人心肌肌钙蛋白I基因的原核表达及抗体制备

目的进行人心肌肌钙蛋白I（cardiac troponinI，cTnI）基因原核表达载体的构建，获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni—NTA树脂纯化，纯化后的融合蛋白免疫小鼠，制备抗血清。通过ELISA，Western blot鉴定血清效价和特异性。结果成功构建了cTnI的原核表达载体，并在大肠埃希菌中荻得了高效表达。Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体。结论成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的原核表达及抗体制备

目的 进行人心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)基因原核表达裁体的构建,获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体.方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段,将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白,Ni-NTA树脂纯化,纯化后的融合蛋白免疫小鼠,制备抗血清.通过ELISA,Western blot鉴定血清效价和特异性.结果 成功构建了cTnI的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得了高效表达.Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体.结论 成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体.     

重组日本血吸虫亲环素B的克隆、表达及免疫分析

目的克隆、表达日本血吸虫亲环素B(SjCyPB)基因,鉴定并分析重组蛋白的免疫性。方法根据Genbank中日本血吸虫序列设计一对特异性引物,以日本血吸虫cDNA为模板扩增SjCyPB基因,酶切后连接到表达载体pET28,构建pET28a(+)-SjCyPB重组质粒,转化入感受态大肠杆菌BL21/DE3后对质粒进行双酶切和测序鉴定。IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化重组蛋白。采用Western Blotting分析鉴定重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫大鼠,获得免疫血清,ELISA检测抗SjCyPB特异性抗体滴度。结果构建的pET28a(+)-SjCyPB重组质粒经双酶切和测序鉴定证实SjCyPB基因成功连接到pET28a(+)质粒中。经原核表达后获得纯化的重组蛋白,Western Blotting结果显示,该重组蛋白可与感染日本血吸虫的兔血清结合形成明显的条带。采用ELISA检测重组蛋白免疫后大鼠免疫血清的特异性IgG抗体滴度为1∶51 200。结论成功克隆了日本血吸虫CyPB基因,并获得大量纯化的重组蛋白,重组SjCyPB具有免疫原性和抗原性。     

促Treg细胞生成及活化重组分子的构建与表达

本研究旨在构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并鉴定其表达。应用RT-PCR获得人TGF-β1及HIV被膜蛋白gp120的C2-C4区基因并将其克隆至pCR2.1 T载体,酶切制备人TGF-β1及C2-C4区DNA片段,通过PCR定向连接两目的片段至原核表达载体pET-28a,生成pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用0.1 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达,以Western blot方法鉴定表达结果。结果表明,成功扩增人TGF-β1及C2-C4区基因并分别克隆入pCR2.1-T载体,经亚克隆构建了重组蛋白的原核表达质粒pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,并转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得工程菌株,通过IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式获得表达。结论:本研究成功构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并获得原核表达。     

NK4蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化与活性研究

目的通过构建NK4基因的重组原核表达载体,规模化制备NK4蛋白。方法将NK4基因插入载体pET-26b(+),构建重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并转化E.coli Rosseta(DE3)。IPTG诱导转化菌表达NK4蛋白,然后采用Ni-NTA树脂亲和层析进行纯化。观察复性后NK4蛋白对Hela细胞的生物学性状的影响,评价制备的NK4蛋白的生物活性。结果NK4基因重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4获成功构建。转化pET-26b(+)-NK4的E.coli Rosseta(DE3)以包涵体形式大量表达目的蛋白,占菌体总蛋白的42%。经Ni-NTA树脂亲和层析纯化后NK4蛋白纯度约为95%,并经Western blot证实。NK4蛋白行稀释复性后可抑制Hela细胞的贴壁、迁徙并促进其凋亡。结论成功构建NK4基因的重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并可在E.coli Rosseta(DE3)表达。制备的NK4保留了其生物学活性。     

结核分枝杆菌 ligC 基因的克隆表达及酶学性质研究

目的：构建结核分枝杆菌 H37Rv 的 ligC 原核表达载体,并进行表达纯化及酶学测定。方法以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 法扩增 ligC 基因,构建 pQE-30-ligC 重组质粒,在表达宿主菌 E．coli M15中诱导表达蛋白,经 Ni2＋-NTA 亲和层析柱纯化,最后 ATP 酶活性检测。结果成功构建了 ligC 原核表达载体 pQE-30-ligC,并能在宿主菌 E．coli M15中表达,纯化后具有 ATP 酶活性。结论LigC 基因克隆到原核宿主菌中能进行表达纯化,纯化后的蛋白具有 ATP 酶生物学活性。     

