过量氟对大鼠体内、外I型胶原蛋白的影响

为研究过量氟对大鼠骨中I型胶原蛋白的影响 ,经饮水投氟复制大鼠氟中毒模型 (NaF 2 2 1mg L) ,测定氟中毒大鼠血清中骨钙素含量 ,骨中无机质、胶原含量和胶原交联度 ;酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞 ,经 0 5mmol L和 1 0mmol LNaF染毒 4 8h后 ,用免疫组化方法观察过量氟对成骨细胞I型胶原表达水平的影响。结果表明 :大鼠染毒两个月后 ,氟中毒大鼠血清骨钙素含量、骨中无机质百分含量较对照组显著增加 (P<0 0 5 ) ;骨中胶原含量、胶原交联度较对照组显著下降 (P <0 0 5 ) ;体外成骨细胞染氟后 ,I型胶原蛋白分泌明显减少。提示过量氟可抑制I型胶原蛋白的合成 ;胶原蛋白减少是导致氟骨症的原因之一     

染氟成骨细胞内质网应激分子及骨转化功能的变化

目的了解氟致成骨细胞内质网应激状态时成骨细胞分化相关基因的表达情况。方法用原代培养的人成骨细胞建立染氟模型,流式细胞仪测定凋亡指数,并提取RNA后用PCR芯片分别检测未折叠蛋白反应和骨分化相关基因的表达情况。结果氟能够引起成骨细胞内质网应激,引起15个基因表达上调,1个基因表达下调,其中涉及内质网应激PERK、IRE1和ATF6三条信号途径。骨分化方面有32个基因表达上调,2个基因表达下调,涉及胶原、基质金属蛋白酶、整合素、骨形态发生蛋白、血管生长因子、肿瘤坏死因子等基因。结论氟引起成骨细胞内质网应激的同时,对骨转化基因的表达也产生影响。     

亚慢性氟中毒对大鼠骨组织Runx2 mRNA表达的影响

目的观察亚慢性氟中毒对大鼠骨组织中转录因子Runx2 mRNA表达的影响,探讨Runx2在氟骨症发生中的可能作用。方法 40只Wistar大鼠按体重随机分成4组,染氟组大鼠饮用含氟50、100、150 mg/L的自来水,对照组大鼠饮用自来水;3个月后测定大鼠血清及骨组织氟含量,并采用SYBR Green Real-time RT-PCR法检测骨组织中Runx2 mRNA表达情况,同时观察骨组织病理学改变。结果 HE染色显示染氟组大鼠呈现骨皮质增厚、骨小梁增多等骨硬化表现;染氟组大鼠骨组织中Runx2 mRNA表达显著高于对照组,且随染毒剂量升高,表达亦逐渐升高。结论过量的氟可能通过增加骨组织Runx2基因表达水平来促进间充质干细胞向成骨细胞系分化,使骨形成增加。     

氟对体外培养大鼠成骨细胞钙调蛋白表达影响

目的观察不同浓度的氟在不同时间段对体外培养大鼠成骨细胞的钙调蛋白（CaM）的影响。方法采用骨组织块法分离培养新生Wistar大鼠颅骨成骨细胞,将不同浓度的氟作用于大鼠成骨细胞,分别于染氟培养24,36和48h采用免疫细胞化学法检测CaM蛋白的表达。结果在染氟培养24h,与对照组比较,0.5mg/L氟组成骨细胞CaM蛋白的表达明显增加,2mg/L氟组CaM蛋白的表达明显减少;染氟培养36h,与对照组比较,2mg/L氟组CaM蛋白表达明显增加,8mg/L氟组CaM蛋白的表达明显减少;而在染氟培养48h,各氟组CaM蛋白的表达较对照组均显著增加。结论氟在一定浓度、时间范围内对成骨细胞的CaM蛋白表达影响的表现为先抑制后促进的作用。     

氟中毒相关基因对患者蛋白质合成的影响

目的:探讨慢性氟中毒相关基因对患者蛋白质合成的影响。方法:利用cDNA基因芯片技术筛选氟中毒患者和正常对照者外周血淋巴细胞差异表达基因,结果输入Pathway3.0分析软件进行数据处理,用T-test检验初筛,Ratio值进一步筛选,在GenBank进行同源性比较后确认筛选基因。结果:轻度氟中毒组和重度氟中毒组分别与对照组比较,有2个基因表达同时出现显著上调(Ratio值为2.0462~2.9936);有14个基因表达同时出现显著下调(Ratio值为0.0918~0.5034),其中包括与蛋白质合成有关的3个基因:线粒体翻译起始因子2(MTIF2)、单链DNA结合蛋白(PURA)和细胞毒颗粒相关蛋白(TIA1)。结论:高氟可以对人体基因表达水平产生一定影响,尤其是MTIF2、PURA和TIA1基因的持续显著下调对基因转录、翻译等蛋白合成过程将产生一定的影响。     

