肾功能衰竭大鼠超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞肾脏移植MR活体示踪的研究

目的应用磁性氧化铁纳米粒子和多聚左旋赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）的偶联物Fe2O3-PLL标记大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），MR活体示踪经肾动脉移植入肾功能衰竭（简称肾衰）大鼠肾脏的标记细胞。方法制备Fe2O3-PLL，分离、纯化并培养大鼠骨髓MSCs，Fe2O3-PLL标记细胞，普鲁士蓝染色显示细胞内铁。肌内注射甘油所致肾衰的大鼠分为2组，分别经左肾动脉移植入标记细胞（6只）和未标记细胞（5只），移植后即刻及第1、3、5、8天应用MRI对移植细胞进行活体示踪，并与肾脏组织切片普鲁士蓝染色和HE染色对照。结果MSCs的Fe2O3-PLL标记率近100％，普鲁士蓝染色显示蓝色铁颗粒位于MSCs胞质内。标记细胞移植后肾衰大鼠肾脏皮质区信号强度明显下降，T2＊WI信号改变最明显，而肾髓质及肾盂信号较细胞移植前无明显变化，信号改变随着时间的延长逐渐减轻一直持续到移植后第8天。组织学分析见绝大多数标记细胞分布于肾皮质肾小球内，与MRI信号改变区域基本一致。未标记细胞移植后未见肾脏信号改变。结论Fe2O3-PLL可以有效标记大鼠骨髓MSCs，临床应用型1．5T磁共振仪可对经肾动脉移植入肾衰大鼠肾脏的标记细胞进行初步活体示踪。     

体外磁标记骨髓基质细胞移植治疗大鼠创伤性脑损伤的在体磁敏感加权成像研究

目的 采用磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging,SWI)序列在体监测超顺磁性氧化铁颗粒(su perparamagnetic iron oxide,SPIO)标记大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在创伤性脑损伤(trau matic brain injury,TBI)模型大鼠腩内的分布及移行.材料与方法首先进行BMSCs体外培养,然后采用SPIO体外标记BMSCs;TBI采用Feeney法制作,TBI 24 h后于损伤区周围立体定向移植BMSCs,并于移植后1天、1周及3周行MR检查.结果 标记BMSCs普鲁士蓝染色显示胞质内存在较多蓝染颗粒,电镜下胞浆内可见散在分布的铁颗粒.细胞移植后MRI可见移植部位在SWI各图像上均呈团块状低信号.结论 SWI序列能够连续无创性活体示踪移植SPIO标记BMSCs在TBI模型大鼠脑内的形态和分布.     

超顺磁性氧化铁标记鼠骨髓间充质干细胞的体外MR成像研究

目的: 探讨不同浓度超顺磁性氧化铁(SPIO)颗粒标记鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记率和对细胞活力的影响,以及MR成像显示磁标记干细胞的可行性.材料和方法: 将不同浓度的SPIO-PLL复合物与培养基混合,行普鲁士蓝染色观察细胞内铁和检测细胞活力.应用1.5T MR仪,以T1WI和T2WI行磁标记干细胞成像.结果: SPIO可有效标记MSCs,标记后的铁颗粒位于细胞质内.SPIO标记的MSCs可引起T2WI信号降低,50、100、150较25μg Fe /ml的信号强度降低明显.结论: SPIO可以简便标记MSCs,并在适当浓度下对细胞活力没有影响,此技术为干细胞移植的MR活体内示踪奠定基础.     

