人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞miR-146a-5p表达及对细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-146a-5p在人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞系中的表达及对SCC9细胞增殖、凋亡的影响。方法取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞和人正常口腔角质HOK细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-146a-5p mRNA、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6)mRNA相对表达量。取对数生长期人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞,随机分为观察组(转染miR-146a-5p mimics)和空白对照组(转染等量ddH_2O),转染24、48 h,采用CCK-8法检测2组细胞增殖,FITC-PI荧光双染法检测细胞凋亡;转染24 h,采用实时荧光定量PCR法检测PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量,Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量。结果 SCC9细胞miR-146a-5p mRNA相对表达量(8.33±0.58)高于HOK细胞(1.04±0.01),TRAF6 mRNA相对表达量(0.05±0.01)低于HOK细胞(1.05±0.01)(P0.05)。转染24、48 h,观察组SCC9细胞增殖吸光度值(1.65±0.02、1.96±0.04)高于空白对照组(1.33±0.01、1.57±0.02)(P0.05),SCC9细胞凋亡率[(0.89±0.01)%、(1.23±0.01)%]低于空白对照组[(2.77±0.01)%、(4.23±0.01)%](P0.05)。转染24 h,观察组Scc细胞PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量(2.98±0.05、8.20±0.06、5.34±0.03)高于空白对照组(1.05±0.01、1.03±0.01、1.07±0.01),PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量(2.32±0.01、10.23±0.02、5.25±0.01)高于空白对照组(0.62±0.01、4.58±0.01、0.09±0.01)(P0.05)。结论 SCC9细胞miR-146a-5p表达上调,TRAF6表达下调;miR-146a-5p可促进SCC9细胞增殖,抑制其凋亡,其机制可能是增强PI3K/Akt/mTOR信号通路表达。     

miR-1976在帕金森综合征中的作用

目的探讨miR-1976在帕金森综合征(PD)中的作用。方法选取人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,随机将细胞分为四组,空白对照组、模型组、miR-1976抑制剂(inhibitor)转染组和空白转染组。空白对照组常规培养,不做处理,模型组采用1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型,miR-1976 inhibitor转染组转染miR-1976 inhibitor质粒,空白转染组转染空白质粒。采用MMT法检测各组细胞增殖,流式细胞仪检测各组细胞凋亡,荧光定量PCR检测自噬相关基因Beclin1、LC3Ⅰ/ⅡmRNA表达,Western blot检测各组Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达。结果模型组和miR-1976 inhibitor转染组培养24 h、48 h和72 h时OD值明显低于空白对照组和空白转染组(P0.05);模型组和miR-1976 inhibitor转染组细胞凋亡率分别为(14.221±2.816)%和(11.016±2.910)%,明显高于空白对照组和空白转染组(P0.05);模型组和miR-1976 inhibitor转染组Beclin1 mRNA和LC3Ⅰ/ⅡmRNA相对表达明显高于空白对照组和空白转染组(P0.05),而miR-1976相对表达量明显低于空白对照组和空白转染组(P0.05);模型组和miR-1976 inhibitor转染组Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白相对表达明显高于空白对照组和空白转染组(P0.05)。结论 miR-1976在PD中有重要作用,miR-1976低表达可抑制神经细胞增殖,促进细胞凋亡及自噬。     

miR-124对C6胶质瘤细胞增殖和迁移能力的影响

目的:研究miR-124对C6胶质瘤细胞增殖和迁移能力的影响。方法:体外培养C6胶质瘤细胞,依据转染不同分为空白对照组、阴性对照组和miR-124拟似物组。实时荧光PCR检测转染效率,绘制生长曲线,MTT实验检测miR-124对C6细胞增殖能力影响,计算抑制率。划痕实验检测miR-1 2 4对C 6细胞迁移能力影响,计算迁移率。结果:生长曲线显示miR-124拟似物组C 6细胞生长能力受到明显抑制,转染后第3天,miR-124拟似物组C6细胞数目显著低于阴性对照组(5.410±0.463v s.6.917±0.385;P0.01);miR-1 2 4拟似物组mRNA表达量显著高于阴性对照组和空白对照组(5.92±0.56 vs.0.93±0.13和1.00±0.12;P0.01);MTT增殖实验显示miR-124抑制C6细胞增殖能力,miR-124拟似物组抑制率显著高于阴性对照物组(42.90±5.169 vs.10.24±3.351;P0.01);划痕实验显示miR-124明显抑制C6细胞迁移能力,阴性对照组迁移率显著高于miR-124拟似物组(98.79±1.210vs.81.72±5.972;P0.05)。结论:miR-124能够显著抑制C6胶质瘤细胞的增殖和迁移能力。     

