以及雄孔的形状有明显的区别。不同产地的地龙药材灰分和重金属大部分合格,浸出物大部分不合格。结论:利用微性状鉴别法能够准确快速的鉴别地龙的品种并能区分其混伪品,简单方便,效率高;地龙药材的品质有待进一步研究。