灵猫方药物血清体外抗乙肝病毒作用的研究

目的：观察灵猫方药物血清对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制效果。方法：应用SD大鼠备置5倍和10倍灵猫方药物血清、生理盐水大鼠血清,将3种血清分别作用于HepG2.2.15细胞,在第72小时、96小时、144小时收集细胞培养上清液,采用ELISA法检测HBsAg、HBeAg。结果：与生理盐水大鼠血清相比较,灵猫方药物血清在72小时后即产生抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,96小时时对乙肝病毒（HBV）的抑制率达到高峰,在144小时对HBV的抑制率有所下降;5倍灵猫方药物血清和10倍灵猫方药物血清在抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg方面,差异无显著性意义。结论：灵猫方药物血清在体外具有一定的抗HBV的作用。     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的 构建1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)真核细胞表达载体,观察其在HepG2细胞中的表达。方法 从pGEM—HBV载体上将约4.1kb的1.3倍HBV全基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1的Hind Ⅲ位点,将构建的pHBV经Lipofectamine2000导入肝癌细胞系HepG2细胞中。分别在转染后24、48、72h测定HepG2上清液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的表达,细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫组织化学染色,Southern、northern杂交鉴定HBV的复制与表达。结果成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体,转染后24、48、72h细胞上清液中HBsAg分别为5.36±0.25,13.42±1.24,7.52±0.43;HBeAg分别为9.16±0.32,22.75±1.49,15.96±1.03。免疫荧光结果显示转染后24 h细胞内HBsAg表达最强,主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。Southern、northern杂交均证实细胞内存在各种病毒复制中间体和特异的病毒复制转录物。结论 该表达载体可介导高水平病毒复制,其转染细胞可望成为一种新型的HBV 体外感染模型。     

HBV全基因组1.3倍体HepG2细胞模型的构建与表达

目的构建含HBV全基因组1.3倍体(1.3 ploid HBV,HBV 1.3P)的HepG2细胞模型,并观察HBV生物标志物的表达规律。方法通过腺病毒将全基因组合成的1.3倍HBV序列转染入Hep G2细胞中,构建HBV 1.3P-HepG2细胞模型,采用琼脂糖凝胶电泳鉴定HBV 1.3P重组腺病毒质粒,利用ABI 3730测序仪确定重组腺病毒质粒中含有正确的1.3倍HBV序列,荧光显微镜下鉴定HBV 1.3P腺病毒感染HepG2细胞的最佳感染复数(MOI),qRT-PCR测定0~9 d HBV 1.3P-HepG2细胞模型中HBV DNA、ccc DNA的表达水平,化学发光法、免疫荧光法分别检测上清液及细胞内HBsAg、HBeAg的表达量。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果当MOI=40时,HepG2细胞被HBV 1.3P重组腺病毒感染的效率达到90%以上;在感染第2天即可分别在上清液和细胞内中检测出HBV DNA、ccc DNA、HBsAg及HBeAg等标志物的表达,在4~6 d达到峰值水平,7 d之后逐渐下降。结论所构建的HBV全基因组1.3倍体HepG2细胞模型能稳定表达HBV标志物,为开展HBV的相关研究奠定了基础。     