上调及下调MicroRNA-195对人脑胶质瘤影响的初步研究

目的观察上调及下调microRNA-195(miR-195)对裸鼠皮下荷SHG-44人脑胶质瘤生长的影响并探讨其机制。方法使用脂质体瞬时转染法将miR-195 mimics和inhibitor分别转入人脑胶质瘤细胞系SHG-44,同时设立空白对照组和阴性对照组;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染前后miR-195的含量变化;流式细胞法检测各组细胞周期分布;裸鼠成瘤实验观察miR-195对体内胶质瘤增殖的影响;肿瘤组织HE染色观察病理学改变;Western blot、免疫组织化学染色检测肿瘤组织周期相关蛋白P21、Cyclin D1的表达变化。结果 qRT-PCR测得转染mimics后miR-195的表达水平提高19倍左右,而转染inhibitor后miR-195的表达水平降低为空白对照组的42%;与空白对照和阴性对照组相比,miR-195mimics组细胞阻滞于G0/G1期(P<0.05);而miR-195 inhibitor组则相反(P<0.05);裸鼠成瘤实验显示,miR-195 mimics组与空白对照组和阴性对照组相比,肿瘤生长速度减慢,体积减小(P<0.05),而miR-195 inhibitor组则结果相反(P<0.05);HE染色结果显示miR-195mimics组肿瘤组织异型性下降,新生血管数减少,而miR-195 inhibitor组则相反;Western blot检测示与空白对照组和阴性对照组比较,miR-195 mimics组P21表达上调,而Cyclin D1表达下调,miR-195inhibitor组结果相反(P均<0.05);免疫组化染色检测显示,与空白对照组和阴性对照组比较,miR-195mimics组中P21表达阳性率较高,而Cyclin D1的表达阳性率较低(P均<0.05),miR-195 inhibitor组情况则相反(P均<0.05)。结论 MiR-195可使P21表达升高,下调Cyclin D1的表达,阻滞G0/G1期向S期转换,从而抑制人脑胶质瘤细胞SHG-44的增殖能力。     

非小细胞肺癌患者血浆miR-451表达及对HCC827细胞生物学性质和放疗敏感性的影响

目的探讨miR-451在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者血浆中的表达及其对NSCLC细胞生物学性质及放疗敏感性的影响。方法 NSCLC患者69例为观察组,同期体检健康者53例为对照组,采用实时荧光定量PCR法检测2组血浆miR-451 mRNA相对表达量。将人NSCLC细胞株HCC827随机分为空白对照组、miR-451组和慢病毒组,空白对照组不作处理,miR-451组和慢病毒组分别转染包含miR-451、无意义核苷酸序列慢病毒;转染24、48、72 h,采用MTT法检测细胞增殖;转染72 h,采用Transwell小室试验检测细胞侵袭,采用划痕试验检测细胞迁移距离。再将3组细胞分为0、3、6、9 Gy 4个亚组,分别接受相应剂量的X线照射,采用MTT法检测细胞增殖和细胞存活。结果观察组血浆miR-451相对表达量(1.72±0.39)低于对照组(2.16±0.31)(P0.05)。miR-451组细胞miR-451相对表达量(4.17±0.82)高于空白对照组(1.32±0.37)和慢病毒组(1.26±0.33)(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05);转染24、48、72 h,miR-451组细胞增殖率均低于空白对照组和慢病毒组(P0.05);转染72 h,miR-451组侵袭细胞数[(123.7±26.4)个]较空白对照组[(247.6±39.7)个]和慢病毒组[(254.5±38.2)个]少,细胞迁移距离[(45.2±8.8)μm]较空白对照组[(73.2±11.7)μm]和慢病毒组[(68.9±10.4)μm]近(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05);miR-451组细胞在0、3、6、9 Gy剂量X线照射后的细胞增殖率和细胞存活率均低于空白对照组和慢病毒组(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 miR-451在NSCLC患者血浆呈低表达;miR-451可抑制HCC827细胞增殖、侵袭与迁移,上调HCC927细胞对放疗的敏感性。     

