原位RT-PCR法测定SARS患者肺组织中的病毒核酸

【摘要】目的观察严重急性呼吸综合征(SARS)患者肺组织中SARS病毒核酸的定位和分布。方法采用原位逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术对3例SARS死亡患者肺组织进行病毒核酸测定。以固定在载玻片上的肺组织为靶细胞，直接掺入地高辛素一dN31P标记物进行PCR扩增，并观察病毒核酸阳性物质。结果检测3例尸解肺组织，其中2例可见SARS病毒核酸阳性信号。阳性物质表现为蓝紫色颗粒状物，分布于细胞核或细胞浆内。在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及单个核细胞中均可观察到该病毒核酸物质。肺组织病理改变明显，表现为出血、渗出，炎性浸润等改变。结论在肺组织中检出SARS病毒核酸物质，并与病理改变并存，为本病的病原学诊断提供直接证据。【关键词】严重急性呼吸综合征；SARS病毒；原位逆转录一聚合酶链反应；肺组织     

广州地区住院患儿血清抗SARS病毒抗体的检测

非典型肺炎即重症急性呼吸道综合征(SARS)曾蔓延到30多个国家和地区，造成感染患者达7000多例，死亡500多人，某些地区病死率高达15％。但感染人群中儿童很少被感染，此现象是否与儿童体内存在抗SARS病毒的抗体有关?特此，我们检测了广州市儿童医院住院的1066例患儿血清抗SARS病毒的抗体，现报告如下。     

抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的 制备抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体并研究其初步应用。方法 用基因重组N蛋白免疫小鼠，取免疫后的鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选分泌抗SAPS病毒N蛋白单克隆抗体细胞株。将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对抗体进行纯化，分析纯化抗体的相对亲和力。选择亲和力较高的抗体制备检测SARS病毒抗原的酶联免疫诊断试剂，并对其敏感性和特异性进行分析。结果 共获得11株单克隆抗体细胞株，其中3株单抗与N蛋白具有较高的亲和力，4株纯化单抗与N蛋白反应很弱，其余4株单抗介于两者之间。用亲和力较高的单抗制备检测SARS病毒抗原的诊断试剂，其敏感性可达31PFU／ml，而且与其他呼吸道病毒无交叉反应。结论 该试剂特异性较好，可用于SARS病毒抗原的检测，其敏感性仍需用临床急性期样品进行评价。     

从SARS患者肺部病变的病理特点探讨SARS的损伤机理

目的 根据严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)患者肺部病变的病理特点探讨SARS的损伤机理。方法 在3500例尸体解剖材料中，找出死亡时有肺部炎症的共842例。对其中病毒性肺炎16例、Good-Pasture综合征2例、自身免疫疾病2例、SARS1例，共21例进行肺部病变的病理组织学的比较观察。结果 病毒性肺炎的肺部病变主要的病理变化表现为间质性肺炎；自身免疫性疾病病人的肺部病理变化有肺泡表面透明膜形成，肺泡腔内脱落的细胞团，肺泡腔内机化等；SARS病人尸体解剖的肺部病变主要为肺泡腔内细颗粒样或泡状肺水肿，脱屑性肺炎以及机化性肺炎的表现。同时，肺间质内的小动脉出现明显的结构改变，形态学上与自身免疫性疾病的肺损伤相似。结论 机体的变态反应可能是SARS的损伤机理之一。     

SARS病毒S1蛋白的克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定

目的：研究SARS病毒感染后机体产生保护性免疫应答的规律和可能机制。方法：通过生物信息学分析，在原核表达系统中表达了SARS病毒S1蛋白。利用SARS流行前正常人血清和6份SARS患者恢复期的血清，对纯化的重组S1蛋白进行血清学分析。结果：研究中克隆表达的重组蛋白序列与公布的SARS病毒S1蛋白的序列相同。6份SARS患者恢复期的血清均能识别重组S1蛋白，而6份SABS流行前的正常人血清则不能与重组蛋白反应。结论：获得的重组S1蛋白具有与天然SARS病毒s1蛋白相同的序列，并具有与之相似的血清学反应性，为研究SARS病毒感染免疫应答的过程及其机制和制备SARS病毒的重组疫苗提供了良好的物质基础。     