低密度cDNA Macroarray对干扰素α抗病毒蛋白的筛选

目的 基于低密度cDNA Macoarray技术筛选出差异表达的干扰素(IFN)α抗病毒基因,以探讨IFN α抗病毒蛋白的表达与HBV复制的关系. 方法 以一定浓度的IFN α处理肝胚瘤细胞株HepG2和HepG2.2.15细胞6h,用cDNA Macroarray分析比较两细胞株IFN α抗病毒基因表达谱,并筛选出差异表达的IFNα抗病毒基因.将表达HBV核心蛋白(HBc)的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,RT-PCR法分析HBc对IFN α抗病毒基因表达的影响.将表达抗黏病毒A蛋白(MxA)的表达质粒pcDNA3.1-Flag-MxA转染HepG2.2.15,以酶联免疫吸附试验、Dot blot、Southern blot等方法分别检测HepG2.2.15细胞表达释放的HBsAg与HBeAg、细胞外HBV DNA和细胞内HBV DNA复制中间体(松弛环状DNA、双股线性DNA),以判断HBV复制情况.两组间数据比较采用t检验,组间不同时间点数据比较采用单因素方差分析.结果 cDNA Macroarray分析显示HepG2和HepG2.2.15细胞的抗病毒基因表达谱具有差异性:IFNa抗病毒基因中干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)1、IFITM2、IFITM3、RING4等在HepG2.2.15细胞的表达被部分抑制,而重要的抗病毒蛋白MxA表达被完全抑制.HBc转染组细胞中MxA mRNA表达的相对水平为0.31±0.05,低于空白对照组的0.74±0.04,差异有统计学意义,P＜0.05.MxA蛋白转染HepG2.2.15细胞48、72 h后,MxA转染组细胞上清液中HBsAg的S/CO值分别为1.42+0.21和1.58±0.18,HBeAg的S/CO值为1.44±0.14和2.28±0.24,而空白对照组细胞上清液中HBsAg的S/CO值为1.92±0.19和2.79±0.25,HBeAg的S/CO值为2.31±0.46和3.37±0.29,两组细胞上清液中HBV抗原的S/CO值差异均有统计学意义,P值均＜0.05.细胞外HBV DNA、胞内HBV复制中间体DNA均无明显变化.结论 HBV及其抗原成分的复制和表达影响着IFNα抗病毒蛋白的表达;HBV通过抑制IFN α抗病毒蛋白的表达而发挥拮抗IFNα的抗病毒活性.     

细胞内La蛋白对乙型肝炎病毒蛋白质表达的影响

目的 探讨细胞内La蛋白对HBV蛋白质表达的影响.方法 针对人La蛋白序列设计特异性的小分子干扰RNA(siRNA),通过体外转录的方法合成双链siRNA,并转染进入稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞,实时荧光定量基因扩增技术测定HepG2.2.15细胞中的La蛋白mRNA变化水平;电化学发光分析技术检测HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg变化情况.所得数据进行配对假设检验的统计学分析.结果 特异性siRNA干扰La蛋白mRNA的表达,使La蛋白在HepG2.2.15细胞中的表达降低;HepG2.2.15细胞分泌在培养上清液中的HBsAg和HBeAg表达显著下降,相关性分析显示,HBsAg、HBeAg变化水平与La蛋白mRNA变化水平呈正相关,相关系数分别为0.938和0.899.结论 特异性siRNA能够抑制细胞内La蛋白mRNA的表达,La蛋白可通过某种方式影响HBV蛋白质的表达.     

维甲酸诱导基因-I诱导干扰素的产生在乙型肝炎病毒感染清除中的作用

目的探讨维甲酸诱导基因-I(RIG-I)在诱导HBV感染IFN产生中的影响,以期对阐明乙型肝炎慢性化机制,寻找新的治疗靶点提供新的思路。方法以RIG-I表达载体flagRIG-l-ful1转染培养6孔板中的HepG2、HepG2.2.15,24h后用水疱性口炎病毒(VSV)感染细胞,然后在0、8、16和24h收集细胞及培养上清液,采用quantitive RT-PCR、Western印迹检测RIG-I、MDA5、IPS-1、ISG54等基因的表达,ELISA检测培养上清液中分泌的IFN-β水平。结果 HepG2.2.15细胞在VSV感染后IFN-β分泌水平(11.18±1.34)pg/mL明显低于HepG2细胞(275.50±22.97)pg/mL(P<0.01);通过质粒flagRIG-I-ful1转染高表达RIG-I后,HepG2.2.15分泌IFN-β的能力恢复至(548.78±57.99)pg/mL与HepG2细胞(532.10±39.34)pg/mL接近的水平(P=0.7013)。结论 HepG2.2.15细胞感染VSV后IFN产生障碍,高表达RIG-I后IFN表达水平得到恢复,提示RIG-I功能缺陷导致抗病毒免疫应答降低,RIG-I可能在HBV感染清除中起重要作用。     