microRNA-21调节宫颈鳞癌SiHa细胞中PDCD4的表达研究

目的探讨microRNA(miR)-21-反义寡核苷酸(ASODN)对宫颈鳞癌SiHa细胞中PDCD4基因表达、细胞增殖与凋亡的影响。方法宫颈鳞癌SiHa细胞分3组,采用LipofectamineTM2000转染试剂,miR-21调控组转染miR-21抑制剂的ASODN,miR-21抑制剂阴性对照的ASODN,空白对照组不转染。Cell Titer和荧光TUNEL分别检测转染前后SiHa细胞增殖和凋亡的变化,流式细胞仪分析细胞周期,实时RT-PCR检测miR-21和PDCD4mRNA水平表达,Western blot检测靶蛋白PDCD4表达。结果 AS-miR-21组与阴性、空白对照组相比,SiHa细胞生长明显抑制,而阴性和空白对照组比较无明显差异;细胞凋亡率分别为(9.7±0.52)%、(3.6±0.17)%和(3.4±0.36)%;细胞周期结果显示AS-miR-21组G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少,与对照组间差异显著(P<0.05);实时RT-PCR结果显示,miR-21表达下降而PDCD4表达升高。Western blot检测结果显示,PDCD4表达AS-miR-21组明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。结论 AS-miR-21可有效抑制miR-21在宫颈鳞癌SiHa细胞中的表达并上调PDCD4基因表达,发挥抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。     

miR-34a通过调控YY1抑制肾癌细胞的增殖及侵袭

目的探讨miR-34a在肾癌组织中表达、miR-34a对人肾癌ACHN细胞增殖和侵袭的影响及调控机制。方法实时聚合酶链反应(PCR)检测miR-34a在20例肾癌及癌旁组织中的表达;采用脂质体转染法将miR-34a mimics转染入肾癌ACHN细胞中,试验分空白对照组、阴性对照组、miR-34a mimics转染组。实时PCR检测转染24 h后miR-34a表达量;噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;Transwell及Matrigel检测细胞侵袭能力;实时PCR和蛋白质印迹(Western blot)技术检测转染后转录因子YY1表达水平。结果与癌旁组织相比,20例癌组织中miR-34a平均表达量为1.06±0.67,显著低于癌旁组织(1.62±0.83,P<0.01);转染后24 h,miR-34a mimics转染组的miR-34a表达量为157.04±13.01,较阴性对照组显著上调(P<0.01);miR-34a mimics转染组细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞生长被阻滞在G0/G1期;细胞侵袭能力明显减弱(P<0.01);转染miR-34a mimics后YY1基因在mRNA表达无明显变化(P>0.05),蛋白水平下调。结论 miR-34a在肾癌中低表达,可能与肾癌的发生有关;miR-34a调控YY1的表达可能是抑制肾癌细胞生物活性的重要机制之一。     

miR-375靶向IGF-1对子宫内膜癌细胞增殖的调控作用

目的探讨miR-375靶向胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对子宫内膜癌细胞增殖的调控作用。方法选择对数生长期的人子宫内膜癌Ishikawa细胞,随机分为5组,模拟剂组转染miR-375模拟剂,模拟剂NC组转染miR-375模拟剂NC,抑制剂组转染miR-375抑制剂,抑制剂NC组miR-375抑制剂NC,对照组为未转染的Ishikawa细胞。利用qRT-PCR技术验证miR-375的表达;利用CCK8及凋亡实验检测Ishikawa细胞增殖及凋亡情况;利用Western blot技术检测IGF-1表达水平。结果转染后48 h与96 h,模拟剂组比模拟剂NC组细胞的增殖能力下降,抑制剂组比抑制剂NC组细胞的增殖能力增强(P0.05)。转染48 h后,模拟剂组、miR-375 NC组、抑制剂组、抑制剂NC组、对照组凋亡率分别为(40.00±3.18)%、(18.19±2.01)%、(7.44±1.11)%、(18.11±1.86)%、(17.22±3.84)%,miR-375 NC组显著低于模拟剂组,抑制剂NC组显著高于抑制剂组(P0.05)。转染48 h后,IGF-1蛋白在模拟剂组、miR-375 NC组、抑制剂组、抑制剂NC组、对照组中的相对表达水平分别为0.45±0.22,1.45±0.14,3.89±0.11,1.66±0.33,1.74±0.32,miR-375 NC组显著高于模拟剂组,抑制剂NC组显著低于抑制剂组(P0.05)。结论过表达的miR-375能抑制子宫内膜癌细胞增殖与促进细胞凋亡,其具体机制可能是miR-375通过负向调控IGF-1的表达而实现。     