超顺磁性氧化铁标记猪骨髓间充质干细胞的体外MR成像研究

目的 明确超顺磁性氧化铁(SPIO)粒子体外标记猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法、经MR成像的特征及可成像的最低标记细胞量.方法 分离、纯化、培养猪MSCs,体外进行不同种类SPIO标记,对标记细胞行普鲁士蓝染色及荧光显微镜观察;测量并绘制未标记细胞和标记细胞的MTT生长曲线;选取不同的细胞量组进行标记后MR成像,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.结果 该方法标记MSCs的有效率为100%,普鲁士蓝染色见细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒;SPIO标记的MSCs在T2WI尤其是FFE(T2*WI)序列信号明显降低;在25 μg Fe/ml培养液标记浓度下,MR成像的最低细胞量为1×105;在不同种类SPIO标记下,2#、3#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上有统计学差异,而1#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上无明显统计学差异;Feridex标记MSCs在T2WI及T2*WI上与T1WI之间均有统计学意义. 结论该方法可以简便标记MSCs并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可敏感显像磁性标记的干细胞.     

成簇成肌细胞的磁共振成像观察

目的:成肌细胞移植是治疗心功能不全的有效手段,磁共振成像(MRI)可以无创动态观测组织内移植细胞的分布及迁移增殖。本研究通过MRI观察超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记的成簇成肌细胞,探讨MRI应用价值。材料和方法:常规方法进行成肌细胞培养,应用脂质体包被的SPIO及DAPI双标记成肌细胞,通过MR及荧光显微镜观察标记的成簇成肌细胞。结果:普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒,标记有效率为100%,通过MRI可以观察到标记的成簇成肌细胞呈现为黑点状影像,与荧光显微镜下所观察到的影像有一定对应性。结论:利用磁共振成像技术可以观察到成簇的细胞,为进一步利用磁共振对移植细胞活体无创追踪奠定了实验基础。     

脑梗死大鼠脑内移植超顺磁性氧化铁颗粒标记神经干细胞后的MR示踪研究

目的探讨超顺磁性氧化铁颗粒（SP10）标记的胎鼠神经干细胞（NSCs）在脑梗死模型大鼠脑内移植后，MR示踪观察的可行性。方法大鼠脑梗死模型24只，按随机数字表法分为3组：第1组大鼠同侧尾状核移植SP10和5-溴脱氧尿核苷（BrdU）双标记的NSCs；第2组对侧尾状核移植双标记的NSCs；第3组对侧尾状核移植未标记的NSCs。移植后1、3、5、7周后进行MR示踪观察，选择T2WI和梯度回波（GRE）序列，成像后相应时间点每组处死2只大鼠，取脑组织冰冻切片后进行普鲁士蓝染色及BrdU染色。结果移植后1周MRI显示：移植标记细胞组在注射点处可见类圆形低信号影，未标记细胞组注射点未见异常信号影；3周后，第1组梗死皮层下可见线状低信号影；移植5周后，第2组沿胼胝体走行可见扇形低信号影，尖端指向病灶。GRE序列显示标记细胞较清晰，而T2WI显示梗死病灶和大鼠脑正常结构较清晰。相应时间点相应部位普鲁士蓝染色及BrdU染色可见阳性细胞，与MRI结果相符。结论超顺磁性氧化铁颗粒和BrdU双标记的神经干细胞移植至大鼠脑内后可迁移到病灶区；MR成像能够在活体内连续示踪观察神经干细胞的迁移及分布情况。     