去乙酰化酶SIRT5的原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆小鼠的Sirt5基因,及制备SIRT5多克隆抗体。方法提取小鼠肝细胞总RNA进行RT-PCR,PCR法扩增Sirt5基因,将此基因克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21（DE3）,经异丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,利用Ni 2＋-NTA亲和层析柱纯化;纯化的目的蛋白免疫Bal/c小鼠后,收获血清并鉴定。结果成功构建了Sirt5原核表达载体,并能在宿主菌E.coli BL21（DE3）中高效表达;利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的SIRT5蛋白并制备了多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。     

UQCRB基因的原核表达和纯化

目的为研究UQCRB(ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)与中药的作用机制,本实验室进行了UQCRB基因的克隆、原核表达和纯化。方法提取人肝癌SMMC-7721细胞总RNA,反转录后采用特异引物进行PCR扩增获取UQCRB基因全长,产物纯化后连入T载体测定正确,克隆经NheI、XhoI双酶切后连入PET28a(+)载体,构建PET28a(+)-UQCRB原核表达质粒。在BL21(DE3)宿主菌中表达超声处理后,应用Amicon○R Pro Affinity Concentration Kit-Ni-NTA纯化,表达及纯化产物用westernblot验证。结果构建了PET28a(+)-UQCRB表达质粒,经过酶切鉴定和测序鉴定正确。重组UQCRB在BL21(DE3)中的最优表达条件为IPTG 1mM诱导5h。Westernblot证实了表达和纯化结果。结论重组UQCRB的原核表达和纯化成功,为进一步研究UQCRB的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的原核表达及抗原性分析

摘要：目的：克隆烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TR）基因并构建原核表达载体,获得烟曲霉TR重组蛋白,并鉴定其抗原性。 方法：用RT-PCR方法从烟曲霉总RNA中扩增出TR cDNA片段,克隆至pMD18-T载体,并转化E.coli JM109。经序列分析证实后,提取重组克隆质粒双酶切获得目的基因,与表达载体pET28a(+)连接,转化E.coli BL21（DE3）,筛选重组表达质粒。用异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组融合蛋白表达,用SDS-PAGE及免疫印迹法分析重组蛋白质,并用亲和层析柱进行纯化。 结果：构建了含TR全长基因的重组表达质粒,IPTG诱导后可高效表达。免疫印迹结果表明该重组蛋白质可被侵袭性曲霉病患者血清识别。 结论：成功构建了重组表达质粒pET28a(+)/TR,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,重组蛋白质具有良好的抗原性,为进一步研究奠定了基础。     

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达

目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）基因，构建原核表达载体，并表达该重组蛋白。方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段，插入克隆载体pMD18-T，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段；含pET28a／HXGPRT的宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物，Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别，获得纯化的重组蛋白。结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因，构建pET28a／HXGPRT重组质粒，并高效表达．为进一步研究提供了条件。     

大鼠脑源性神经营养因子的克隆及原核重组表达载体的构建

目的:构建重组表达载体pGEX-脑源性神经营养因子(BDNF),探讨其原核表达BDNF的可行性。方法:大鼠BDNF进行密码子优化,人工合成BDNF的全基因序列,经回收、纯化、酶切后连接到pGEX原核表达载体中,将重组质粒pGEX-BDNF转化大肠杆菌BL21细胞中,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,利用ELISA方法鉴定其表达的活性。结果:PCR鉴定及测序显示BDNF序列完全正确,BDNF基因的克隆和表达载体构建成功,IPTG诱导表达目的蛋白经ELISA检测,其表达的目的蛋白具有一定的活性。结论:经密码子优化后经人工合成得到BDNF基因片段并成功构建pGEX-BDNF重组表达载体,具有一定的生物活性。     