miR-577对胶质瘤细胞上皮-间质转化的调控作用及机制

目的探讨miR-577调控胶质瘤细胞上皮-间质转化活性的机制。方法将人源性胶质瘤细胞U87细胞分为miR-577类似物组、miR-577抑制物组和空白对照组,分别转染miR-577 mimic、miR-577 inhibitor和miR577-NC。转染24 h后,采用划痕实验检测各组细胞迁移距离,采用Transwell小室实验检测各组细胞侵袭细胞数,采用反转录PCR法检测各组细胞β-catenin mRNA表达水平,采用Western blot法检测各组细胞vimentin、E-cadherin蛋白相对表达量。结果 miR-577抑制物组、空白对照组、miR-577类似物组细胞迁移距离[(3.44±0.55)、(2.13±0.21)、(1.04±0.14)mm]、侵袭细胞数[(128.50±8.11)、(84.60±4.20)、(39.80±6.01)个]、细胞β-catenin mRNA相对表达量(0.80±0.06、0.61±0.04、0.45±0.06)和vimentin蛋白相对表达量(0.82±0.06、0.67±0.08、0.31±0.02)均依次降低(P0.05),E-cadherin蛋白相对表达量(0.44±0.04、0.76±0.05、0.89±0.08)依次增高(P0.05)。结论 miR-577可能作为抑癌基因,通过阻断Wnt/β-catenin信号通路的活性,降低人源性胶质瘤U87细胞上皮-间质转化活性,从而抑制肿瘤发展。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。     

莪术醇对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖和迁移的影响

【目的】探讨莪术醇对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖和迁移的影响。【方法】10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养小鼠黑色素瘤B16细胞。不同剂量莪术醇(50、100、200μmol/L)处理B 16细胞后,检测细胞增殖、迁移和miR-7-5p含量;miR-7-5p inhibitor预处理后,再用莪术醇100μmol/L处理B16细胞,检测细胞增殖和迁移。【结果】不同剂量莪术醇(50、100、200μmol/L)处理B 16细胞后,细胞490nm吸光度值均低于对照组,且随着莪术醇浓度的增加,细胞490 n m吸光度值降低显著,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同剂量莪术醇(50、100、200μmol/L)处理B 16细胞后,穿膜细胞数均低于对照组,且随着莪术醇浓度的增加,穿膜细胞数降低显著,差异均有统计学意义(P<0.05)。通过real-time PCR验证miR-7-5p inhibitor转染B16细胞后的抑制效果,NC-inhibitor和miR-7-5p inhibitor转染后细胞miR-7-5p表达分别为(1.02±0.10)和(0.41±0.14),差异有统计学意义(P<0.05)。抑制B16细胞miR-7-5p表达后,观察莪术醇对细胞增殖的调控,与NC inhibitor相比(1.413±0.108),miR-7-5p inhibitor升高莪术醇处理B16细胞490nm吸光度值(1.697±0.089),差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】莪术醇能够抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖和迁移,其机制可能与增加miR-7-5p表达有关。     

多囊卵巢综合征患者血清外泌体中miR-184的表达水平及其对卵巢颗粒细胞增殖的影响

目的研究多囊卵巢综合征(PCOS)患者血清外泌体中miR-184的表达水平及其对卵巢细胞颗粒增殖的影响。方法回顾性选取2018年2月至2020年4月期间盘锦辽油宝石花医院收治的60例PCOS患者作为PCOS组,另纳入同期30名健康成年女性作为对照组,提取2组受试者血清外泌体。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测2组受试者血清外泌体中及人卵巢颗粒细胞KGN和人正常卵巢上皮细胞IOSE80中的miR-184的相对表达。转染miR-184抑制剂的KGN细胞设为miR-184抑制剂组,转染抑制剂对照物的KGN细胞设为对照组,不做任何处理的KGN细胞设为空白组。应用MTT法检测各组KGN细胞的增殖情况,应用平板克隆实验检测各组KGN细胞的克隆形成率。结果PCOS患者血清外泌体中和KGN细胞中的miR-184的相对表达量为4.23±0.49、5.81±0.73,显著高于对照组(1.32±0.21)和IOSE80组细胞(1.19±0.15),差异有统计学意义(P<0.05)。miR-184抑制剂组KGN细胞在24、48、72、96 h的吸光度值分别为0.20±0.05、0.22±0.07、0.26±0.08、0.29±0.07,均显著低于阴性对照组(0.31±0.09、0.52±0.11、0.78±0.12、0.96±0.18)和空白对照组(0.31±0.08、0.53±0.10、0.77±0.14、0.94±0.18),克隆形成率(26.78±5.98)%显著低于阴性对照组[(45.98±4.12)%]和空白对照组[(43.56±4.34)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论PCOS患者血清外泌体和人卵巢颗粒细胞KGN中miR-184呈现高表达,PCOS的发病可能与miR-184促进卵巢颗粒细胞增殖有关。     