神经干细胞超顺磁性氧化铁标记及体内外MRI示踪

目的使用超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米粒子对神经干细胞进行体外标记,并在体外及活体移植后对标记细胞进行MRI示踪。方法实验动物包括13只SD大鼠。联合应用SPIO及多聚左旋赖氨酸(PLL)通过受体介导的内吞作用标记神经干细胞,对标记细胞分别进行普鲁士蓝染色、电子显微镜观察、体外MRI示踪及活体移植后体内MRI示踪。体外1.5T及4.7TMR扫描对象分为5组,分别为5×105个标记后培养1d的细胞、5×105个相同时期未标记的细胞、提取标记细胞后的含铁培养基、相应的无铁培养基及蒸馏水。扫描序列包括轴面T1WI、T2WI及T2WI,并在4.7TMR仪上测量标记细胞的弛豫率R2及R2的变化。结果(1)该方法标记神经干细胞的有效率为100%,普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒。(2)体外1.5T及4.7TMRI显示,标记细胞同未标记细胞相比,T1WI信号强度平均上升分别为20.53%及24.06%,T2WI信号强度平均下降分别为40.78%及50.66%,T2WI信号强度平均下降46.57%及53.70%。1.5TMRI上标记细胞的信号改变在T2WI与T2WI之间差异无统计学意义(F=3.06,P>0.05),而T2WI及T2WI与T1WI之间差异均有统计学意义(F=6.5,P<0.05)。(3)4.7TMRI测量未标记细胞和标记细胞的T2分别为516ms及77ms,其弛豫率R2分别为1.94s-1及12.98s-1;T2分别为109ms及22.9ms,其弛豫率R2分别为9.17s-1及43.67s-1。(4)标记细胞活体移植1周后行1.5TMR检查,见移植部位在T2WI及T2WI上呈显著低信号,而对照侧未见低信号。结论该方法标记神经干细胞简单高效,标记细胞弛豫率R2及R2明显提高,并能采用1.5TMRI对标记细胞进行活体内外示踪研究。     

铁羧葡胺标记猪间充质干细胞的体内外磁共振成像研究

目的 探讨铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记猪骨髓间充质干细胞(MSC)的体外和活体心脏内MR成像的特点.方法 分离培养猪MSC,用含铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记细胞24 h.分别于标记后0、4、8、12、16、20 d行普鲁士蓝染色观察细胞内铁,原子吸收分光光度仪测定细胞内含铁量,锥虫蓝排除试验检测细胞活力.对不同时间点、不同细胞数的磁标记干细胞进行1.5 T MR仪体外成像,并对植入猪心肌内的标记细胞进行体内MR成像.结果 ①MSC标记后见胞质中大量普鲁士蓝着色颗粒,标记率达100%,铁离子含量平均为(13.13±2.30)pg/细胞;随细胞的分裂增殖,细胞内铁离子含量逐渐减少,16 d时铁离子含量下降到(0.68±0.20)pg/细胞,接近标记前水平[(0.21±0.06)pg/细胞,P＞0.05].干细胞磁标记后各时间点的锥虫蓝拒染率与未标记细胞无统计学差异(P＞0.05).②3种成像序列中GRE T2*WI信号改变最为明显,成像细胞数量越多,信号强度变化越明显.1×106个细胞进行MR成像,发现随着标记后体外培养时间延长,T2*WI磁标低信号逐渐消失,12 d以后信号强度和标记前无差异(P＞0.05).体外MR成像最少能检测到5×104～1×105个标记的猪MSC.③标记细胞心肌内移植后1周MR成像显示低信号区.结论 应用铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记猪MSC安全、高效;体外MR信号强度能一定程度上反映磁标记细胞的数量及增殖情况;1.5 T临床MR成像仪可对植入心脏的磁标记细胞进行活体显像示踪.     

胎鼠神经干细胞超顺磁性氧化铁颗粒标记移植后MRI研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记神经干细胞的方法,以及标记细胞正常大鼠脑内移植后MR成像的方法学研究。方法:多聚左旋赖氨酸介导的SPIO标记胎鼠神经干细胞,进行台盼兰染色和普鲁士兰染色分别检测标记细胞的存活率和标记率。选取SD大鼠15只,简单随机法分为3组:第1组于大鼠右侧尾状核移植未标记的NSCs,第2组于大鼠右侧尾状核移植标记的NSCs,第3组右侧尾状核移植游离的SPIO颗粒,移植后第1、4、8周进行MRI。8周后处死大鼠,行组织切片普鲁士兰染色。结果:体外标记的神经干细胞普鲁士兰染色发现铁颗粒聚集于细胞浆内,标记率为100%;标记细胞与未标记细胞的台盼兰染色结果无显著差异。移植后MRI,第1组注射点未见低信号影;第2组注射点T2WI及GRE序列均可见类圆形低信号影;第3组大鼠注射后1周注射点可见低信号影,4周后低信号影变淡且边缘变模糊,8周后低信号影T2WI已不明显。与T2WI序列比较,GRE序列显示标记细胞更清晰,但显示范围较扩散。脑组织切片的普鲁士兰染色显示,第1组大鼠脑组织切片未见异常蓝染细胞,第2组注射点可见蓝染细胞,第3组注射点可见稍许散在蓝色颗粒状物质。结论:多聚左旋赖氨酸介导下SPIO可用于标记神经干细胞,标记细胞移植后MRI可以无创性观察移植神经干细胞的位置及分布情况。     

