C-Jun蛋白对糖皮质激素受体表达及转录激活能力的影响

目的观察促进与抑制c-Jun蛋白表达对糖皮质激素受体(GR)表达和转录激活能力的影响,探索c-Jun与GR功能的相互关系.方法采用基因重组技术,构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒,电穿孔法分别转染U937细胞c-Jun蛋白表达真核载体与PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒,观察c-Jun表达对GR表达和转录激活能力的影响.结果成功构建PAVU6-c JunsiRNA干涉质粒,转化U937细胞后GR的表达和转录激活活性有增强,而转染c-Jun表达载体pCMV-c JunGR的表达和转录激活活性有所减弱.结论c-Jun蛋白表达水平对GR的表达和转录激活活性有影响,抑制c-Jun蛋白表达,一定程度上可促进GR表达并增强其转录激活功能.     

C-Jun蛋白对糖皮质激素受体表达及转录激活能力的影响

目的观察促进与抑制c-Jun蛋白表达对糖皮质激素受体(GR)表达和转录激活能力的影响，探索c-Jun与GR功能的相互关系。方法采用基因重组技术，构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，电穿孔法分别转染U937细胞c-Jun蛋白表达真核载体与：PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，观察c-Jun表达对GR表达和转录激活能力的影响。结果成功构建PAVU6-c Jun siRNA干涉质粒，转化U937细胞后GR的表达和转录激活活性有增强，而转染c-Jun表达载体pCMV-c JunGR的表达和转录激活活性有所减弱。结论c-Jun蛋白表达水平对GR的表达和转录激活活性有影响，抑制c-Jun蛋白表达，一定程度上可促进GR表达并增强其转录激活功能。     

SiRNA沉默JAB1表达抑制肝癌细胞增殖

 目的 观察沉默Jab1基因表达对人肝癌细胞HepG-2增殖的影响。方法 利用RNA干扰技术构建PAVU6-JAB1 siRNA干扰质粒,将其转染HepG-2细胞,采用Real-time PCR、Western blot等方法对Jab1表达进行检测,WST-8、流式细胞分析对细胞增殖的影响。结果 成功构建PAVU6- JAB1 siRNA干扰质粒,转染HepG-2细胞后Jab1蛋白表达量较对照组明显降低,P27kip1蛋白表达量明显升高 (P<0.01)。转染96 h后能显著抑制细胞增殖活性,由空载体转染组的99.6%?1.4%降至70.8%?1.6%。结论 构建靶向Jab1基因的干扰质粒能下调Jab1基因的表达,上调P27kip1蛋白水平,并抑制HepG-2细胞在体外的增殖活性。     

PAVU6-cJun siRNA干涉质粒的构建及对糖皮质激素受体表达与转录激活能力的影响

采用RNA干涉(RNAinterference,RNAi)技术将合成的两段有回文结构的c-Jun互补cDNA序列插入PAVU6siRNA表达载体,构建PAVU6-cJunsiRNA干涉质粒,电转化U937细胞,观察沉默c-Jun的基因表达对GR蛋白表达和转录激活能力的影响,探讨c-Jun与GR功能的相互关系。PAVU6-cJunsiRNA转化U937细胞后GR的表达和转录激活活性均有所增强。提示抑制U937细胞c-Jun蛋白表达,在一定程度上可促进GR表达及增强其转录激活功能。     

Ad-siRNA-FoxO1腺病毒载体的构建及对人肝癌细胞系增殖的影响

目的 利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制肝癌细胞系中FoxO1基因的表达,观察其受抑制后对细胞增殖能力的影响.方法 设计针对FoxO1基因的siRNA,构建于腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染包装细胞293细胞,获得含Ad-siRNA-FoxO1的重组腺病毒.体外感染人肝癌细胞系HepG2,Western印迹检测Ad-siRNA-FoxO1对FoxO1蛋白的抑制效率.与PEPCK.luc共转染HepG2细胞,检测FoxO1表达水平对PEPCK启动子活性的影响,并观察FoxO1表达水平的改变对肝癌细胞系增殖的影响.结果 成功构建3个针对FoxO1的siR-NA重组腺病毒载体,重组腺病毒均能显著抑制HepG2细胞中FoxO1蛋白的表达,并抑制PEPCK启动子的活性和显著促进细胞增殖.结论 肝癌细胞系中FoxO1参与了细胞增殖的调节.     