miR-802对叉头框转录因子M1抑制A549/DDP细胞顺铂耐药性的靶向调控作用

目的探讨miR-802抑制非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性及其对叉头框转录因子M1(forkhead box protein M1, FoxM1)的靶向调控作用。方法 A549、A549/DDP细胞采用反转录PCR法检测miR-802相对表达量。将A549/DDP细胞分为空白转染组和miR-802过表达组(过表达组),分别转染miR-NC和miR-802类似物(miR-802 mimics),转染24、48、72、96 h后,采用反转录PCR法检测2组细胞miR-802相对表达量,并采用CCK-8法检测2组细胞增殖率;转染48 h后,CCK-8法检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性,采用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率和细胞周期,采用Western blot法检测转染后A549/DDP细胞内FoxM1蛋白相对表达量。结果 A549/DDP细胞miR-802相对表达量(0.21±0.03)低于A549细胞(0.85±0.12)(P<0.05);转染24、48、72、96 h,过表达组细胞miR-802相对表达量依次增高(P<0.05),且均高于空白转染组(P<0.05);转染48、72、96 h,空白转染组细胞增殖率依次增高(P<0.05),且均高于过表达组(P<0.05);转染48 h,过表达组细胞半数抑制浓度[(35.28±2.17)mg/L]和细胞早期凋亡率[(17.2±1.1)%]均高于空白转染组[(14.22±1.28)mg/L、(9.0±0.8)%](P<0.05),S期和G2/M期细胞比率[(21.30±0.20)%、(8.35±0.33)%]及细胞内FoxM1蛋白相对表达量(0.21±0.04)均低于空白转染组[(27.54±0.52)%、(14.67±0.70)%、0.44±0.06](P<0.05)。结论 miR-802可能通过抑制FoxM1表达而降低非小细胞肺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性。     

miR-203过表达对结肠癌HT-29细胞紫杉醇化疗敏感性的影响及可能机制

目的采用脂质体转染法制备miR-203过表达结肠癌HT-29细胞,探讨miR-203过表达对结肠癌HT-29细胞紫杉醇化疗敏感性的影响及可能机制。方法取对数生长期结肠成纤维细胞CCD-18Co和结肠癌HT-29细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-203相对表达量。取对数生长期结肠癌HT-29细胞,分为过表达组(转染miR-203-pcDNA 3.1质粒)、空载组(转染NC-pcDNA3.1质粒)和对照组(不作任何干预),采用实时荧光定量PCR法检测3组转染48h时miR-203相对表达量。取转染48h时过表达组、空载组、对照组细胞,用1、5、10、50、100μmol/L紫杉醇处理细胞48h,采用MTT法测定细胞增殖抑制率,并计算3组紫杉醇对细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC₅₀)。转染48h,取对照组细胞分为对照1组和紫杉醇组,取过表达组细胞分为过表达1组和过表达+紫杉醇组,紫杉醇组和过表达+紫杉醇组应用对照组IC₅₀值(28.20μmol/L)浓度的紫杉醇处理,对照1组和过表达1组不进行处理,48h后采用流式细胞术检测4组细胞凋亡,采用Western blot法检测4组细胞磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt、caspase-3蛋白相对表达量。结果结肠癌HT-29细胞miR-203相对表达量(0.38±0.05)低于CCD-18Co细胞(1.01±0.09)(P<0.05)。转染48h,过表达组miR-203相对表达量(1.87±0.11)高于空载组(0.39±0.04)和对照组(0.40±0.05)(P<0.05),空载组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。1、5、10、50、100μmol/L紫杉醇处理48h,过表达组细胞增殖抑制率高于空载组和对照组(P<0.05),IC₅₀值低于空载组和对照组(P<0.05),空载组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。紫杉醇处理48h,过表达1组、紫杉醇组、过表达+紫杉醇组细胞凋亡率[(18.25±1.70)%、(19.11±1.83)%、(57.59±4.31)%]高于对照1组[(8.10±1.14)%](P<0.05),过表达+紫杉醇组高于过表达1组和紫杉醇组(P<0.05),过表达1组与紫杉醇组比较差异无统计学意义(P>0.05)。紫杉醇处理48h,过表达1组、紫杉醇组、过表达+紫杉醇组PI3K(0.81±0.05、0.83±0.05、0.32±0.04)、磷酸化Akt(0.57±0.04、0.55±0.04、0.18±0.03)、caspase-3(0.67±0.13、0.65±0.10、0.19±0.10)蛋白相对表达量低于对照1组(1.12±0.09、0.80±0.06、1.25±0.12)(P<0.05),过表达+紫杉醇组低于过表达1组和紫杉醇组(P<0.05),过表达1组与紫杉醇组比较差异均无统计学意义(P>0.05);4组Akt蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论结肠癌HT-29细胞miR-203呈低表达,过表达miR-203可提高结肠癌HT-29细胞对紫杉醇的敏感性,促进HT-29细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K、caspase-3激活及Akt磷酸化有关。     

