体外培养的大鼠Schwann细胞神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达

目的：研究体外培养的Schwann细胞神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。方法：用细胞培养技术，培养新生SD大鼠Schwann细胞，传代后用ABC免疫细胞化学法检测Schwann细胞的NGF、BDNF反应。结果：体外培养的Schwann细胞立体感强、折光性好，细胞为梭形、椭圆形或三角形，NGF、BDNF免疫反应为阳性。结论：体外培养的Schwann细胞能表达NGF、BDNF。     

IL-1β促进Schwann细胞增殖及分泌NGF的研究

为观察白介素-1β(IL-1β)对Schwann细胞增殖及分泌神经生长因子(NGF)的影响,本研究取3d龄的大鼠坐骨神经纯化培养Schwann细胞,然后分4组进行处理。处理方法为:A组加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,B组仅在纯化后第1d向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,C组每天向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,D组隔天向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,分别培养5d。倒置显微镜下观察Schwann细胞的形态,用抗S-100蛋白免疫组化鉴定Schwann细胞,经流式细胞仪(FCM)检测细胞的分裂增殖情况,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测NGFmRNA表达的变化,酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测细胞培养基中NGF蛋白的表达量。结果显示:D组Schwann细胞增殖率、NGFmRNA合成量和NGF蛋白表达量均显著高于其他三组(P<0.05)。此结果说明IL-1β能够促进Schwann细胞的分裂增殖,并且促进胞内NGFmRNA的合成及胞外NGF的分泌,其作用持续时间大约为2d。     

Schwann细胞与硫酸肝素-胶原蛋白支架材料的复合

本研究目的是观测硫酸肝素-胶原蛋白支架材料对Schwann细胞的相容性,采用: (1)冷冻干燥法制备硫酸肝素-胶原蛋白支架材料,培养、纯化并鉴定Schwann细胞后,将Hoechst荧光标记的Schwann细胞复合于硫酸肝素-胶原支架材料中,荧光显微镜、扫描电镜及光镜下观察其在材料内部的空间排列形式; (2)以台盼蓝染色、MTT法检测Schwann细胞与硫酸肝素-胶原蛋白共培养时的生物活性。结果显示:作者制备的支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构,Schwann细胞在支架材料微管内成线性平行排列,类似于神经基底膜与Schwann细胞形成的Büngner带;台盼蓝染色Schwann细胞死亡率仅6. 47%,MTT法证明Schwann细胞与硫酸肝素-胶原蛋白材料共培养时保有高度的生物活性。本研究结果表明:以硫酸肝素复合胶原蛋白结合特定条件下冷冻干燥技术可以制备在组分和内部空间结构上高度仿生神经的新型神经组织工程支架材料,与Schwann细胞有良好的细胞相容性。     

促红细胞生成素/神经生长因子对大鼠压迫性损伤后背根神经节细胞的影响

目的:观察促红细胞生成素(EPO)/神经生长因子(NGF)对慢性压迫中的大鼠背根神经节(DRG)细胞的影响。方法:暴露大鼠多节段DRG,行慢性压迫造模型,并分离DRG,模型组分离的DRG细胞给予外源EPO或NGF,台盼蓝染色检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光法检测Bcl-2和Bax表达,荧光探针法检测活性氧(ROS)活性,ELISA法检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的水平。结果:EPO或NGF可减轻DRG细胞的损伤和凋亡,下调促凋亡因子Bax的表达,并上调抗凋亡因子Bcl-2的表达,降低ROS活性。结论:EPO和NGF有利于受损的DRG细胞抗炎和抗氧化作用。     

NGF过表达对大鼠脑缺血再灌注损伤模型认知功能的影响

目的探究神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达对大鼠脑缺血再灌注损伤模型认知功能的影响。方法将SD大鼠分成空白对照组、模型组和NGF转染组。水迷宫实验检测各组大鼠学习能力,荧光定量PCR,Western blot和免疫组织化学染色检测NGF和Caspase-3的相对表达水平,免疫荧光染色定位NGF蛋白的表达,尼氏染色和透射电镜观察神经元细胞的数量以及血脑屏障的完整性。结果 NGF转染组逃避潜伏期时间要明显短于模型组,而穿越平台次数明显多于模型组。NGF转染组NGF蛋白和mRNA相对表达量明显高于模型组,Caspase-3蛋白和mRNA相对表达量明显低于模型组。NGF蛋白与神经元细胞标记蛋白NSE可共染,而与神经胶质细胞标志物GFAP不可共染。NGF转染组细胞数明显多于模型组细胞数。模型组细胞轮廓模糊,血脑屏障破坏,而NGF转染组细胞轮廓存在,血脑屏障破坏较小。结论 NGF的过表达促进神经元细胞的存活,对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的认知功能有保护作用。     