RNA干扰EP—CAM基因表达对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：利用RNA干扰技术抑制人胆囊癌GBC-SD细胞中上皮细胞黏附分子（EP-CAM）基因的表达,探讨抑制EP-CAM基因后对GBC-SD细胞增殖、凋亡的影响.方法：构建靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒,转染GBC-SD细胞,用RT-PCR和Western Blot分别检测EP-CAM基因的mRNA及蛋白的表达情况,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果：靶向EP-CAM的miRNA重组质粒pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1构建成功,重组质粒能显著抑制靶基因EP-CAM的mRNA及蛋白表达.与对照组比较,干扰后的细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05）,但细胞增殖活性受到明显抑制（P＜0.05）.结论：靶向EP-CAM基因的miRNA重组质粒能有效抑制EP-CAM基因的表达,抑制GBC-SD细胞的增殖.     

HPV18 E6 siRNA对宫颈癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响

目的探讨HPV18 E6siRNA联合紫杉醇应用对宫颈癌细胞生长的影响。方法用RNAi抑制HeLa细胞中HPV18 E6蛋白的表达。Western blot检测E6、P53和P21的蛋白表达量,MTT法检测细胞的增殖活性及细胞对紫杉醇的敏感性。结果抑制HPV18 E6的表达后,P53和P21的表达量均显著升高,HeLa细胞的生长受到抑制(P<0.01)。加入紫杉醇后,细胞增殖速度较对照组明显降低(P<0.01)。结论HPV18 E6siRNA可有效沉默HeLa细胞中E6基因的表达,抑制细胞增殖,并提高细胞对化疗药物的敏感性。     

腺病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2的下调及生长抑制效应

目的:探讨采用腺病毒做为载体介导基于RNA干涉的针对高HER2肿瘤的基因治疗的可能性。方法:构建HER2-绿色荧光蛋白融合蛋白表达质粒pHER2-GFP,并与9种针对HER2不同靶序列的siRNA表达质粒分别共转染CHO-K1细胞,根据荧光蛋白表达量从中筛选出沉默效率最高的质粒。将筛选出的质粒转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞,检测它们对HER2表达的影响。随后,将siRNA转录单元克隆入腺病毒载体,成功包装病毒后感染SKBR3细胞,再次测定其下调HER2的效应及其对细胞生长的影响。结果:2种有效下调HER2表达的质粒被筛选出来。将此2种质粒所含siRNA转录单元包装入腺病毒后仍然保持了原有的基因沉默效应。HER2下调增加了SKBR3细胞中G1期细胞的比例,并且诱导部分细胞凋亡。MTT和细胞长期增殖抑制实验表明腺病毒介导的RNA干涉抑制了SKBR3细胞生长。结论:重组腺病毒介导的RNA干涉能够下调HER2的表达并且对高表达HER2的乳腺癌细胞有生长抑制作用。     

Gαs在肝癌中的表达情况及其高表达对肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨Gαs过表达对人类肝癌细胞HepG2生长、增殖的影响,及Gαs在人类肝癌中的表达情况,寻求有效的治疗靶点.方法:利用QpCR技术检测人类肝癌组织中Gαs基因水平的表达情况;利用Western blot检测人肝癌细胞HepG2及正常肝细胞HL-7702中Gαs蛋白水平的表达;利用脂质体法将Gαs质粒转染HepG2细胞;用MTT检测HepG2细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化.结果:QPCR 结果显示在基因肝癌组织中Gαs表达高于癌旁组织;Western blot结果显示肝癌细胞中Gαs在蛋白水平表达高于肝正常细胞;Gαs质粒转染HepG2细胞后,Gαs表达增高,细胞增殖加快.结论:Gαs基因表达水平在肝癌组织中高于周围癌旁组织;Gαs的高表达可能与肝癌的发生发展相关联,其高表达促进HepG2细胞的生长与增殖.     