重组人骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

背景:骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白2诱骨活性最强,在骨组织工程研究中需要大量的骨形态发生蛋白2.目的:克隆表达骨形态发生蛋白2基因,并进行蛋白表达及蛋白纯化定量.设计、时间及地点:单一样奉观察,于2008-05/07在宝牛物工程(大连)有限公司开放实验室完成.材料:表达载体pET28a Vector及相应的宿主细胞E.coil BL21(DE3)购于Novagen公司;分子伴侣质粒pTF16、pGr07、PKJE7购于宝生物工程(大连)有限公司.方法:利用基因重组技术,优化片人工合成骨形态发生蛋白2基因,亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pET28a中,构建表达载体pET-BMP.将重组质粒pET-BMP与3种含分子伴侣质粒共转入宿主菌E.coil BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.菌体经超声波破碎,镍柱亲和层析纯化并定量.主要观察指标:①3种表达质粒的表达及町溶性检测及表达上清的westem blotting检测.②pET-BMPg的纯化.结果:在表达宿主菌中,骨形态发生蛋白 2基因获得了高效表达,其中一组为可溶性表达,表达产物经亲和层析纯化后,可溶性表达量达12.18 mg/L培养基.结论:人骨形态发生蛋白2基凼能在PET表达系统中得到高效可溶性表达.     

免疫印迹法测定Tp47蛋白与梅毒患者血清的免疫反应性

目的克隆Tp47基因、构建原核表达载体、表达并纯化Tp47蛋白,通过免疫印迹法(Western-Blot)检测其免疫反应活性。方法聚合酶链反应扩增Tp47基因,将Tp47克隆至pGEX-6P-1载体,构建重组表达质粒pGEX-6P1-Tp47,经测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经诱导表达后,用亲和层析方法纯化重组蛋白,鉴定正确后采用Western-Blot检测重组蛋白与梅毒阴性、阳性血清的免疫反应性。结果成功构建pGEX-6P1-Tp47原核表达质粒,表达、纯化后获得了相对分子质量约为71×103的重组蛋白;Western-Blot检测显示其能与梅毒阳性患者血清发生特异性反应,而与梅毒阴性患者血清无交叉反应性。结论成功克隆、表达、纯化Tp47重组蛋白,其与临床各期梅毒患者血清具有较好的免疫反应性,为Tp47重组蛋白用于梅毒早期诊断提供了理论依据。     

旋毛虫A200711蛋白的原核表达、纯化及其对H7402细胞增殖的影响

目的原核表达旋毛虫抗肿瘤基因A200711,并纯化该蛋白,CCK-8检测其对H7402人肝癌细胞的生长抑制作用。方法 PCR获得A200711基因片段,构建重组表达载体pET-28a(+)-A200711,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)。SDS-PAGE及Western blot检测IPTG诱导后重组菌,采用Ni-NTA亲合层析柱纯化并柱上复性目的蛋白。细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测A200711蛋白对H7402细胞的生长抑制作用。结果成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-A200711,目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE及Western blot分析显示,相对分子量约22KD处出现目的蛋白条带,与理论值相符;经Ni-NTA亲合层析柱获得了高纯度可溶性的A200711蛋白;H7402细胞增殖抑制率与A200711蛋白浓度存在量效关系,同时随作用时间的延长增殖抑制率也明显增加。结论成功克隆、表达并纯化了旋毛虫A200711蛋白。A200711蛋白可抑制H7402细胞的增殖,且呈现时效和量效关系,本研究表明旋毛虫A200711蛋白作为潜在的抗肝癌生物制剂有进一步研究的价值。     

腺苷脱氨酶三种原核表达载体的构建及蛋白表达

目的利用分子克隆技术表达腺苷脱氨酶蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,再以其为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增腺苷脱氨酶基因,然后将目的基因连接到3种原核质粒pET-28b、pET-32a(+)和pHSIE中,再将测序完全正确的克隆质粒用CaCl2法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达,并筛选最优表达条件,经Western-blot和SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。结果 3种质粒载体携带的目的基因DNA测序结果证实其很好地连接入载体质粒,表达的ADA蛋白经Western-blot和SDSPAGE鉴定符合,最优表达条件为诱导剂IPTG浓度0.4mmol/L,表达温度为16℃,表达时间为24h。结论该实验成功构建了腺苷脱氨酶的3个原核载体(BL21+pET-28b+ADA,BL21+pET-32a+ADA,BL21+pHSIE+ADA),且3个载体均成功高效表达了腺苷脱氨酶蛋白。     