骨髓间充质干细胞的培养和超顺磁氧化铁标记

目的探讨全血贴壁法培养成年大鼠骨髓间充质于细胞的可行性，寻找一种对间充质干细胞进行示踪的方法。方法取6～8周龄雄性SD大鼠胫骨、股骨，收集骨髓腔冲洗悬液直接培养，经多次换液、传代，免疫组化法检测CD34、CD44表达情况。以超顺磁氧化铁和P1代间充质干细胞共同孵育培养24h，普鲁士蓝染色评价标记效率，台盼蓝染色检验标记后细胞的活性。结果全血贴壁法培养的大鼠间充质干细胞贴壁，呈纤维细胞样生长，CD44阳性细胞比率为96％，不表达CD34。经超顺磁氧化铁标记后，普鲁士蓝染色标记效率为90％，标记后98％的细胞保持活性。结论全血贴壁法能成功培养大鼠间充质干细胞，超顺磁氧化铁可以安全、有效地标记间充质干细胞。     

小鼠移植瘤模型对SPIO增强MRI信号变化原因的初步研究

目的建立小白鼠肝脏原位移植瘤模型,初步探讨临床上影响肝癌超顺磁性氧化铁(SP10)增强MRI信号变化的因素。资料与方法(1)对25例肝病患者行SP10增强MRI扫描的临床、影像及病理学相关资料进行分析;(2)给小白鼠注射H-22肝癌细胞建立肝脏原位移植瘤模型40只;(3)成瘤后给小鼠进行MRI平扫及SP10增强扫描;(4)所有的瘤鼠做HE及普鲁士蓝铁染色并进行相关病理学分析。结果(1)25例患者中经病理证实为原发性肝癌2例、海绵状血管瘤1例及肝硬化结节1例,DSA及介入治疗有典型肝癌表现者2例。(2)肝脏移植瘤组在SP10增强后的T2WI上有10个移植瘤的信号未见下降;普鲁士蓝铁染色3只瘤鼠的瘤灶呈阳性,内见枯否细胞;7个瘤灶与肝组织明显呈浸润生长。结论SP10能提高肝脏占位性病变定性诊断率,但存在SP10增强MRI信号变化与病理机制不相符的现象;在少数纯瘤株移植瘤结节内及周边可见枯否细胞,成为影响肝癌的SP10增强MRI信号变化的重要原因;移植瘤的生长方式成为影响肿瘤的SP10增强后信号变化的相关因素。     

磁性标记的小胶质细胞在大鼠脑内的MR示踪

目的 探讨超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记的小胶质细胞在正常大鼠及阿尔茨海默病(AD)大鼠体内移植后,MR活体示踪的可行性.方法 以日本血液凝集病毒包膜(HVJ-E)为标记载体,将SPIO标记的小胶质细胞经颈内动脉注入正常大鼠(5只)及AD大鼠动物模型(5只)体内,3 d后应用7.0 T MR行T2*序列扫描,并与脑组织切片组织化学染色结果对照.结果 在正常大鼠脑内,MRI可见数个点状的信号改变区,这些信号改变区散在地分布在脑内各处,脑组织切片显示铁颗粒标记细胞位置与信号改变部位一致.MRI能够检测到由数个标记细胞引起的信号强度的改变.在AD大鼠模型脑内,MRI可见β-淀粉样蛋白42(Aβ42)注射区信号强度明显下降,信号改变区面积较大.与之相比,生理盐水注射区信号改变的强度及面积均不如Aβ42注射区改变明显.Aβ42注射区的标记细胞数为(454±47)个/mm2,明显高于生理盐水注射区的标记细胞数(83±13)个/mm2(P<0.05).结论 MRI可作为一种非侵入性检测手段在活的动物体内追踪标记细胞,在AD细胞水平的治疗中具有一定临床应用前景.     