APOBEC3G体外抗乙型肝炎病毒的研究

目的探讨载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide like3G,APOBEC3G）（也称为CEM15）体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用及其机制。方法脂质体转染pcDNA3.1 Human APOBEC3G-Myc-6Xhis、pcDAN3.1/His-C进入HepG2.2.15细胞,转染后,RT-PCR证实转染基因的表达,Western Blot证实蛋白的表达。通过ELISA方法检测细胞上清液中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及乙型肝炎e抗原（HBeAg）,RT-PCR分析APOBEC3G对HBV mRNA转录的影响。结果APOBEC3G基因与蛋白在HepG2.2.15细胞都有表达,与空质粒转染组相比,pcDNA3.1 Human APOBEC3G-Myc-6Xhis转染组HBsAg含量下降70.38%,HBeAg含量下降62.88%,未转质粒细胞为空白对照组。结论APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗乙肝病毒感染。     

乙型肝炎病毒对驱动蛋白家族成员4A表达的影响

目的 探讨有慢性HBV感染史的原发性肝癌患者癌组织与癌旁组织驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)表达的差异,了解HBV对KIF4A表达的影响.方法 采用RT-PCR和Western 印迹法检测患者癌组织和癌旁组织KIF4A的表达;将浓度分别0、0.2、0.4、0.6和0.8 μg/mL的HBV感染性克隆pHBV1.3与KIF4A基因启动子共转染HepG2细胞,并测定荧光素酶的活性;检测HepG2细胞转染pHBV1.3后KIF4A mRNA和蛋白表达变化;统计学分析采用t检验.结果 KIF4A在癌组织表达显著高于癌旁组织,HBV能激活KIF4A基因启动子的活性,且随着pHBV1.3浓度的增加,荧光素酶活性也不断增强,分别为(126.8±13.4)、(219.8±16.7)、(387.6±21.5)、(586.5±228.9)和(657.6±35.5) RUL/μg蛋白,转染不同剂量的空白对照组,荧光素酶活性分别为(123.6±13.8)、(131.8±14.6)、(129.7±13.5)、(135.3±13.4)和(127.1±12.7)RUL/μg蛋白,两组比较,差异有统计学意义(t=4.875,P=0.006);HBV在mRNA和蛋白水平上调KIF4A的表达,且这种激活作用随着pHBV1.3浓度的增加而增强.结论 原发性肝癌患者KIF4A表达水平升高,HBV能上调KIF4A的表达.     

肝细胞表面PD-L1的表达及干扰素和HBV对其表达的调节

目的测定肝细胞表面程序性死亡分子受体1（PD-L1）的表达,分析干扰素-α（IFN-α）及乙型肝炎病毒（HBV）对PD-L1蛋白和基因表达水平的调节。方法采用流式细胞术、实时定量PCR等方法,测定PLC/PRF/5细胞表面PD-L1分子的表达;观察不同剂量IFN-α作用下,PLC/PRF/5细胞表面PD-L1表达水平的变化;比较HepG2和HepG2.2.15两种细胞的PD-L1mRNA水平,分析HBV对PD-L1表达水平的调节。结果肝细胞表面组成性地表达PD-L1分子;随着IFN-α作用剂量的增加,肝细胞表面PD-L1的表达水平先升高,随后缓慢降低;转染有HBV基因组的HepG2.2.15细胞,其PD-L1的mRNA水平显著高于不含HBV基因组的同源细胞株HepG2细胞。结论肝细胞表面组成性表达PD-L1分子;干扰素及HBV感染可影响肝细胞PD-L1的蛋白和基因表达水平。     