神经肽因子对疱疹病毒性角膜基质炎小鼠眼表修复的影响及相关机制

目的探讨神经肽因子对疱疹病毒性角膜基质炎小鼠眼表修复的影响及相关机制。方法通过双眼角膜基质注射建立疱疹病毒性角膜基质炎小鼠模型,共42只,随机平分为模型组、阿昔洛韦组与神经肽因子组,各14只。3组分别在建模14 d分别多点皮下注射5μL的0.9%氯化钠溶液、5μL 10 mg/mL阿昔洛韦、5μL 10 mg/mL神经肽因子,1周1次,连续应用4次。采用角膜基质浑浊及新生血管评分标准对各组小鼠进行评分;采用酶联免疫试验法检测血清白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)含量;采用流式细胞仪检测CD4⁺T淋巴细胞比率;采用蛋白质印迹(Western blotting)法检测血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达水平。结果阿昔洛韦组与神经肽因子组治疗第2周与第4周的角膜基质浑浊及新生血管评分、血清IL-6和IL-8含量低于模型组[(5.25±0.23)、(5.21±0.18)分;(56.33±3.14)、(56.98±1.58)μg/L;(78.28±3.22)、(78.19±2.22)μg/L],神经肽因子组[(1.20±0.15)、(0.78±0.14)分;(10.38±2.11)、(7.09±1.29)μg/L;(10.76±0.87)、(8.17±0.82)μg/L]低于阿昔洛韦组[(2.48±0.11)、(2.00±0.14)分;(23.09±1.22)、(18.09±2.15)μg/L;(34.09±3.76)、(24.98±2.76)μg/L],差异均有统计学意义(P<0.05)。阿昔洛韦组与神经肽因子组全血组织CD4⁺T淋巴细胞比率高于模型组[(33.78±1.35)%],神经肽因子组[(54.09±2.57)%]高于阿昔洛韦组[(48.82±1.68)%],差异有统计学意义(P<0.05)。阿昔洛韦组(2.10±0.14)与神经肽因子组(1.09±0.21)治疗第4周的VEGF蛋白相对表达水平低于模型组(5.21±0.13),神经肽因子组低于阿昔洛韦组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论神经肽因子对疱疹病毒性角膜基质炎小鼠的应用能促进眼表修复,抑制炎性因子的表达,改善小鼠的免疫功能,其作用机制可能与抑制VEGF蛋白表达有关。     

miR-645调控干扰素诱导蛋白2对肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制

目的探讨miR-645对干扰素诱导蛋白2(interferon inducible protein 2, IFIT2)的表达以及对肺癌细胞增殖、侵袭的影响。方法采用反转录PCR法检测肺癌组织和细胞以及配对的正常组织和细胞中miR-645相对表达量。对数生长期人肺癌细胞H460分为对照组和转染组,分别转染NC mimic和miR-645 mimic,采用CCK-8法检测2组细胞增殖率,采用Transwell小室实验检测2组细胞侵袭率;采用荧光素酶报告基因实验检测2组细胞miR-645和IFIT2的结合活性;采用反转录PCR法检测2组细胞miR-645和IFIT2 mRNA相对表达量。结果肺癌组织(3.25±0.25)和肺癌细胞(2.85±0.22)miR-645相对表达量均高于正常肺组织(1.00±0.12)和正常肺上皮细胞(1.00±0.08)(P<0.05);转染组细胞增殖率[(220±12)%]、细胞侵袭率[(65.6±5.2)%]均高于对照组[(100±8)%、(25.9±3.2)%](P<0.05);转染组野生型3’UTR(WT-IFIT2)相对荧光素酶活性(0.48±0.06)低于对照组(1.00±0.12)(P<0.05),突变型3’UTR(MUT-IFIT2)相对荧光素酶活性(1.12±0.09)与对照组(1.00±0.08)比较差异无统计学意义(P>0.050);转染组细胞IFIT2 mRNA相对表达量(0.32±0.05)低于对照组(1.00±0.10)(P<0.05),miR-645在肺癌细胞中表达水平与IFIT2呈负相关(r=-0.743,P<0.001)。结论 miR-645可促进肺癌细胞H460的增殖和侵袭,其作用机制是通过调控IFIT2的表达而实现。     

