基于链置换反应的DNA等温扩增技术应用进展

DNA等温扩增是在恒定温度下用非热变性的方法解开DNA双链的一种扩增技术。链置换反应指某些具有链置换活性的DNA聚合酶在延伸新链的同时将下游旧链剥离,它已被用于多种体外等温扩增技术,包括链置换扩增、滚环扩增、多重置换扩增、环介导的等温扩增等。其主要应用于DNA测序、全基因组扩增、基因芯片、微生物病原体检测等领域。     

滚环扩增原理及其在医药领域的应用

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展，介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。     

红花SRAP扩增体系的建立和优化

目的:探讨影响红花SRAP扩增的各种因素,建立能够稳定扩增红花基因组的体系,为研究红花重要性状的遗传基础及建立分子辅助标记育种的技术平台奠定基础.方法:用CTAB法提取红花DNA,设计Taq酶浓度(0.02、0.04、0.06 U/μl)、dNTP浓度(0.15、0.25、0.30 mmol/L)、Primer浓度(0.15、0.30、0.45 μmol/L)3因素3水平27次实验和Mg2 浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L)8水平单因素实验.在25 μl体系中加入模板DNA 20 ng.对体系进行优化,用琼脂糖进行检测.结果:本研究建立了适合红花的SRAP体系,Taq酶浓度为0.02 U/μl,dNTP浓度为0.25 mmol/L,Primer 浓度为0.30 μmol/L,Mg2 的浓度为3.0 mmol/L,优化后的体系目标条带增多,重现性好,得到了较好的扩增效果.结论:本研究建立的反应体系适合红花SRAP的研究.     

环介导等温核酸扩增检测缓冲液成分的探索

目的 探索环介导等温扩增(LAMP)检测反应体系缓冲液,为我国野战/灾害等紧急输血的血液筛查提供技术支持.方法 通过对LAMP体系不同组分的梯度分析对检测结果的影响进行研究.结果 扩增效率随着反应体系内Mg2+浓度的增高而降低;LAMP反应的扩增效率随着反应体系内Betain浓度的增高而增高.随着Calcein浓度的降低,LAMP反应体系内的绿色荧光逐渐减弱.结论 建立的反应体系具有较好的反应灵敏度及特异性,与成品化的试剂相似,可适用于临床血液病原体筛查.     

川木通的随机扩增多态性DNA与序列特征性扩增区域标记研究

目的采用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）法建立川木通的分子鉴定方法,为川木通的快速鉴定奠定基础。方法从100对随机引物中筛选出5对多态性丰富的RAPD引物进行川木通10个种的扩增分析,最终得到C13为阳性序列特征性扩增区域（sequence characterized amplified regions,SCAR）标记。结果阳性SCAR标记均可以进行川木通原植物与药材的分子鉴定引物,C13可以鉴定上述2种药典品种和商品主流品种（粗齿铁线莲、钝萼铁线莲）。结论RAPD法简便易行,为亲缘关系较近的多基原药材的鉴定提供了一种新方法。     

人骨髓间质干细胞分离和培养扩增方法的研究

目的 :探索分离、纯化及培养成人骨髓间质干细胞 (hMSC)的最佳方法。方法 :采用Ficoll Paque淋巴细胞分离液和全血接种两种方法分离成人MSC ,筛选体外培养hMSC适合的培养基和适宜的血清含量 ,流式细胞仪检测hMSC表面抗原表达。结果 :经Ficoll Paque淋巴细胞分离液分离后 ,接种于 φ =10 0mL/L胎牛血清的L DMEM培养液 ,细胞贴壁良好 ,增殖速度快 ,hMSC在体外扩增 5代可获得 1× 10 8细胞。全血接种分离hMSC ,细胞贴壁慢、少 ,生长情况欠佳。除L DMEM ,其他类型的培养基均不适合hMSC的培养扩增。流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD44、CD10 5、CD166表达阳性 ,CD14、CD3 3、CD3 4、CD3 8、CD45、CD11a为阴性。结论 :用Ficoll Paque淋巴细胞分离液分离骨髓单核细胞 ,接种于 φ =10 0mL/LFCS的L DMEM培养液 ,分离培养扩增hMSC的效果最好     

新型等温扩增技术应用于疟原虫等寄生虫快速诊断的研究进展

当前常用基于PCR原理的核酸检测技术来检测疟原虫,疟原虫检测方法主要包括镜检法、抗原免疫检测法和核酸检测法等。但由于存在检测时间长、人员和设备要求高等缺点,限制了其在基层的推广应用。特别是基层普遍缺乏经验丰富的专业技术人员和高端仪器设备,此外在极端环境下快速检测大规模样品的需求等对现存疟原虫检测方法造成了挑战。近年来发展起来的等温扩增技术由于具有简便、快速、灵敏性和特异性高等优点,具有潜在的应用前景。本综述介绍了试对各类等温扩增技术的原理、特点和前景等,并在此基础上重点综述重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）与重组酶介导的等温扩增技术（recombinase-aided isothermal amplification assay, RAA）,并提出利用这类重组酶扩增技术,实现常见疟原虫种快速、精确诊断的可能。     

几种主流恒温扩增技术及其优化策略进展

2019年末爆发的新型冠状病毒(2019-n CoV)疫情严重威胁着人类健康与经济发展,遏制疫情发展的关键是如何准确、快速地完成2019-nCoV病毒检定。虽然2019-n CoV检测主流技术平台为PCR聚合酶链反应,但恒温扩增技术因其无需昂贵设备、操作流程简便、即时检验、结果判读简易可视化等优势,逐步成为某些紧急场景PCR替代技术。本文综述了六种主流恒温扩增技术,即依赖核酸序列扩增、滚环核酸扩增、链置换扩增、解旋酶依赖扩增、重组酶聚合酶扩增、环介导恒温扩增,并从等温核酸扩增原理、优化反应策略及其应用领域进行了阐述。     

鼻腔NK/T细胞淋巴瘤T-bet基因扩增及特异表达的研究

目的 探索鼻腔NK／T细胞淋巴瘤（N-NK／T—L）特异基因改变及其表达变化。方法 对同一病例的N-NK／T-L肿瘤细胞和外周血白细胞进行限制性酶切路标基因组扫描（RIGs），并结合相应虚拟基因组扫描（VGS）生物信息分析，及基因库检索确定异常基因信号；通过对上述结果发现的异常基因进行克隆和探针制备，对3例新鲜N—NK／T-L肿瘤组织和1例外周血标本进行了Southern和斑点印迹杂交分析，并对20例石蜡组织N-NK／T-L以及对照组包括17例同部位B细胞淋巴瘤、3例正常脾组织和5例慢性炎性鼻黏膜组织进行了原位杂交检测。结果 RLGS和VGS法显示N-NK／T-L肿瘤细胞中存在T-bet基因异常；经Southem和斑点印迹杂交检测证明在3例新鲜N-NK／T-L肿瘤细胞中有T-bet基因扩增；原位杂交显示T-bet基因在20例N-NK／T-L中阳性表达者为18例（90．0％），而B细胞淋巴瘤中仅为2例（11．8％），两者比较差异有统计学意义（P〈0．01）。在3例脾组织和5例慢性炎性鼻黏膜组织中均未有T-bet表达。结论T．bet基因在N-NK／T-L肿瘤细胞中存在基因扩增和过表达，T-bet基因的异常表达可能在N-NK／T—L的发生中起一定作用，并有必要对其是否可作为分类依据和辅助诊断的指标做进一步研究。