乙型肝炎病毒感染BALB/C小鼠动物模型建立的实验研究

[目的]建立小鼠急性乙型肝炎病毒(HBV)感染的动物模型,观察小干扰RNA(si RNA)在体内对HBV复制和表达的影响.[方法]通过尾静脉快速、高负荷注射含1.5倍的HBV真核表达质粒(pHBV1.5).注射后第6天,MEIA检测血清HBsAg、HBeAg的水平;RT-PCR检测肝组织HBV prec/c mRNA转录的水平.同时设立pcDNA3.1正常对照组和PBS空白对照组.[结果]pHBV1.5注射组小鼠血清HBsAg、HBeAg为阳性,且肝组织表达HBeAg;而pcDNA3.1和PBS对照组未能检测到HBsAg、HBeAg的表达.[结论]成功地建立了急性HBV感染的BALB/C小鼠动物模型,在一定程度上克服了由于HBV宿主范围极窄给人们研究带来的极大限制.     

IPS-1SNP在调控HBV感染后干扰素应答机制的研究

目的：探讨干扰素β启动子刺激因子1（IPS-1）不同单核苷酸多态性（SNP）基因型对HBV感染后干扰素应答作用机制。方法利用IPS-1野生型和rs17857295、rs7262903、rs7269320三种SNP基因型慢病毒表达载体,转染目的细胞HepG2、HepG2．2．15细胞,qPCR检测HBV感染和IPS-1不同SNP基因型对目的基因表达情况的影响,检测细胞转染后IFN-βmRNA表达水平,探讨IPS-1不同SNP基因型对HBV感染后细胞干扰素应答的机制。结果IPS-1rs17857295和rs7262903两种SNP基因型转染HepG2．2．15细胞后,IPS-1基因表达水平显著低于野生型转染组（451．77比712．53,498．71比712．53,P＜0．01）;但IFN-βmRNA表达水平显著高于野生型转染组（分别为5．33比0．98和3．59比0．98,P＜0．01）;rs7269320SNP基因型过表达后,IPS-1基因表达水平显著低于野生型转染组（290．63比712．53,P＜0．01）,但IFN-βmRNA表达水平无明显变化（0．74比0．98）。另外,rs17859295基因型分别转染HepG2和HepG2．2．15细胞后,后者IFN-βmRNA表达水平显著高于前者（5．33比2．25,P＜0．01）。结论IPS-1rs17857295和rs7262903两种SNP基因型HBV感染者,尤其rs17857295SNP基因型,清除病毒的能力可能强于野生型的感染者;而IPS-1野生型和rs7269320SNP基因型HBV感染者可能更易形成病毒感染的慢性化。     

肽核酸抑制HBV复制与表达的体外研究

合成肽核酸(PNA)片段,由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞与HBV各编码区保守区域相结合。用ELISA方法测定HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg滴度,PCR测定HBV DNA含量。通过计算抑制百分率,筛选有效PNA片段。结果在500 mol/L浓度下,PG3 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为51.03%、55.38%、20.10%;PG6 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为47.00%、43.10%、51.03%。表明PNA可由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞,从而抑制HBV的复制和抗原系统的表达。     

乙型肝炎病毒X蛋白及其截短体与损伤DNA结合蛋白1在HBV复制中的作用

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)及其两个截短体(HBx1 ～ 101、HBx43～ 154)与损伤DNA结合蛋白(DDB)1在HBV复制中的作用.方法 用质粒瞬时转染HepG2细胞,72 h后分别提取细胞总蛋白质和总RNA,通过Western blot分析验证DDB1蛋白表达,逆转录实时定量PCR在基因的mRNA水平观察HBx蛋白及其截短体对DDB1蛋白表达的影响.提取转染72 h后细胞胞质DNA,收集细胞的培养上清液,通过实时定量PCR及酶联免疫吸附试验检测各组细胞胞质HBV DNA复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平,从而观察HBx蛋白及其两个截短体与DDB1对HBV复制的影响.对数据进行单因素方差分析及t检验.结果 在有HBV复制的HepG2细胞中,缺失HBx转染组细胞中DDB1蛋白在mRNA水平明显下降(相对表达水平为野生型转染组的52.74％±8.95％,t=9.143,P＜0.05),胞质DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平也明显下降(相对表达水平分别为野生型转染组的55.49％±1.19％、48.05％±2.90％、46.22％±2.20％,P值均＜0.05).共转染HBx N-端截短体HBx43～54后细胞中DDB1蛋白mRNA水平恢复到野生型水平,且能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBV DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平.但共转染HBx C-端截短体HBx1 ～ 101的细胞中DDB1蛋白在mRNA水平较野生组明显下降(相对表达水平为野生型转染组的59.95％±9.09％,t=7.629,P＜0.05),且不能使转染缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBVDNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平(相对表达水平分别为野生型转染组的62.53％±0.67％、63.13％±2.14％、55.40％±0.99％,P值均＜0.05).并且各转染组DDB1蛋白mRNA水平变化与胞质HBV DNA复制和培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平是一致的.结论 C-端53个氨基酸及DDB1蛋白对于HBV野生型水平的复制是需要的,而N-端42个氨基酸对于HBV复制水平无明显影响.C-端53个氨基酸对HBV复制的影响作用可能是通过影响DDB1蛋白水平实现的.     