FAK基因表达对人结直肠癌细胞增殖及运动的影响

目的:探讨黏着斑激酶(FAK)表达水平对结直肠癌细胞增殖及运动的影响.方法:针对FAK基因不同靶点设计siRNA序列, 构建siRNA重组子, 转染Caco-2细胞, 以RT-PCR和免疫细胞化学方法检测FAK mRNA和蛋白表达变化及时间效应, 同时检测FAK基因敲低对Caco-2细胞的凋亡、增殖及迁移的影响.结果:FAK siRNA导入Caco-2细胞后, FAK mRNA和蛋白表达水平明显下调, 细胞增殖及迁移能力受抑, 呈时间依赖关系, FAK mRNA水平下调在转染后48 h达到最大.结论:FAK siRNA可有效抑制靶基因表达, FAK表达水平下调后Caco-2细胞的增殖及运动明显受抑制.     

TWEAK反义寡核苷酸对人结肠癌细胞系SW480增殖及侵袭能力的影响

目的观察肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)对人结肠癌细胞系SW480增殖及侵袭能力的影响。方法合成TWEAK反义寡核苷酸(ASODN)、错义寡核苷酸(SCODN)后转染人结肠癌细胞系SW480,将细胞分为空白对照组、脂质体(LF)对照组、ASODN组、SCODN组;采用MTT法检测肿瘤细胞增殖抑制情况,流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞周期分布,ELISA法检测细胞培养液上清中可溶性TWEAK及其受体成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(Fn14)的表达,Western blotting法、免疫荧光细胞化学法(IF)检测细胞中的TWEAK及Fn14蛋白的表达,运用Transwell侵袭实验观测结肠癌细胞侵袭能力的变化。结果空白对照组、LF对照组、SCODN组之间结肠癌细胞的增殖情况无明显差异(P0.05),与对照组相比ASODN组肿瘤细胞增殖受到明显抑制(P0.05),且呈剂量-时间依赖关系;转染TWEAK ASODN后,G2+M期细胞比例明显高于对照组(P0.05),TWEAK及其受体Fn14在结肠癌细胞培养液及细胞内的表达均低于对照组,差异均有统计学意义(P0.05);转染TWEAK ASODN后肿瘤细胞侵袭抑制率为31.39%,明显高于对照组(P0.05);TWEAK及其受体Fn14在结肠癌细胞培养液及细胞内的表达均密切相关(P0.05)。结论 TWEAK ASODN可能通过抑制TWEAK与其受体Fn14结合干扰肿瘤的发生发展,抑制TWEAK表达能抑制人结肠癌细胞系SW480的增殖与侵袭。     

HBV转染对TWEAK诱导凋亡的影响及IFN-γ对凋亡的调节

目的： 探讨新型凋亡分子TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)对乙型肝炎病毒 (HBV)转染的人肝癌细胞系的凋亡诱导作用及γ-干扰素 (IFN-γ)对该凋亡过程的影响。方法: 以稳定转染了pCDNA3/1.1HBV的肝癌细胞系BEL-7402-pCDNA3/1.1HBV为模型,并以稳定转染空载体的肝癌细胞BEL-7402/pcDNA3作为对照,经CCK-8法检测HBV转染前后TWEAK对细胞生长的抑制效应,terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性检测试剂盒检测HBV转染前后TWEAK诱导肝癌细胞的凋亡情况及IFN-γ对TWEAK诱导细胞凋亡的调节作用。结果: HBV转染促进TWEAK诱导的细胞凋亡, IFN-γ可以增强HBV转染细胞对TWEAK诱导凋亡的敏感性。结论: 机体感染HBV后,TWEAK可能参与HBV感染肝细胞的清除过程;IFN-γ在调节TWEAK诱导的病毒感染细胞凋亡中发挥重要作用。     