新型超顺磁性氧化铁标记SD大鼠脂肪干细胞的有效性及安全性研究

目的：采用新型超顺磁性氧化铁对 SD 大鼠来源的脂肪干细胞（ADSCs）进行标记,并与既往商用 SPIO 标记效果进行对比,探讨这种新型超顺磁性氧化铁标记的有效性及安全性。方法：分离、纯化、鉴定 SD 大鼠来源的 ADSCs,然后分不同浓度组（0、6、12、25、50和100μg／mL）和时间组（6、12、24和48 h）进行标记,通过普鲁士蓝染色测定铁标记率;在不影响细胞形态的前提下,对达到95％以上铁染色率的孵育浓度、时间进行标记安全性检测,包括活力、增殖力、细胞表面抗原表达;采用透射电子显微镜观察标记细胞的超微结构,采用 ICP-AES 对标记细胞内的铁含量进行测定,并与商用SPIO 标记效果进行对比。结果：在无细胞毒性的前提下,新型 SPIO 达到95％以上铁染色率的孵育浓度是12和25μg／mL,孵育时间是12 h;ICP-AES 检测显示具有表面正电荷的聚乙二醇（PEG）／聚乙烯亚胺（PEI）修饰的 SPIO 标记后细胞内的铁含量达到35．4 pg／cell（25μg／mL 中孵育12h 后）和20．16 pg／cell（12μg／mL 中孵育12h 后）,并随着孵育浓度的增加,细胞内的铁含量增加;而具有表面零电荷的 PEG／聚乙烯吡咯烷酮（PVP）修饰的 SPIO 标记后的铁含量仅为6．96 pg／cell（25μg／mL 中孵育12h 后）;透射电子显微镜显示标记后细胞器结构完整,内吸收的 SPIO 主要位于细胞质内的囊泡和溶酶体中。结论：新型 SPIO 在适当孵育浓度和时间下可以安全、快速标记 ADSCs;PEG／PEI 修饰的 SPIO 标记效果要远远比既往商用的 SPIO 快速有效,可作为一种优势的新型磁性标记物用于干细胞标记;而 PEG／PVP 修饰的SPIO 比起既往商用的 SPIO 并无明显优势,说明表面电荷在细胞标记中占有极其重要的角色。     

Magnetic resonance imaging detects differences in migration between primary and immortalized neural stem cells

RATIONALE AND OBJECTIVES: The study was performed to evaluate the effect of magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent (super paramagnetic iron oxide [SPIO]) on differentiation and migration of primary murine neural stem cells (NSCs) in comparison to a neural stem cell line (C17.2). Because detection of labeled cells depends on the concentration of SPIO particles per imaging voxel, the study was performed at various concentrations of SPIO particles to determine the concentration that could be used for in vivo detection of small clusters of grafted cells. MATERIALS AND METHODS: Murine primary NSCs or C17.2 cells were labeled with different concentrations of SPIO particles (0, 25, 100, and 250 mug Fe/mL) and in vitro assays were performed to assess cell differentiation. In vivo MRI was performed 7 weeks after neonatal transplantation of labeled cells to evaluate the difference in migration capability of the two cell populations. RESULTS: Both the primary NSCs and the C17.2 cells differentiated to similar number of neurons (Map2ab-positive cells). Similar patterns of engraftment of C17.2 cells were seen in transplanted mice regardless of the SPIO concentration used. In vivo MRI detection of grafted primary and C17.2 cells was only possible when cells were incubated with 100 mug/mL or higher concentration of SPIO. Extensive migration of C17.2 cells throughout the brain was observed, whereas the migration of the primary NSCs was more restricted. CONCLUSIONS: Engraftment of primary NSCs can be detected noninvasively by in vivo MRI, and the presence of SPIO particles do not affect the viability, differentiation, or engraftment pattern of the donor cells.     