miR-145通过调控MMP-2、MMP-9的表达对卵巢癌细胞调亡、增殖、迁移的影响

目的研究微小RNA-145(miR-145)通过调控基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达对卵巢癌细胞调亡、增殖、迁移的影响。方法将卵巢癌细胞株随机分为3组,其中对照组为单纯卵巢癌细胞株,不做其他处理,进行正常培养;miR-145组为含miR-145质粒的慢病毒转染的卵巢癌细胞株;NC组为含NC质粒的慢病毒转染的卵巢癌细胞株。检测3组卵巢癌细胞的凋亡、增殖、迁移情况。检测3组MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达水平。结果与对照组、NC组比较,miR-145组卵巢癌细胞凋亡率明显升高,卵巢癌细胞增殖数、迁移数明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);对照组与NC组卵巢癌细胞凋亡率、增殖数、迁移数差异无统计学意义(P>0.05)。miR-145组MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达水平均低于NC组、对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组与NC组MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-145可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移,促进调亡,其作用机制可能与miR-145能降低MMP-2、MMP-9的表达有关。     

狼疮性肾炎患者血清白细胞介素-32及肾损伤分子-1水平变化

目的探讨狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)患者血清白细胞介素-32(interleukin-32,IL-32)、肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)水平变化及意义。方法80例LN患者,根据系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)分为活动期组(SLEDAI评分≥5分)49例和非活动期组(SLEDAI评分<5分)31例,同期体检健康者50例为对照组。检测3组血清IL-32、KIM-1及血肌酐(serum creatinine,SCr)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR),免疫比浊法检测24 h尿蛋白,计算估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR);Pearson相关法分析LN患者血清IL-32、KIM-1与SCr、24 h尿蛋白、ESR、eGFR的相关性;ROC曲线分析血清IL-32、KIM-1单独及联合诊断LN活动期的价值。结果活动期组、非活动期组、对照组血清IL-32[(6.51±0.89)、(3.87±0.92)、(1.39±0.78)ng/L]、KIM-1[(16.28±2.97)、(10.14±3.11)、(5.75±2.64)μg/L]、SCr[(280.22±19.72)、(165.93±16.08)、(52.16±18.57)μmol/L]及24 h尿蛋白[(116.40±6.83)、(62.57±6.19)、(34.58±7.06)g/L]均逐渐降低(P<0.05),ESR[(9.64±2.08)、(5.87±1.93)、(3.04±1.55)mm/h]逐渐减慢(P<0.05),eGFR[(42.16±6.58)、(70.33±7.22)、(97.64±7.83)mL/(min·1.73 m^2)]逐渐增高(P<0.05);Pearson相关分析结果显示,活动期组血清IL-32与SCr、24 h尿蛋白、ESR呈正相关(r=0.637,P=0.002;r=0.549,P=0.013;r=0.765,P<0.001),与eGFR呈负相关(r=-0.782,P<0.001);血清KIM-1与SCr、24 h尿蛋白、ESR呈正相关(r=0.609,P=0.001;r=0.561,P=0.006;r=0.708,P<0.001),与eGFR呈负相关(r=-0.736,P<0.001);非活动期组血清IL-32与SCr、24 h尿蛋白、ESR呈正相关(r=0.609,P=0.004;r=0.561,P=0.008;r=0.722,P<0.001),与eGFR呈负相关(r=-0.764,P<0.001),KIM-1与SCr、24 h尿蛋白、ESR呈正相关(r=0.573,P=0.003;r=0.509,P=0.009;r=0.671,P<0.001),与eGFR呈负相关(r=-0.718,P<0.001);ROC曲线分析结果显示,血清IL-32以2.64 ng/L为最佳截断值诊断LN活动期的AUC为0.852(95%CI:0.783~0.921,P<0.001),灵敏度和特异度分别为79.59%和83.87%,准确率为81.25%;血清KIM-1以8.85μg/L为最佳截断值诊断LN活动期的AUC为0.896(95%CI:0.833~0.959,P<0.001),灵敏度和特异度分别为83.67%和90.32%,准确率为86.25%;血清IL-32联合KIM-1诊断LN活动期的AUC为0.963(95%CI:0.928~0.998,P<0.001),灵敏度和特异度分别为89.90%和96.77%,准确率为92.50%。结论LN患者血清IL-32、KIM-1升高,且与病情严重程度相关,可作为诊断LN活动期的分子标志物。     