神经干细胞联合骨髓间充质干细胞移植对小鼠脊髓损伤的修复作用

目的:研究神经干细胞(NSCs)联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对小鼠脊髓损伤(SCI)的作用。方法:分别培养与鉴定绿色荧光蛋白(e GFP)转基因小鼠的NSCs与td Tomato红色荧光蛋白转基因小鼠的BMSCs;将两种细胞进行Transwell共培养,并用免疫荧光染色观察巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,鉴定BMSCs的分化情况;将24只3月龄雌性小鼠随机分为3组:对照组(control)、移植组(BMSCs)和共培养BMSCs移植组(BMSCs+NSCs),利用撞击法制备小鼠SCI模型,并在损伤局部移植细胞和培养基,利用BMS评分在不同时间点评估小鼠脊髓功能恢复情况; Western Blot检测脊髓损伤部位的神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的蛋白表达水平。结果:荧光倒置显微镜下可见分离培养的NSCs呈现绿色荧光,BMSCs呈现红色荧光,经细胞免疫荧光检测可见共培养后的BMSCs阳性表达神经干细胞和神经元特异性标记物,BMS评分结果显示细胞移植5 d后,移植组和共培养BMSCs移植组小鼠有差异,第7 d差异最明显,Western Blot结果显示共培养BMSCs移植组NGF和BDNF蛋白表达水平高于移植组和对照组。结论:小鼠NSCs与BMSCs在Transwell小室中共培养后,有利于BMSCs向神经方向分化,并有利于SCI小鼠运动功能的恢复。     

失神经萎缩肌组织成分对成肌细胞性能影响的实验研究

目的：探讨长期失神经萎缩骨骼肌组织成分对体外培养成肌细胞的性能影响。方法：①获取长期失神经支配肌萎缩模型大鼠的腓肠肌，无菌条件下清洗、剪碎、匀浆、过滤，收集上清液；②收集Schwann细胞的体外培养基；③体外培养C2C12成肌细胞系，扩增传代并分组：A．对照组，常规培养，无任何处理因素；B．添加Schwann细胞培养基；C．添加萎缩肌匀浆液。倒置显微镜观察3组细胞的形态特征，免疫荧光检测C2C12细胞MyoD和Myogenin的差异表达。结果：倒置显微镜下，各组细胞贴壁良好，A、C组形态无差异，未见分化肌管；B组于培养48h后细胞变纤细，可见肌管形成。荧光染色证实，培养24h后，3组均出现MyoD阳性细胞，C组阳性细胞数量明显多于A、B组；72h时，3组均可见Myogenin阳性细胞，B组阳性细胞数量明显多于A组，C组阳性细胞数量稀少。结论：长期失神经萎缩肌组织成分能够促进成肌细胞的增殖与活化，但抑制活化成肌细胞的进一步分化成熟。     

低氧对大鼠骨髓基质细胞分泌神经生长因子的影响

目的:研究大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)在低氧培养条件下神经生长因子(NGF)的表达.方法:采用全骨髓贴壁培养法体外分离、纯化大鼠的BMSCs.置于常氧和低氧(3%)条件下培养,用cell counting kit (CCK-8)测定细胞增殖情况;台盼蓝染色检测细胞的活力;提取2种培养条件5个时间点的细胞蛋白,免疫印迹法检测细胞蛋白中NGF的含量;收集2种培养条件下5个时间点的细胞上清液,ELISA法检测细胞上清液中NGF的含量.结果:在3%低氧条件下培养BMSCs,其细胞活力较好,细胞增殖加快;免疫印迹法检测结果表明,与常氧条件相比,随培养时间的延长,低氧条件下NGF的表达明显增加,其24h分泌达高峰;ELISA检测结果表明,随培养时间的延长,常氧下细胞上清液中NGF的浓度逐渐增加,低氧12h时NGF的浓度显著增高,明显高于常氧培养组.结论:BMSCs在3%低氧条件下培养细胞生长迅速,细胞活力较好;3%的低氧条件可增强BMSCs分泌NGF的能力.     