Primary cultured cells and an established cell line of human hepatocellular carcinomas

Cancer cells obtained from human hepatocellular carcinoma nodules were subjected to primary culture, and a hepatoma cell line was established. The cell clumps obtained by needle puncture were plated directly in plastic tissue culture flasks without any cell dissociation procedures. Cell clusters became attached to flasks in 24 h with an efficiency of about 90%. No fibroblast outgrowth was observed. Primary cultured cells were composed of polygonally shaped epithelial cells with dense cytoplasm and one or more large nuclei. They excreted plasma protein biosynthetic markers of hepatocytes into the culture medium. Plasma protein synthesis of primary cultured hepatoma cells decreased as the age of the primary cultures increased. Cells seeded in September 1980 started to grow continuously after 5 months of cultivation. A new hepatocellular carcinoma cell line (designated as KG55T) was established from these growing cells. KG55T cells have been subcultured for more than 20 passages and form a monolayer of polygonal epithelial cells which pile up after they reach confluence. The cells had a doubling time of 50-60 h and a plating efficiency of 60-65%. Albumin, alpha 1-antitrypsin and alpha 2-macroglobulin syntheses and tyrosine aminotransferase activity were detected. At the 10th passage, KG55T cells were pseudotriploid (mode, 69), and 8q+ and 15q+ translocations were distinctive of this cell line. The morphological characteristics and the capacity for plasma protein synthesis of the primary cultured hepatoma cells and cells of the established hepatoma cell line were compared.     

RNA干扰技术沉默CDC25a基因对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

 目的:研究细胞分裂周期素25a（cell division cycle 25a,CDC25a）基因沉默后对于人肝癌细胞系HepG2增殖的影响。同时探讨该影响发生的可能作用机制。 方法: 使用RNA干扰技术沉默人肝癌HepG2细胞的CDC25a基因,采用实时荧光定量PCR技术检测肝癌细胞中的CDC25a 及其作用基因cyclin E及CDK2的 mRNA表达水平,Western blotting检测CDC25a的蛋白表达水平,并采用MTT法、Giemsa染色法及流式细胞技术检测细胞的增殖情况。 结果: CDC25a 的mRNA及蛋白表达水平在RNA沉默组细胞中的表达低于阴性对照组及正常对照组细胞（P＜0.05）。Cyclin E及CDK2 的mRNA表达水平在沉默组低于阴性对照及正常对照组（P＜0.05）。MTT法、Giemsa染色法结果显示沉默组细胞增殖能力低于阴性对照组及正常对照组细胞（P＜0.05）,流式细胞技术结果显示沉默组细胞阻滞在G1期。 结论: LV-CDC25a-RNAi重组体感染HepG2细胞可以有效抑制CDC25a基因的表达,使人肝癌HepG2细胞增殖受到抑制,提示CDC25a基因可能是肝癌治疗的关键靶点。     

利用基因敲入技术在肝癌细胞系中稳定表达HBV的X抗原

目的利用基因诱捕载体整合到人类肝癌细胞系SMMC7721细胞的染色体基因中,建立稳定表达HBx蛋白的细胞系。方法通过电击转染将基因诱捕载体pU17导入人类肝癌细胞系SMMC7721细胞,经G418筛选,报告基因X-gal染色,PCR,Western印迹等方法检测HBxDNA的存在和蛋白质的表达。结果得到永久性高表达诱捕载体报告基因X-gal的阳性克隆;用Cre-LoxP置换系统,将构建好的HBx全长片段与诱捕载体的报告基因部分交换,HBx全长片段完整地整合在SMMC7721细胞的染色体基因中,并能从该细胞系中检测到HBx抗原。结论本实验提供了一种新的稳定表达蛋白的方法。该细胞系为制备、纯化X抗原和研究X基因调控提供了实验材料。     