急性胰腺炎患者血清Toll样受体9和基质金属蛋白酶-9与继发感染及器官功能衰竭的相关性

目的观察急性胰腺炎患者血清Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)水平变化,探讨其预测继发感染、器官功能衰竭的价值。方法72例急性胰腺炎患者,均给予改善微循环、解痉止痛、抑制胰酶分泌、抗感染等规范治疗。治疗7d后,发生继发感染者31例为感染组,未发生继发感染者41例为未感染组;发生器官功能衰竭者8例为衰竭组,未发生器官功能衰竭者64例为未衰竭组。比较感染组与未感染组、衰竭组与未衰竭组一般资料及血清TLR9、MMP-9、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;多因素logistic回归分析急性胰腺炎患者发生继发感染及器官功能衰竭的影响因素;绘制ROC曲线评估血清TLR9、MMP-9预测急性胰腺炎患者继发感染及器官功能衰竭发生风险的效能。结果感染组与未感染组,衰竭组与未衰竭组年龄、性别比例及合并糖尿病、高血压、高脂血症比率比较差异均无统计学意义(P>0.05);感染组血清TLR9[(17.30±2.37)μg/L]、MMP-9[(29.42±9.82)μg/L]、TNF-α[(66.40±5.37)μg/L]水平高于未感染组[(14.49±1.71)、(17.02±4.02)、(63.22±1.79)μg/L](P<0.05),血清IL-6[(56.45±4.32)μg/L]水平与未感染组[(57.21±4.29)μg/L]比较差异无统计学意义(P>0.05);衰竭组血清TLR9[(19.23±2.12)μg/L]、MMP-9[(65.56±30.91)μg/L]、IL-6[(59.67±7.60)μg/L]水平高于未衰竭组[(15.07±2.13)、(23.57±18.63)、(54.11±2.11)μg/L](P<0.05),血清TNF-α[(62.35±3.23)μg/L]水平与未衰竭组[(61.95±3.18)μg/L]比较差异无统计学意义(P>0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,血清TLR9(OR=1.558,95%CI:1.428~2.727,P<0.001)、MMP-9(OR=1.818,95%CI:1.748~1.895,P<0.001)、TNF-α(OR=1.372,95%CI:1.211~1.979,P<0.001)是急性胰腺炎患者发生继发感染的影响因素;血清TLR9(OR=1.942,95%CI:1.933~3.012,P<0.001)、MMP-9(OR=1.978,95%CI:1.926~3.969,P<0.001)、IL-6(OR=1.950,95%CI:1.929~2.971,P<0.001)是急性胰腺炎患者发生器官功能衰竭的影响因素。ROC曲线分析结果显示,TLR9以18.134μg/L为最佳截断值,预测急性胰腺炎患者继发感染发生风险的AUC为0.806(95%CI:0.700~0.911,P<0.05),灵敏度为87.1%,特异度为97.6%;MMP-9以32.635μg/L为最佳截断值,预测急性胰腺炎患者继发感染发生风险的AUC为0.819(95%CI:0.708~0.929,P<0.05),灵敏度为83.9%,特异度为95.1%;TLR9以20.216μg/L为最佳截断值,预测急性胰腺炎患者器官功能衰竭发生风险的AUC为0.824(95%CI:0.722~0.926,P<0.05),灵敏度为88.0%,特异度为97.9%;MMP-9以70.123μg/L为最佳截断值,预测急性胰腺炎患者器官功能衰竭发生风险的AUC为0.840(95%CI:0.725~0.955,P<0.05),灵敏度为84.0%,特异度为95.7%。结论发生继发感染、器官功能衰竭的急性胰腺炎患者血清TLR9、MMP-9水平升高,TLR9、MMP-9在评估急性胰腺炎患者预后中有较高价值。