日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

目的获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的cDNA序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定。方法应用简并引物PCR和5’端、3’端锚定PCR,扩增得到日本血吸虫Tsunagi基因的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用ELISA和Western Blotting对表达蛋白进行初步鉴定。结果获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的完整ORF,序列全长为531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒pET28a-SjTsunagi在大肠杆菌中获得了可溶性表达;以重组蛋白免疫小鼠获得效价为1∶51 200的多克隆抗体,Western Blotting证实抗体可特异性识别目的蛋白。结论成功获得日本血吸虫Tsu-nagi蛋白编码基因的全长ORF,在大肠杆菌中克隆表达了Tsunagi基因,并制备了特异性多克隆抗体,为进一步研究其在日本血吸虫生殖生物学中的功能奠定了基础。     

新肿瘤睾丸抗原Ropporin重组蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建新肿瘤睾丸抗原Ropporin原核表达载体,表达和纯化人Ropporin重组蛋白,并制备其兔抗血清.方法:人Ropporin全长cDNA克隆入pQE30载体,在大肠杆菌中利用IPTG诱导表达并纯化人Ropporin重组蛋白.利用人Ropporin重组蛋白免疫兔,制备人Ropporin多克隆抗体.结果:以构建的pQE30-Ropporin质粒转化大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达和纯化得到相对分子质量与鼠Ropporin蛋白一致的蛋白质,利用其免疫动物后.Western blot检测显示该蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔抗血清效价>1:512 000,对该蛋白具有高度特异性.结论:利用大肠杆菌原核表达系统表达和纯化了2LRopporin重组蛋白,并成功制备了人Ropporin多克隆抗体.     

编码日本血吸虫Argonaute 3蛋白全长cDNA的获得及初步研究

目的获得日本血吸虫Argonaute3(Ago3)蛋白的全长编码cDNA并对其初步分析。方法利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得日本血吸虫Ago3蛋白全长编码cDNA,利用原核表达系统对此蛋白片段进行重组表达,采用亲和层析法纯化重组蛋白,并免疫动物制备多克隆抗体。利用Western blot技术分析该蛋白在日本血吸虫中的表达。结果采用RACE获得了日本血吸虫Ago3蛋白编码全长cDNA,长度为2772bp;利用原核表达系统获得了该蛋白片段的重组融合蛋白,并制备了多克隆抗体;Western blot分析表明,该抗体与日本血吸虫全虫蛋白在分子量约为100kDa处具有特异性反应。结论获得了编码日本血吸虫Ago3蛋白的全长编码cDNA,并制备了多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

人类磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的真核表达及其多克隆抗体的制备

目的在真核细胞中表达人磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)并制备抗PHGPx多克隆抗体。方法用特异引物从人睾丸组织cDNA文库中扩增出人线粒体型PHGPxcDNA,与真核表达载体pcDNA3.1/His重组,在COS-1细胞内表达PHGPx。用大肠杆菌表达的突变的PHGPx免疫动物,制备抗PHGPx抗体。结果重组体pcDNA-PHGPx转染的COS-1细胞表达了人PHGPx融合蛋白,PHGPx活性为111.5μmol·mg-1·min-1,高于对照组5倍。免疫扩散测得抗PHGPx多克隆抗血清滴度为1∶16;用于蛋白印迹时稀释倍数为1∶500,可见特异免疫沉淀条带。结论人PHGPx在COS-1细胞内获得了表达,抗PHGPx多克隆抗体有特异性,可以用于重组表达的PHGPx的鉴定。     

重组刚地弓形虫MIC8 CTD蛋白及其多克隆抗体的制备

目的制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8 CTD)重组蛋白及其多克隆抗体。方法以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8 CTD基因片段,构建MIC8 CTD/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8CTD融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的特异性及效价。结果构建了MIC8 CTD原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8 CTD融合蛋白;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体能特异识别MIC8 CTD,ELISA测定抗体效价为1∶8 000。结论制备的GST-MIC8 CTD融合蛋白具有免疫原性,用该抗原免疫动物可获得高效价的多克隆抗体。     