Cell motility of neural stem cells is reduced after SPIO‐labeling,which is mitigated after exocytosis

MRI is used for tracking of superparamagnetic iron oxide (SPIO)‐labeled neural stem cells. Studies have shown that long‐term MR tracking of rapidly dividing cells underestimates their migration distance. Time‐lapse microscopy of random cellular motility and cell division was performed to evaluate the effects of SPIO‐labeling on neural stem cell migration. Labeled cells divided symmetrically and exhibited no changes in cell viability, proliferation, or apoptosis. However, SPIO‐labeling resulted in decreased motility of neural stem cells as compared with unlabeled controls. When SPIO‐labeled neural stem cells and human induced pluripotent stem cells were transplanted into mouse brain, rapid exocytosis of SPIO by live cells was observed as early as 48 h postengraftment, with SPIO‐depleted cells showing the farthest migration distance. As label dilution is negligible at this early time point, we conclude that MRI underestimation of cell migration can also occur as a result of reduced cell motility, which appears to be mitigated following SPIO exocytosis. Magn Reson Med, 2013. © 2012 Wiley Periodicals, Inc.     

不同浓度菲立磁对大鼠间充质干细胞标记效率和细胞活力的影响

目的探讨不同浓度菲立磁标记大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的磁标记效率及对细胞生长活力的影响，寻找最佳标记浓度。材料与方法菲立磁与多聚左旋赖氨酸（PLL）混合制备菲立磁-PLL复合物。将不同浓度的菲立磁-PLL复合物与培养基混合（铁的终浓度分别为150μg／ml、100μg／ml、50μg／ml、25μg／ml、10μg／ml和5μg／ml），加入MSCs孵育过夜。分别于标记后1天、1周、2周、3周、4周行铁染色、铁含量测定及细胞活力检测。结果菲立磁-PLL标记组细胞铁含量显著高于单纯菲立磁标记组（P＜0．05），25μg／ml浓度组细胞铁含量显著高于10μg／ml及其以下浓度组（P＜0．05），但与50μg／ml及其以上浓度组差异无统计学意义（P＞0．05）。台盼蓝排除试验显示，100μg／ml及其以下浓度组细胞活力与对照组之间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论以25μg/ml铁浓度标记干细胞不仅标记效率高，而且对细胞活力无明显影响．为菲立磁标记MSCs的最佳浓度。     

In vivo molecular MRI of cell survival and teratoma formation following embryonic stem cell transplantation into the injured murine myocardium

Embryonic stem cells (ESCs) have shown the potential to restore cardiac function after myocardial injury. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIO) have been widely employed to label ESCs for cellular MRI. However, nonspecific intracellular accumulation of SPIO limits long‐term in vivo assessment of the transplanted cells. To overcome this limitation, a novel reporter gene (RG) has been developed to express antigens on the ESC surface. By employing SPIO‐conjugated monoclonal antibody against these antigens (SPIO‐MAb), the viability of transplanted ESCs can be detected in vivo. This study aims to develop a new molecular MRI method to assess in vivo ESC viability, proliferation, and teratoma formation. The RG is designed to express 2 antigens (hemagglutinin A and myc) and luciferase on the ESC surface. The two antigens serve as the molecular targets for SPIO‐MAb. The human and mouse ESCs were transduced with the RG (ESC‐RGs) and transplanted into the peri‐infarct area using the murine myocardial injury model. In vivo MRI was performed following serial intravenous administration of SPIO‐MAb. Significant hypointense signal was generated from the viable and proliferating ESCs and subsequent teratoma. This novel molecular MRI technique enabled in vivo detection of early ESC‐derived teratoma formation in the injured murine myocardium. Magn Reson Med, 2011. © 2011 Wiley Periodicals, Inc.