SARS冠状病毒N蛋白基因的表达及其在SARS诊断中的应用

目的 获得重组SARS冠状病毒（SARS-CoV）N蛋白抗原，建立特异性诊断SAILS病毒感染的免疫学方法。方法 大肠埃希菌中表达SARS病毒N蛋白基因，用金属螯合层析纯化N蛋白，建立检测SARS抗体的EUSA方法。结果 大肠埃希菌中表达了SARS病毒全长N蛋白抗原，经包涵体洗涤和金属螯和纯化后得到纯度较高的重组蛋白。用重组抗原EUSA检测30名SARS患者抗体全部为阳性，30名正常人血清为阴性，30名发热非SARS患者血清为阴性。结论 SARS表达核蛋白可以在大肠埃希菌中得到高效表达，纯化的重组N蛋白具有良好抗原性，可用于检测SARS抗体。     

SARS病毒Spike蛋白具有中和活性的抗原表位预测和初步鉴定

目的：预测并合成SARS病毒Spike蛋白中具有中和活性的抗原表位，鉴定其在免疫检测和疫苗设计中的作用。方法：使用二级结构以及基因组对比预测方法，预测Spike蛋白中具有较高抗原活性的肽段序列并人工合成。用直接ELISA法检测在SARS确诊阳性患者血清和健康人血清之间相应抗体的检出差别，确定预测肽段是否为SARS的抗原肽段。结果：预测并人工合成了具有抗原活性的GEVFNATKF-PSVYAW多肽，在ELISA检测中，可检测出SARS阳性血清中的针对性抗体，阳性符合率为71．4％，在健康人血清中不能检测出对应的抗体，阴性符合率为92％。结论：预测并合成了具有SARS病毒Spike蛋白的中和表位抗原，其特异性高于全病毒抗原，为SARS的诊断及疫苗的设计奠定了基础。     

感染细胞中SARS相关病毒的形态学观察

目的 用电子显微镜观察严重急性呼吸综合征(SARS)患者标本感染细胞,为SARS病原体的分离鉴定提供形态学资料。方法 以北京和广州地区SARS病例尸检肺组织和鼻咽拭子标本感染Vero E6细胞,通过对培养上清液和病变细胞超薄切片观察,了解病毒的大小、形态、在感染细胞中的分布和装配情况,初步判定病毒的分类。结果 在3价标本感染的细胞培养液和病变细胞中均查见病毒,病毒颗粒多呈圆形或椭圆形,大小80～120nm,外周有冠状排列的纤突。在广州肺组织标本感染的细胞中还查见大量的短杆状和少量肾形、不规则形的病毒颗粒,大小100～200nm×60～90nm,其他标本感染细胞中这种形态的病毒颗粒较少见。切片中见病毒主要分布在细胞质的内质网池、高尔基体、空泡、包涵体内和细胞外,呈空心和实心两种形式。包涵体内病毒颗粒排列紧密,其大小、形态不一。病毒以胞饮或膜融合形式进入细胞,以出芽方式增殖。结论 电镜查见SARS病例标本中分离出典型的圆形或椭圆形的冠状病毒,与文献报道的SARS相关新型冠状病毒相符。同时我们也发现了另一种以短杆状为主,偶见梨形、肾形、多形性的病毒颗粒,它们在SARS研究中的意义有待进一步探讨。     

荔枝核黄酮类化合物体外抗腺病毒作用初探

<正>目的:腺病毒(AdV)是人类呼吸道和消化道疾病的病原体,能引起急性咽炎、婴幼儿致死性肺炎、流行性结膜炎、膀胱炎、肠炎等组织炎症以及扁桃体、腺体和淋巴组织的隐性或持续性感染。荔枝核黄酮类化合物(FLC)来源于无患子科植物荔枝(Litchi Chinensis Sonn)的成熟种子,除具有降血糖、调血脂和抗氧化作用等多种功效外,还具有抗病毒作用,已有文献报道其具有体外抗乙型肝炎病毒(HBV)、流感病毒(IFV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS病毒、单纯疱疹病毒(HSV)等多种病毒作用,但未见有对腺病毒作用的研究,为此作者进行了FLC体外抗腺病毒的研究。     

多重实时PCR检测三种呼吸道病毒

目的建立多重实时PCR检测体系可同时快速检测引起人呼吸道感染的甲型流感病毒（IAV）、呼吸道合胞病毒（RSV）和SARS冠状病毒（SARS-CoV）。方法通过对PCR反应条件的优化，建立了同时检测IAV、RSV和SARS-CoV的多重实时PCR方法。结果经熔解曲线分析，证实了该法可同时或分别检测3种重要呼吸道病毒。检测灵敏度分别为10^0.7 TCID50／ml、1 TCID50／ml和10^-0.5 TCID50／ml。采用相同的反应体系和条件，分别对其他7种呼吸道病毒（包括乙型流感病毒，副流感病毒2型，柯萨奇病毒B3和B5血清型及腺病毒2、3和7血清型）进行扩增，均未检测出扩增产物。此种方法可在4h内完成。结论建立的多重实时PCR检测方法适用于3种重要呼吸道病毒的快速检测。     