编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定

目的获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,并进行克隆和重组融合蛋白表达。方法利用RACE技术获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)分析该基因在日本血吸虫中的转录情况。原核表达保守功能域蛋白和全长蛋白,利用保守功能域重组融合蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹(Western blot)进行免疫学分析。结果本研究获得了一个编码日本血吸虫Argo-naute基因的全长cDNA,其完整开放阅读框为3 030 bp,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人、鼠Argonaute蛋白具有较高的同源性。Real-time PCR分析表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高。Western blot分析制备的多抗具有较高的特异性并能识别全长融合蛋白。结论获得了编码日本血吸虫Argonaute基因的cDNA及重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫视黄酸X受体2全长cDNA的克隆及初步分析

目的克隆编码日本血吸虫视黄酸X受体2(SjRXR2)蛋白的全长cDNA,并对其进行初步研究。方法利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得SjRXR2蛋白全长编码cDNA。利用生物信息学技术,对基因结构进行初步分析。利用实时荧光定量(Real time)PCR技术对该基因在日本血吸虫不同时期虫体中的转录情况进行分析。应用在线抗体表位预测软件获得SjRXR2配体结合区抗原性较强的一个多肽序列,合成该多肽片段,并免疫小鼠制备抗血清。利用Western blot技术分析该蛋白在日本血吸虫中的表达。结果采用RACE技术成功获得了SjRXR2蛋白全长编码cDNA,总长度为5 960bp,其完整开放阅读框为4 308 bp,编码1 435个氨基酸,预测分子量为159 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质序列具有核受体家族2的典型结构域特征,且与曼氏血吸虫RXR2有较高的相似性。Real time PCR分析表明,该基因在21、42 d龄日本血吸虫虫体内有较高的转录水平。Western blot分析表明,小鼠SjRXR2多肽免疫血清可特异性识别日本血吸虫虫体150 kDa蛋白。结论成功获得了编码SjRXR2蛋白的全长cDNA,并制备了针对该蛋白的特异性多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

AD-004蛋白表达、抗体制备及其在睾丸和肾上腺组织中的表达分析

目的以原核表达的小鼠肾上腺蛋白AD-004为免疫原，制备抗AD-004的兔多克隆抗体，并明确其在肾上腺、睾丸组织中的分布。方法将小鼠AD-004cDNA克隆于原核表达载体PET28，经IPTG诱导AD-004的表达。用Ni^2＋-NTA纯化后的蛋白为免疫原制备抗AD-004多克隆抗体。通过Western印迹鉴定抗体特异性及效价，并用此抗体对小鼠睾丸、肾上腺组织进行免疫组织化学分析。结果此原核表达系统可高效表达AD-004蛋白，Western印迹结果显示所制备的抗体具有很高的效价和特异性，免疫组化提示AD-004蛋白在肾上腺的髓质表达较高，而在睾丸中主要表达于间质的Leydig细胞。结论本研究获得了小鼠AD-004原核表达蛋白，成功制备了AD-004多克隆抗体，并发现其在睾丸间质Leydig细胞表达最高，提示AD-004可能在睾丸性激素的合成过程中起重要作用。     

A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。     

登革2型病毒贵州分离株NS1部分基因原核表达蛋白及其多克隆抗体制备

目的原核表达、纯化DENV-2贵州分离株NS1部分序列表达蛋白,并制备其多克隆抗体以研究其功能。方法合成DENV-2M株NS1部分基因序列,克隆到原核表达载体pET28(a),转化大肠埃希菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,Ni柱亲和层析纯化、回收融合蛋白;用纯化融合蛋白免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价。结果原核表达了NS1部分序列融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶800。Western blot检测该蛋白能被His标签抗体识别。结论 DENV-2M株NS1部分序列表达蛋白可诱导小鼠产生较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究DENV-2M株NS1部分序列表达蛋白的免疫原性奠定了基础。     

人朊蛋白相关蛋白Shadoo的表达、纯化及抗体的制备

目的克隆、表达和纯化人朊蛋白相关Shadoo（SHO）蛋白并制备抗Shadoo的多克隆抗体。方法提取仓鼠各组织的mRNA，分析SHO基因在仓鼠各组织中转录水平的差异;提取人DNA，PCR方法获得人SHO基因，克隆至融合表达载体，在大肠埃希菌中表达人SHO蛋白并纯化;以纯化蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清，用Western blot方法分别检测与重组及内源性SHO蛋白的免疫反应性。结果SHO基因在仓鼠各组织中的转录水平差异很大，脑组织转录水平高。在大肠埃希菌中表达了分子质量单位为37 ku的人SHO融合蛋白，制备的SHO蛋白抗体可与重组的SHO蛋白反应，可识别内源性的SHO。结论成功表达纯化人SHO融合蛋白并制备了抗SHO抗体，为研究SHO和正常朊蛋白之间的关系打下初步基础。     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