乙型肝炎病毒(HBV)反基因与HBV的结合及对HBV复制的影响

目的 研究三螺旋形成寡核苷酸与HBV基因的结合情况及其对HBV复制的影响。方法 全盛一段能与HBV核心启动子位点（1734-1753nt)形成三螺旋的寡核苷酸（TF020）并标记上生物素分别用脂质体-TF020及裸TF020转染HepG2.2.15细胞,用链酶亲和素-生物素法（SABC）检测其转染效率及其与HepG2.2.15细胞中HBVDNA的结合情况;并采用ELISA、半定量逆转录（RT）-PCR及荧光定量PCR法分别检测经寡核苷酸处理的HepG2.2.15细胞及空白对照细胞上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA及细胞中HBV RNA的水平。结果 脂质体-TF020转染HepG2.2.15细胞的效率可达80%,而裸TFO20转染率最高为40%;TF020主要定位于细胞核及胞浆中,TF020处理组细胞上清中HBsAg、HBeAg含量分别较空白对照组降低37.0%及78.2%,HBV DNA水平较空白对照组明显降低;而细胞中2.4kb/2.1kb RNA、3.5kb/3.4kbRNA亦分别降低31.6%及70.2Z%。结论 TF020通过脂质体包裹后可以很好地进入细胞并与HBV DNA结合;TF020能够有效地抑制HBV复制,发挥抗病毒作用。     

包膜蛋白突变对乙型肝炎病毒包装的影响

目的　探讨包膜蛋白突变对HBV包装的影响。方法　构建包膜蛋白突变的全长HBV基因组表达载体:前S1突变HBV表达载体pHBV mS1、Sloop突变HBV表达载体pHBV mS和前S1、S共突变HBV表达载体pHBV mS1S。分别转染HepG2细胞,以野生型HBV质粒 (adwR9 )转染HepG2细胞为对照;pHBV mS1S和pcDNA3分别与adwR9共转染HepG2细胞。ELISA方法检测上清液中和胞内S抗原;荧光定量PCR检测胞内和上清液中病毒量。结果　突变体pHBV mS1、pHBV mS和pHBV mS1S与对照组adwR9中S蛋白表达量和分泌量无明显差别;单独转染的突变体胞内病毒量较adwR9高,尤其以pHBV mS1S明显,而突变体上清中病毒量较对照组adwR9低,尤其以pHBV mS1S明显;pHBV mS1S与adwR9共转染组上清液中病毒量较pcDNA3与adwR9共转染组低。结论包膜蛋白突变对S蛋白表达量和分泌量无影响,但影响病毒包装,使病毒分泌量下降。     

HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定

背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)体外感染模型是开展HBV生命周期、致病机理、药物筛选等研究的基础.随着临床抗HBV治疗进入"功能性治愈""完全治愈"新时代的趋势,对能稳定模拟共价闭合环状DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)转录机制,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)致病机理的细胞模型的需求日益迫切.HBV1.3倍(1.3-fold HBV)全基因组包含了全部HBV生物信息,能依赖自身启动子启动转录过程,支持cccDNA形成和完整病毒复制,最接近于HBV体内感染状态下的生命周期.慢病毒转染是一种以慢病毒为载体,将外源分子如DNA, RNA等导入真核细胞的技术,可形成稳定转染.目的采用慢病毒转染技术构建HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型,筛选并鉴定出能稳定、高效表达HBV生物标志物的优势单克隆株.方法构建含1.3-fold HBV基因组信息的慢病毒质粒并包装慢病毒;以最佳感染复数(MOI)值将1.3-fold HBV慢病毒液侵染靶细胞HepG2,以抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin,BSD)最佳筛选剂量筛选出稳定整合1.3-foldHBV基因的Hep G2细胞系(1.3-foldHBV-Hep G2),继而采用PCR法鉴定该细胞模型中的HBV DNA序列.将1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞进行培养并挑选出9株候选阳性单克隆,通过测序各单克隆细胞的侧翼序列,以确定9株候选阳性单克隆相应的基因组在HepG2细胞基因组中的插入位置,再根据各候选单克隆株表达HBsAg、HBeAg的水平,筛选出最优势单克隆株.将该优势单克隆株与HepG2.2.15细胞株分别持续培养20代,比较这两种细胞株表达HBsAg、HBeAg、HBx、cccDNA、HBVDNA等标志物的水平及稳定性.结果(1)将慢病毒pLenti-BSD-1.3-foldHBV以MOI=30的参数侵染HepG2细胞, 72 h后加入BSD抗生素(终浓度1μg/mL)进行筛选,连续培养15-20 d后,获得1.3-foldHBV-HepG2稳转细胞系,PCR鉴定出HBVDNA序列;(2)在挑选出的9株候选阳性单克隆中,编号A14的细胞株(命名为HepGA14)的HBsAg、HBeAg表达水平最高,分别为24.28 IU/mL、39.62 NCU/mL,其插入HepG2基因组位置为1:166461695-166461715,确定为优势单克隆株;(3)与Hep G2.2.15细胞株比较, HepGA14优势单克隆株1-20代能稳定、高表达HBs Ag、HBe Ag、HBx、HBVDNA、ccc DNA,差异均具有统计学意义(P0.05).结论成功构建并筛选出1.3-fold HBV基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株HepGA14,这为后续开展HBV-宿主关系、发病机制及药物筛选等奠定良好的基础.     

针对HBV—P基因的RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究

目的构建针对乙型肝炎病毒P基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的表达载体psiHBV／p,观察RNA干扰对HBsAg、HBeAg及乙型肝炎病毒DNA复制的抑制作用。方法针对HBV—P基因区特异序列,构建siRNA的表达载体psiHBV／p。采用脂质体介导方法将其与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞。分别于转染后24小时、48小时、72小时用ELISA法对HepG2细胞培养上清液进行HBsAg、HBeAg的检测;于转染后72小时通过FQ-PCR法分析RNA干扰作用对HBVDNA的抑制效果。结果成功构建了针对HBV—P基因区的siRNA的真核表达重组体psiHBV／p,并发现它能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌,转染后第二天抑制率达高峰,分别为84％、65％。FQ—PCR结果也证实了转染72小时后,随psiHBV／p比例的升高,其对HBV DNA的抑制作用也随之增加。结论成功构建的psiHBV／p,它能在体内持续转录产生针对P基因转录体的发夹状siRNA;在细胞水平上,体内转录产生的、针对乙型肝炎病毒P基因区特异序列的siRNA对共转染的重组载体pHBV1．3有显著和特异的抑制作用。     