SARS病人尿液中是否存在PCR抑制因子的探讨

SARS为全身感染多脏器受累的疾病 ,尿中排毒应为较普遍现象。SARS肆虐期间 ,用PCR方法从SARS病人尿液中检测到SARS病毒核酸的报道虽相继出现 ,但检出率低的原因一直没有明确的解释。有些学者提出了尿中存在PCR抑制因子从而影响了该病毒检出率的观点 ,为证实SARS患者尿液中是否存在影响SARS病毒检测的PCR抑制因子 ,进行了以下试验。2 0 0 3年 5月 ,从北京市SARS定点医院采集临床确诊的病人尿标本 119份 ,用荧光PCR法检测尿中SARS病毒核酸后从中选出 18份SARS病毒阴性尿标本(这 18份标本来自发病 8～ 2 0d的 18例临床确诊…     

严重急性呼吸道综合征(SARS)病人血清中SARS相关抗体的发现和分析

由SARS病毒感染所致的严重急性呼吸道综合征 (SARS) ,今年在全球爆发流行〔1 3〕。在SARS的发病过程中 ,越来越多的证据表明异常的免疫反应可能是导致SARS患者肺部免疫炎性病理损伤的主要原因。本研究在SARS患者血清中发现了一组抗肺组织相关抗体 ,其可能参与了导致肺组织损伤的免疫炎性反应。材料和方法5 5份来自 32个SARS患者的血清取自住院病人 ,SARS诊断严格按照WHO和中国卫生部颁布的SARS诊断标准。 10 5份健康献血员血清为对照。SARS肺组织取自一名SARS患者尸检。对照肺组织取自肺癌手术标本。所有的标本保存于 80…     

SARS病变组织中免疫复合物的检测

目的探讨严得急性呼吸综合征(SARS)病变组织中有无自身抗体和免疫复合物存在。方法用光镜观察SARS尸检及穿刺活检标本的病理变化和应用免疫组化，组织化学检测患者的自身抗体及免疫复合物。结果病变组织（肺，心肾、脾、淋巴结等)存在大量免疫复合物主要为IgG，C3c其次为IgA。患者血清中含有抗基膜的自身抗体。结论体液免疫在SARS发病中起重要作用；刚果红染色显示免疫复合物是实用和可行的方法之一。     

SARS冠状病毒全基因组cDNA芯片的研制以及人重组干扰素α2b抑制SARS病毒复制分子机制的初步研究

目的 在细胞水平上，利用研制的SARS病毒全基因组芯片技术探讨人重组干扰素α2b抑制SARS病毒复制的分子机制。方法 根据已经发表的SARS病毒基因组全序列和生物信息学软件分析，设计包括SABS病毒全基因组的各个可能编码区的PCR引物；将所有PCR产物用来制备SABS病毒的全基因组cDNA芯片。利用该芯片来探讨人重组干扰素α2b抑制SARS病毒复制的分子基础。结果 通过：PCR方法研制了SARS病毒全基因组的cDNA芯片，并说明cDNA芯片可以准确地检测SARS病毒各个基因的RNA水平。利用这一技术研究了于扰素抗SARS病毒的分子机制。结果表明，人重组干扰素α2b可以明显抑制SARS病毒复制过程中几乎所有病毒RNAs的转录，并呈现一定的剂量关系；并发现一个目前还没有确定功能的SARS病毒新基因，命名为U基因，转录最早，转录水平最高，对干扰素的抑制作用也很敏感；它可能在病毒的转录复制过程中发挥重要作用。结论 SARS冠状病毒cDNA芯片可以用来研究病毒复制的分子机制以及相关抗病毒药物包括干扰素的研究。本文在分子水平上研究了人于扰素α2b抑制SARS病毒复制的基因转录动态，并就干扰素α2b抑制SARS病毒的可能分子机制及其潜在的应用价值进行了讨论。     