不同空间排列静电纺丝对RSC96细胞表达NGF及Laminin的研究

目的：研究不同空间排列静电纺丝对雪旺细胞株(RSC96)神经营养因子（NGF）及层粘连蛋白（Laminin，LN）的表达情况。方法根据培养条件不同分3组，即平行静电纺丝培养组（A）、随机静电纺丝培养组（B）及膜上培养组（C）培养3天后用Trizol法提取细胞总RNA，用Oligo(dT)逆转录酶得到cDNA。经特定引物PCR扩增，取相同量的逆转录产物进行qPCR反应,检测NGF及LN的表达差异。结果平行静电纺丝组，随机静电纺丝组，膜上培养组上NGF基因表达依次递增，各组间差异明显；LN基因的表达依次递减，各组间差异明显。结论不同空间排列的静电纺丝对RSC96细胞表达NGF和Laminin影响不同，平行的静电纺丝有促进细胞向成熟分化的可能。     

人脐带间充质干细胞生物特性比较:胰酶冷消化和组织块法体外培养

背景:以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。目的:比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。方法:采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞,记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期,倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况,制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线,流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达,第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。结果与结论:使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞,胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P0.05);原代培养周期差异无显著性意义(P0.05)。倒置相差显微镜下细胞均为贴壁生长,形态为成纤维细胞样,但胰酶冷消化法培养的少数原代细胞呈多角形,不规则,细胞的体积较组织块法大。组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法,在进入对数生长期后各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P0.05)。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45。两种方法培养出来的第3代脐带间充质干细胞经诱导后,免疫荧光均显示神经干细胞特征性标志物nestin阳性表达。结果表明胰酶冷消化法与组织块法均能培养出脐带间充质干细胞,但组织块法更适合于此类细胞的培养,对细胞的伤害更低。     

Biocompatibility evaluation of silk fibroin with peripheral nerve tissues and cells in vitro

Silk-based materials have been used in the field of bone or ligament tissue engineering. In order to explore the feasibility of using purified silk fibroin to construct artificial nerve grafts, it is necessary to evaluate the biocompatibility of silk fibroin material with peripheral nerve tissues and cells. We cultured rat dorsal root ganglia (DRG) on the substrate made up of silk fibroin fibers and observed the cell outgrowth from DRG during culture by using light and electron microscopy coupled with immunocytochemistry. On the other hand, we cultured Schwann cells from rat sciatic nerves in the silk fibroin extract fluid and examined the changes of Schwann cells after different times of culture. The results of light microscopy, MTT test and cell cycle analysis showed that Schwann cells cultured in the silk fibroin extract fluid showed no significant difference in their morphology, cell viability and proliferation as compared to that in plain L15 medium. Furthermore, no significant difference was found in expression of the factors secreted by Schwann cells, such as nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and S-100, between Schwann cells cultured in the silk fibroin extraction fluid and in plain L15 medium by the aid of immunocytochemistry, RT-PCR and Western analysis. Collectively, these data indicate that silk fibroin has good biocompatibility with DRG and is also beneficial to the survival of Schwann cells without exerting any significant cytotoxic effects on their phenotype or functions, thus providing an experimental foundation for the development of silk fibroin as a candidate material for nerve tissue engineering applications.     

Neurotrophins and other growth factors in the regenerative milieu of proximal nerve stump tips

Classic ideas on mechanisms for axon sprouting and nerve regeneration from peripheral nerves suggest that there is a prominent role for neurotrophin support. There has been comparatively less attention towards features of the regenerative process that develop from the proximal nerve trunk without the support of target tissues or the denervated trunk of a peripheral nerve. We studied early (2–14 d) expression of local growth factors in proximal nerve stump tips of transected sciatic nerves in rats. Immunohistochemical labelling was used to address specific deposition of BDNF, NGF, NT-3, bFGF, CNTF and IGF-1. We observed a unique localisation of BDNF, and to a much lesser extent, NGF in mast cells of injured nerve trunks but they were also observed in intact uninjured nerves. Macrophages did not express either BDNF or NGF. CNTF and IGF-1 were expressed in Schwann cells of intact nerves and stumps. We did not observe bFGF or NT-3 expression in any of the samples we studied. Mast cells may represent an important reservoir of BDNF in peripheral nerves.     