肝纤维化相关基因C16orf54的克隆及表达

目的制备人类功能未知基因C16orf54重组蛋白的多克隆抗体,为该基因功能研究奠定基础。方法分离纯化LX2细胞的总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增C16orf54基因的目的片段,构建重组蛋白表达质粒,转化大肠杆菌BL21,制备C16orf54重组蛋白。鉴定表达正确后,利用纯化的C16orf54重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗C16orf54重组蛋白的多克隆抗体。利用制备的多克隆抗体,采用免疫组织化学技术观察该蛋白在肝细胞内的表达特征。结果 Western blot及生物质谱技术分析证实,重组蛋白表达正确。所制备的多克隆抗体效价〉1：320 000,Western blot分析显示,多克隆抗体的特异性良好。免疫组织化学分析显示,该蛋白主要表达于肝实质细胞周围,呈膜型和浆型分布;胃黏膜下组织细胞弱表达。结论 C16orf54多克隆抗体被成功制备。C16orf54主要表达于肝实质细胞周围及胃黏膜下基底层细胞。     

寨卡病毒E蛋白及第三结构域的原核表达和多克隆抗体制备

目的 在大肠杆菌中克隆表达和纯化寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)包膜糖蛋白(Envelope Protein,E)及第三结构域(Envelope DomainⅢ,EDⅢ),并制备两种免疫原的鼠多克隆抗体。方法 通过Vero-E6细胞培养扩增ZIKV,提取病毒总RNA并反转录为cDNA,利用E和EDⅢ基因的cDNA序列构建原核表达载体pET32a/E和pET28a/EDⅢ,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺柱亲和层析法纯化蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清,间接ELISA法测定效价,Western Blot检测特异性。结果 成功表达并纯化重组蛋白E和EDⅢ,获得的多克隆抗体效价均达到1:409 600,Western Blot检测多克隆抗体可特异性识别重组E蛋白和EDⅢ以及天然E蛋白。结论 成功制备出特异性抗寨卡病毒E蛋白和EDⅢ的鼠源多克隆抗体,为深入探索寨卡病毒致病机制、检测方法和免疫策略奠定了研究基础。     

新型冠状病毒M蛋白表达及多克隆抗体制备北大核心CSCD

目的利用原核表达系统表达新型冠状病毒M蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并与M真核质粒免疫效果相比较,为新型冠状病毒感染检测试剂盒的研制奠定基础。方法将酶切鉴定正确的原核重组表达载体PMAT-9s-M转化BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达M蛋白并进行鉴定。M蛋白经镍离子亲和层析柱纯化浓缩后免疫大白兔,制备多克隆抗体。将M真核重组质粒转化至DH5α,碱裂解法大量抽提质粒后免疫大白兔,制备多克隆抗体。采用ELISA检测2种抗血清的抗体效价,采用Western blot检测2种抗血清与M蛋白的反应性。结果PMAT-9s-M转化BL21后表达70 ku的His-MBP-M融合蛋白,且该蛋白主要存在于包涵体中。纯化后免疫大白兔,制备的多克隆抗体血清效价与真核重组质粒免疫制备的抗血清抗体效价均达1︰16000,且2种抗血清均与凝血酶切M蛋白有良好反应性。结论原核表达的M蛋白免疫制备的多克隆抗体特异性强,效价高,且重组M蛋白制备简便、经济高效,为新冠病毒感染诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase TPx)基因,构建原核表达载体,通过诱导表达,纯化融合蛋白抗原,免疫小鼠制备抗血清。方法从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EgTPx基因,克隆到原核表达载体pET-41b中,转化大肠杆菌BL21,经过IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE对表达蛋白进行分析,通过谷胱甘肽Sepharose4B层析柱分离纯化获得重组蛋白并免疫小鼠,制备抗血清。Western blot鉴定抗血清的特异性,ELISA测定抗体的效价。结果用PCR方法扩增获得的EgTPx基因长度为582bp,经酶切鉴定和序列测定,插入到原核表达载体的基因片段为EgTPx基因,SDS-PAGE结果显示表达融合蛋白相对分子质量约为54kDa,鼠抗EgTPx抗体能与融合蛋白和天然原头蚴抗原发生特异性反应;间接ELISA法测定该抗体效价为1∶256000。结论成功地制备了鼠抗EgTPx抗体,并能够特异识别原核表达的融合蛋白EgTPx和天然原头蚴抗原,为研制有效的包虫病疫苗及相关诊断试剂盒奠定了基础。     