热休克蛋白90抑制乙型肝炎病毒复制的初步研究

目的 了解热休克蛋白90 (HSP90)对HBV复制的影响并探讨其可能的分子机制. 方法 构建人HSP90真核表达质粒pXF3H-HSP90 (HA-HSP90),与HBV复制型质粒HBV1.3共转HepG2细胞,ELISA检测细胞上清液HBsAg表达水平,Southern blot检测HBV复制中间体的表达.将HA-HSP90表达质粒或HSP90 siRNA转染HepG2细胞,实时定量逆转录聚合酶链反应检测白细胞介素(IL)-1β、IL-6以及干扰素应答基因1(IFIT1)的表达.将TANK结合激酶1(TBK1)siRNA、HBV1.3、HA-HSP90共染HepG2细胞,Southern blot检测HBV复制中间体的表达.多组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验. 结果 成功构建了表达HSP90的真核表达质粒HA-HSP90.转染HA-HSP90的HepG2细胞内高水平表达外源蛋白,而未转染质粒的细胞内没有检测到外源蛋白的表达.转染HA-HSP90质粒组细胞上清液中的HBsAg表达量吸光度值为0.124±0.033,明显低于转染空载体pXF3H组的0.340±0.011及未转染组的0.615±0.069(F=61.013,P＜0.05).过表达HSP90也能抑制HBV复制,转染HA-HSP90组、转染空载体pXF3H组与未转染组HBV复制中间体表达量吸光度值分别为108.92±8.59、872.45±13.00和7856.37±60.23,差异有统计学意义(F=28260.00,P＜0.05).在HepG2细胞内高表达HSP90能诱导高水平的IFIT1产生,其中HA-HSP90组与空载体对照pXF3H组IFIT1表达的2-△△CT值分别为82.139±0.919和5.579±0.644,差异有统计学意义(F=13.108,P＜0.05),但未检测到IL-1 p与IL-6的诱导表达.下调HepG2细胞中干扰素信号通路分子TBK1不影响HSP90对HBV的抑制,其中HSP90组与siTBK1+ HSP90组HBV复制中间体条带灰度值分别为1952.64±67.88和2366.64±71.16 (F=31.30,P＞0.05). 结论 HSP90能够抑制HBV的复制与蛋白表达,这种抑制作用不依赖于TBK1通路,也与IL-1β信号通路无关.     

HBeAg特异性细胞免疫反应体外抗乙肝病毒作用

目的探讨体外HBeAg特异性细胞免疫反应对乙型肝炎病毒(HBV)mRNA表达及蛋白合成的影响。方法自正常人外周血单核细胞中诱导培养树突状细胞(DC),经不同浓度的HBeAg负载后与自身T细胞共同培养,诱导产生HBeAg特异性T细胞,同时设与无HBeAg刺激的DC共同培养的T细胞、单纯T细胞为对照组,作用于HepG2.2.15细胞系,逆转录PCR(RT-PCR)检测HepG2.2.15细胞内乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)的mRNA水平,酶联免疫法(ELISA)检测细胞培养上清中HB-sAg和乙肝e抗原(HBeAg)水平。结果经HBeAg刺激激活的T细胞可以有效地抑制HBsAg、HBcAg mRNA的表达(P0.05)及HBsAg、HBeAg的合成(P0.05),且随着HBeAg刺激浓度的升高,对上述指标的抑制率逐渐上升。结论HBeAg特异性细胞免疫反应可显著抑制HBV mRNA和蛋白的表达,为开发HBeAg相关的治疗性疫苗奠定理论基础。     

HBV感染对IFN-γ表达的影响

目的探讨HBV感染对干扰素-γ(IFN-γ)表达的影响。方法选择HBeAg阳性的慢性乙型肝炎(CHB)患者30例、HBeAg阴性的CHB患者30例、慢性HBV携带者30例、健康对照者30例,采用巢式PCR检测各组血中HBV DNA水平,Real Time RT-PCR检测外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-γmRNA的表达水平。结果 90例慢性HBV感染者PBMC中IFN-γmRNA水平较正常对照组明显下降(P<0.01),其中慢性HBV携带组IFN-γmRNA水平最低,其次为HBeAg阳性组;慢性HBV感染者血清HBV-DNA与PBMC中IFN-γmRNA水平呈负相关(P<0.05)。结论慢性HBV感染者IFN-γ表达水平下降可能与HBV感染有关,HBV感染可引起细胞免疫功能紊乱,可能是HBV感染慢性化的主要原因之一。