Nerve growth factor immunohistochemistry and biological activity in the rat iris

Summary Nerve growth factor (NGF) production in the cultured rat iris was examined using immunohistochemistry and bioassay of irides and conditioned media. NGF immunoreactivity increased steadily with days in culture so that the intensity of staining was maximal after 6 days of culture. The localization was shown to be sensitive to the presence of cross-linking fixatives such as formaldehyde and glutaraldehyde and this effect was only partially alleviated by the use of very high concentrations of antibodies. NGF immunoreactivity was localized in Schwann cells and possibly nerve axons, but with no antigen detectable in smooth muscle fibres. Media conditioned over irides initially supported a high percentage of dissociated sympathetic neurons, but the number supported decreased with time in culture until day 4. Moreover, the use of antibodies to NGF allowed the detection of at least two types of neuronotropic activity, NGF accounting for at least 94% of the total trophic activity present after 4 days of culture. These findings provide support for the proposal that Schwann cells produce NGF and question the accepted hypothesis that the molecule is produced by smooth muscle fibres as a peripheral maintenance factor for sympathetic and sensory nerves. The results also suggest that two survival factors may be involved in the regulation of sympathetic function.     

施万样细胞对大鼠脊神经节NGF和BDNF表达的影响

目的观察施万样细胞对坐骨神经损伤(sciatic nerve injury,SNI)大鼠脊神经节NGF和BDNF表达的影响,初步探讨施万样细胞对脊神经节的保护作用。方法先将脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)诱导分化为施万样细胞并对后者进行鉴定,后将二者分别植入脱细胞神经移植物(ANA)中,构建组织工程神经。大鼠随机分为正常对照组、ADSC组和施万样细胞组。后两组建立SNI模型并用相应的组织工程神经桥接损伤的神经。术后4周采用Western Blot和Real-time PCR检测各组大鼠脊神经节神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)蛋白和m RNA的表达。结果 ADSCs能够诱导分化为施万样细胞并表达施万细胞标记物S100β和GFAP蛋白。施万样细胞组大鼠脊神经节内NGF和BDNF蛋白及m RNA表达量均高于ADSC组(P0.05)。结论施万样细胞可上调脊神经节NGF和BDNF的表达,对SNI所致的脊神经节内神经元损伤有保护作用。     

巨噬细胞条件培养基影响新生鼠雪旺氏细胞表达神经生长因子的实验研究

为了研究巨噬细胞对雪旺氏细胞表达神经生长因子的影响，制备了脂多糖激活的和未激活的成年大鼠腹腔巨噬细胞的条件培养基，取3种不同浓度，分别施加于纯化培养的新生鼠雪旺氏细胞。作用24、48、72h，用神经生长因子单抗及间接免疫荧光法显示细胞，用流式细胞仪进行测试和统计分析。结果发现，脂多精激活的巨噬细胞条件培养基或未激活者，取其不同浓度、作用不同时间后，均能不同程度地提高新生鼠雪旺氏细胞的神经生长因子阳性表达率及细胞内的神经生长因子含量。提示巨噬细胞条件培养基中含有促进雪旺氏细胞表达神经生长因子的物质，巨噬细胞可能通过分泌细胞因子调节雪旺氏细胞对神经生长因子的表达．     

组织工程化人工神经研究进展

利用各种神经导管可成功桥接修复短段周围神经缺损已为许多学者公认 ,但是 ,这些神经导管由于缺乏许旺细胞或内部支架来支持、促进神经再生轴突长距离生长 ,因此不能有效修复长段周围神经缺损[1,2 ] 。应用组织工程技术构建神经导管 ,为修复长段周围神经缺损提供了新的方法和思路。这项研究的核心是模拟周围神经天然结构 ,将许旺细胞与生物支架材料有机结合成为类似Ｂ櫣ｎｇｎｅｒ带的结构 ,为再生神经提供良好的生长环境 ,充分发挥许旺细胞对再生神经的营养 ,诱导作用 ,从而促进神经的再生。组织工程化人工神经的主要内容是将经体外培养扩…     

成年大鼠雪旺细胞增殖和纯化研究

目的：探索成年大鼠雪旺细胞的体外培养和纯化方法。方法：取成年大鼠背根神经节采用植块法培养，坐骨神经采用酶消化法分散培养。各分三组，第一组为阿糖胞苷处理组；第二组为免疫溶解处理后加垂体浸出液组；第三组为对照组。以活细胞计数和S-100标记相结合判断雪旺细胞增殖和纯化程度。结果：采用植块培养法至第2周末，雪旺细胞纯度在第一、二和三组分别为90％、97％和50％。分散培养至第18天，雪旺细胞纯度第一组94％，第二组大于97％，第三组80％。细胞数量第一组增加1．4倍，第二组增加5．1倍，第三组增加2．4倍。结论：采用免疫溶解处理后加垂体浸出液方法培养成年大鼠来源的雪旺细胞，可得到数量多纯度高的雪旺细胞。     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。 目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。 方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。 结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。