功能未知基因C16orf68在不同肝细胞系内的表达特征

目的获取人基因C16orf68,构建原核表达载体,诱导重组蛋白的表达,制备兔抗C16orf68蛋白多克隆抗体,观察C16orf68在各细胞系的表达特征。方法用RT-PCR技术,从肝星状细胞系LX2的总RNA中获得编码C16orf68基因功能片段的cDNA,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-C16orf68,并导入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达重组的重组蛋白。利用Western blot技术、生物质谱技术对表达的C16orf68进行确认。利用纯化的C16orf68重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗C16orf68蛋白的多克隆抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。利用Western blot技术观察C16orf68在多个细胞系的表达特征。结果扩增获得C16orf68基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列相一致,成功表达了C16orf68重组蛋白,经Western blot鉴定、生物质谱Q-TOF分析均显示表达正确。利用纯化后的重组蛋白,制备了兔抗人C16orf68多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价〉1：320 000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好,Western blot结果显示各细胞系该蛋白主要表达于肝实质细胞。结论 C16orf68在肝脏主要表达于肝实质细胞,可能与肝细胞损伤相关。     

泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体的制备

目的探讨制备泡沫细胞相关基因4多克隆抗体的方法。方法将从人胎肝文库经聚合酶链反应扩增获得的泡沫细胞相关基因4基因全长cDNA序列，通过生物信息学分析，预测泡沫细胞相关基因4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域．并进行了多序列比对，并根据蛋白质的亲疏水性、二级结构、偶联难度及实验难度等，确定泡沫细胞相关基因4抗原13肽PKLVKEEVFWRNY，采用固相多肽合成法合成该抗原片段．偶联后经过基础免疫，6次加强免疫，经追踪检测，于第四次免疫后10～14天颈动脉放血，分离血清，冷冻抽干，-20℃保存而制备了泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体。结果用固相多肽合成法成功制备了泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体，该抗体经间接酶联免疫吸附测定法检测其效价为1：16000，Western blot检测可见40kDa处有目的带，用免疫组织化学方法从HepG2细胞中检测到泡沫细胞相关基因4蛋白表达，证实该抗体具有较好的反应性和特异性。结论固相多肽合成法省时、省力、制备的抗体效价高；泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体的制备，为进一步研究泡沫细胞相关基因4蛋白在动脉粥样硬化中的功能作用奠定了基础。     

心肌肌钙蛋白I基因的克隆及真核表达

目的 克隆并表达人心肌肌钙蛋白I(cTnl)cDNA,为高效获得大量蛋白、制备抗体打下基础。方法采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PcR)和分子生物学技术克隆人cTnI基因,重组构建pcDNA3-cTnI真核表达载体,转染人胚肾(HEK)293细胞,并用单克隆抗体检测特异性cTnI蛋白表达．结果克隆了cTnI的全长基因,构建了pcDNA3-cTnI真核表达载体并成功地在真核细胞中获得了蛋白表达结论所表达的蛋白证明具有正确的cTnI免疫原性,为规模化制备cTnI蛋白奠定了基础。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的克隆及真核表达

目的 克隆并表达人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)cDNA,为高效获得大量蛋白、制备抗体打下基础.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和分子生物学技术克隆人cTnI基因,重组构建pcDNA3-cTnI真核表达载体,转染人胚肾(HEK)293细胞,并用单克隆抗体检测特异性cTnI蛋白表达.结果 克隆了cTnI的全长基因,构建了pcDNA3-cTnI真核表达载体并成功地在真核细胞中获得了蛋白表达.结论 所表达的蛋白证明具有正确的cTnI免疫原性,为规模化制备cTnI蛋白奠定了基础.