人α1微球蛋白基因的质粒载体构建和表达

目的构建表达人α1-微球蛋白(α1-microglobulin,1α-MG)的重组质粒并纯化目的蛋白。方法从正常人肝脏中提取cDNA,RT-PCR扩增α1-mg基因,将扩增产物用NdeI/BamHI消化,切下目的基因片断克隆到质粒pET-15b中,构建重组pET-15b,转化入E.coliDH5α中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b。将重组pET-15b转化入宿主菌E.coliBL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达。提取细菌总蛋白质进行SDS-PAGE分析和蛋白印迹鉴定。利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析,纯化重组蛋白。结果筛选到携带有α1-mg基因的正确重组质粒pET-15b,重组蛋白在BL21(DE3)pLysS中得到了诱导表达,含量达20mg/L细菌培养液。经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带。结论重组质粒pET-15b的构建和有活性的酶蛋白的表达成功说明,PCR扩增获得的α1-mg基因具有完整的阅读框架,亲和层析纯化后可得到活性和纯度均较高的目的蛋白,为研制国产免疫比浊法试剂盒打下基础。     

福氏志贺菌ipaB基因的克隆表达及免疫原性研究

构建福氏志贺菌ipaB基因的原核表达载体,诱导表达并纯化.探讨重组蛋白IpaB经口服免疫小鼠后,机体产生的免疫应答.方法:用PCR扩增ipaB目的基因,克隆至pQE-30表达载体中,转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达蛋白IpaB;Western blot分析其抗原性.纯化后灌胃免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG、IgA、小肠黏液sIgA和粪便sIgA.结果:ipaB基因全长1 743 bp.经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为64 000.Western blot分析能与福氏志贺菌全菌抗血清反应.免疫小鼠后,血清IgA、IgG,粪sIgA,肠黏液sIgA明显高于对照组(P＜0.01).结论:成功构建了ipaB基因的原核表达载体并能高效表达,纯化后口服免疫可有效诱导黏膜免疫应答,产生高水平的sIgA,发挥局部黏膜免疫作用,为进一步研究细菌性痢疾的疫苗和发病机制奠定基础.     

人精子特异性乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达及其初步应用

目的 构建人精子特异性乳酸脱氢酶(hLDH-CA)的原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达,将重组hLDH-CA应用于抗精子抗体(ASA)的检测.方法 以人睾丸TripIEx cDNA文库为模板,PCR扩增hLDH-CA编码序列.PCR产物经Hind Ⅲ-Xho I酶切后,克隆至表达载体pET-28a(+)中,在E.coli BL21(DE3)中诱导His-Tag融合的重组蛋白表达.用免疫印迹、酶活性测定等方法鉴定表达产物.以纯化的重组hLDH-CA为基质,建立检测ASA的ELISA方法.结果 构建了hLDH-C4原核表达载体pET-28a(+).hLDHC.在IPTG的诱导下,重组菌可高效表达相对分子质量35 000的产物,与预期大小相符.免疫印迹显示,重组蛋白可被抗His-Tag单克隆抗体和兔抗人LDH-C4抗体识别.重组菌在IPTG诱导后,其裂菌液的乳酸脱氢酶活性是诱导前的11.2倍.用基于hLDH-C4抗原的间接ELISA法,在一组不育症患者中检测血清抗hLDH-CA抗体,阳性率达30.51%.结论 成功地克隆了hLDH-C4编码序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效的表达,重组hLDH-C4在ASA检测中得到初步应用.     

重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备

背景:国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达.由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少,国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道.目的:利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白,并制备和鉴定其多克隆抗体.方法:提取SD大鼠海马组织RNA,构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代 半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收,4次免疫日本大耳白兔后,心脏取血,吸取血清作为多克隆抗体,以ELISA测定抗体血清效价,Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性.观察:①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建.②pET28a-ALR重组体酶切鉴定.③ELISA及Western-blotting检测结果.结果与结论:双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带,其大小分别为5.3 kb和0,4 kb,经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体.成功获得分子质量约为19 ku纯化的融合蛋白.ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到1:2 000,说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性,有较高的效价,可满足实验的要求.通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白.实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白,并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体,经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求.