靶向泛素连接酶SIAH2的shRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响

 目的：探讨shRNA介导的泛素连接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)基因表达抑制对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响。方法：用已构建的pGenesil-SIAH2重组质粒转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察转染效率。采用RT-PCR和Western blotting 技术检测重组质粒对SIAH2 mRNA和蛋白表达的影响,MTS比色法测定重组质粒转染对细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后细胞周期和凋亡的变化。结果：与对照组相比,pGenesil-SIAH2能显著抑制SIAH2 mRNA和蛋白的表达水平;pGenesil-SIAH2转染组细胞增殖速度明显减慢;pGenesil-SIAH2组细胞明显阻滞于G1期,细胞凋亡率明显升高。结论: pGenesil-SIAH2能有效抑制HepG2增殖,使细胞周期阻滞在G1期,并诱导其早期凋亡。上述研究为以SIAH2为靶点的肝癌基因治疗提供实验依据。     

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响

 目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法:将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2,real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较,转染NANOG-siRNA后,肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下调(P＜0.05),细胞增殖能力下降(P＜0.05),进入G 0/G 1期的细胞比例增多(P＜0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降,导致细胞增殖能力下降。     

PAR-2激动剂对肝癌细胞增殖及Ca2+水平的影响

目的： 研究PAR-2激动剂对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞内Ca2+浓度（［Ca2+］c）的影响。方法: 培养人肝癌细胞HepG2, 分别利用PAR-2激动剂SLIGKV-NH2及反PAR-2激动肽VKGILS-NH2干预肝癌细胞生长,用Fura-2荧光法测定肝癌细胞内［Ca2+］c,用MTT法检测对肝癌细胞增殖能力的影响,流式细胞术（FCM）检测细胞周期改变情况,RT-PCR法检测cyclinD1 mRNA表达变化。结果: 50 μmol/L SLIGKV-NH2刺激HepG2细胞后,［Ca2+］c迅速短暂升高（P<0.01）;G0/G1期比例明显降低,S期和G2/M期细胞比例和细胞增殖指数(PI)明显提高（P<0.01）;cyclinD1 mRNA的表达显著增加（P<0.01）。SLIGKV-NH2在1-50 μmol/L时可以促进HepG2细胞增殖,呈剂量依赖性（P<0.01或P<0.05）。而VKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著（P>0.05）。结论: PAR-2激动剂在体外能通过激活PAR-2,诱导HepG2细胞内［Ca2+］c升高,上调cyclinD1 mRNA的表达,加速HepG2细胞周期进程,促进DNA合成,促进肝癌细胞增殖。     

人剪切修复基因XPD肝癌对人HepG2细胞中Rb和MAD2表达的影响*

 目的：探讨人剪切修复基因着色性干皮病D组基因（xeroderma pigmentosum group D, XPD)转染人肝癌HepG2细胞后视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)和有丝分裂阻滞缺陷蛋白 2（mitotic arrest deficient 2, MAD2）表达的变化及对细胞增殖的影响。方法：将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞。实验分为4组,分别为无转染HepG2细胞组（空白对照组）、脂质体转染HepG2细胞组（脂质体组）、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组（N2 组）和重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组（XPD组）。分别用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中XPD、Rb及MAD2 mRNA和蛋白的表达量,用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。结果：与其它3组相比,XPD组XPD mRNA及蛋白表达量明显升高（P<0.05）,Rb mRNA及蛋白表达量明显升高（P<0.05）,而MAD2 mRNA及蛋白表达量显著降低（P<0.05）。XPD组细胞增殖活力显著降低,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。XPD组细胞停滞在G1期,难以进入S期。结论：XPD可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖,促进Rb的表达。