SARS-CoV感染布氏田鼠、Lewis大鼠和恒河猴引起的病理变化

目的研究SARS-CoV感染布氏田鼠、Lewis大鼠和恒河猴后引起的病理学、免疫学变化及病毒复制与外排情况变化特点及作为动物模型的可行性。方法SARS病毒感染布氏田鼠、Lewis大鼠和恒河猴,用病毒分离和RT-PCR方法检测病毒复制与外排;用ELISA检测特异性抗体;用光学显微镜对动物的各脏器进行病理观察研究。结果在SARS-CoV感染的3种动物肺组织均出现与人类SARS疾病相似的病理改变,均可检测到病毒核酸和特异性IgG抗体的存在。结论恒河猴、Lewis大鼠和布氏田鼠感染SARS-CoV后,均能在一定程度上再现人类SARS患者的病理特征,其中恒河猴的病理改变更近似于人类患者,故以恒河猴为模型可能对研究SARS发病机制和疫苗评价更为理想。     

关于突发性烈性传染病的诊断及防治的建议

针对目前严重急性呼吸道综合征 (SARS)的流行情况 ,中华微生物学与免疫学分会于 4月 2 1召开在京部分委员和有关专家紧急扩大会议 ,主要就有关SARS诊断、预防、治疗及基础研究方面进行了讨论 ,经过大家充分认真的讨论 ,形成以下建议 :1 加强SARS早期诊断及愈后监测的研究 :初步认为SARS主要是由冠状病毒引起 ,按照—般规律 ,病毒感染以后 ,首先出现的病原学指标应是病毒核酸、病毒抗原 ,然后是病毒抗体 ,病毒IgM抗体要早于病毒IgG抗体 ,病毒抗体的出现一般在临床症状出现以后。我国科技工作者经过日夜奋战 ,最近开发研制出了检测病…     

《SARS的又一病原体——呼肠病毒》出版

本书作者自2003年3月起从几家医院送检的临床确诊为SARS患者的咽试子和尸检肺组织标本中，先后用Hep-2细胞分离得到4株呼肠病毒，并且此后的系列研究表明该病毒与SARS相关。     

多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色技术检测呼吸道病原体

目的 建立一种呼吸道病原体多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色的检测方法.方法 针对几种重要的呼吸道病原体(甲型流感病毒、乙型流感病毒、SARS冠状病毒、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌以及腺病毒)保守区基因设计引物,进行多重PCR反应、核酸侵入反应及纳米金显色反应,对多种呼吸道病原体同时进行检测,以人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、肺炎链球菌4种呼吸道病原核酸评价其检测特异性,以体外转录的病毒RNA或扩增的PCR片段评价其检测敏感性.结果 成功建立了一种呼吸道病原体多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色的检测技术.建立的检测方法可特异的检测目的病原体,且与人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、肺炎链球菌无交叉反应.该方法对不同靶标的检测灵敏度介0.5 ～50拷贝/μL.结论 建立的呼吸道病原体多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色技术的检测方法,具有较高的检测特异性及灵敏度,检测通量高,肉眼即可观察结果,在传染病病原体检测方面具有广阔的应用前景.     

Taqman荧光定量RT—PCR在呼吸道感染患者临床标本非SARS冠状病毒检测中的应用

目的建立检测四种常见人非SARS冠状病毒核酸特异的快速、敏感的TaqManqRT—PCR检测方法,应用于急性呼吸道感染患儿的感染分析。方法分别应用TaqManqRT—PCR与普通RT—PCR平行检测248份呼吸道标本,对方法的灵敏性、特异性和稳定性以及临床标本的适用性进行比较评价,阳性标本以体外转录RNA为标准品进行病毒载量定量。结果本方法可对HKU1、NL63、229E、OC43四种冠状病毒进行特异性诊断,与其他病毒无交叉反应,检测灵敏度可达10拷贝／μl,检测线性范围可达10^1～10^8拷贝／μl,248份标本中HKU1、NL63、229E、OC43阳性率依次为1．2％,0．8％,1．2％,1．6％,其中OC43荧光RT—PCR法检出率高于普通RT—PCR,其余三种病毒两种方法检测结果一致。非SARS冠状病毒阳性标本均检出于12月至次年5月。结论建立的TaqManRealtimeRT-PCR法具有特异性强、灵敏性高的特点,是开展非SARS冠状病毒的临床检测与疾病监测的有效技术手段。     

呼吸道病毒感染多重、快速检测技术

众多资料显示急性呼吸道感染中90％～95％是由病毒感染所致，其中多种病毒具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点，并且近来新的致病性病毒还在不断地被发现，如人类偏肺病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒等，给临床疾病诊断和治疗造成极大的困难。