氟对原代培养的大鼠成骨细胞分化相关指标的影响

目的研究氟对原代培养的大鼠成骨细胞的细胞活性及对成骨细胞分化相关指标的影响。方法取出生24 h内的大鼠胎鼠的颅盖骨,采用胰酶和Ⅱ型胶原酶交替消化的方法获得原代成骨细胞。分别加入终浓度为0(对照组)、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L氟化钠进行染毒72 h,采用MTT法检测细胞活性;染氟72 h后,采用Real-time RT-PCR法检测成骨细胞分化标志物COL1A1、ALP和ON mRNA的表达情况;染氟5 d后,采用染色法检测成骨细胞ALP蛋白的表达情况。结果与对照组相比,10-6~10-4 mol/L染氟组成骨细胞存活率及10-7~10-5 mol/L染氟组成骨细胞ALP蛋白的表达水平均较高,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);且随着NaF染毒浓度的升高,成骨细胞存活率和ALP蛋白的表达水平均呈先升高后下降的趋势。与对照组相比,各浓度NaF染毒组成骨细胞ALP、ON mRNA的表达水平及10-7、10-6 mol/L NaF染毒组成骨细胞COL1A1 mRNA的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论本实验条件下,较低剂量的氟可促进大鼠成骨细胞的分化。     

实验性氟中毒骨组织中Ⅱ型胶原基因表达及结构的改变

目的 观察过量氟对大鼠骨组织中Ⅱ型胶原基因表达的影响和对大鼠骨骼中胶原类型及胶原结构的作用。方法 制备Ⅱ型胶原cDNA探针，采用cDNA-mRNA原位杂交技术，检测饮用过量氟水(氟化钠221mg／L)的大鼠骨组织中Ⅱ型胶原的改变。采用苦味酸天狼星红染色—偏振光法对骨组织中胶原类型及胶原纤维结构进行观察。结果 染氟后，股骨等骨组织出现成软骨细胞。cDNA-mRNA原位杂交显示，软骨化的骨组织软骨陷窝的软骨胞质中可见Ⅱ型胶原基因表达。染氟0．5个月组肋软骨软骨细胞胶原mRNA水平最高，其灰度值和标准误分别为0．086和0．013，染氟1个月及2个月后逐渐减弱，其灰度值和标准误分别为0．047、0．008和0．039、0．007。苦味酸天狼星红染色-偏振光法观察骨组织中出现多色性Ⅱ型胶原纤维，胶原纤维断裂、排列紊乱、含量下降。结论 过量氟可致骨组织中胶原类型和胶原结构的改变，导致Ⅱ型胶原在软骨化骨组织中的表达及在肋软骨组织中的表达增强。     

亚慢性氟染毒对大鼠骨组织病理改变和β-连环蛋白表达的影响

目的观察亚慢性氟染毒对大鼠骨组织中β-连环蛋白表达的影响,探讨β-连环蛋白在氟致骨损伤中的可能作用。方法 40只Wistar大鼠按体重随机分成4组,染氟组大鼠饮用含氟50、100和150mg/L的自来水,对照组大鼠饮用自来水,3个月后测定大鼠血清及骨组织氟含量,Real-time RT-PCR法和免疫组化法检测骨组织中β-连环蛋白mRNA和蛋白质表达情况。结果 HE染色显示染氟组大鼠病理学改变呈现骨皮质增厚、骨小梁增多等骨硬化表现,骺板肥大软骨细胞大量堆积且排列紊乱。染氟组大鼠骨组织中β-连环蛋白mRNA表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),而且随染毒剂量升高,β-连环蛋白mRNA表达逐渐升高。免疫组化显示染氟组大鼠骨组织中β-连环蛋白主要由成骨细胞和破骨细胞表达,骺板软骨肥大细胞也有阳性表达。结论β-连环蛋白在亚慢性氟染毒大鼠骨质硬化的发生中发挥重要作用。     

过量摄入氟后激活的成骨细胞系中原癌基因的表达

目的 研究在体内外过量氟作用下激活的成骨细胞系中原癌基因c-fos和其伴随基因c-jun的表达。方法 在饮水中加入氟化钠(NaF)进行大鼠染毒实验,在体外成骨样细胞培养液中加入氟化钠进行染氟实验,采用原位杂交技术、Western印迹技术和免疫组织化学方法对氟中毒大鼠骨组织进行c-fos、c-jun的mRNA水平、蛋白质水平的定量分析和成骨样细胞染氟后不同时间c-fos、c-jun mRNA的定量分析。结果 NaF可刺激慢性氟中毒大鼠椎骨各包被成骨细胞增殖,并诱导c-fos、c-jun的表达。高钙加氟组c-fos、c-jun mRNA表达的吸光度值分别为107．74和117．48,明显低于高钙对照组的139．63和126．37。免疫组化分析结果显示,高钙加氟组c-fos、c-jun蛋白水平(吸光度值分别为140．73和134．03)明显低于高钙对照组,低钙加氟组c-fos、c-jun mRNA和蛋白表达(吸光度值分别为117．24、111．46、132．46和129．79)明显低于低钙对照组(吸光度值分别为139．16、131．15、149．98和149．19),差异有显著性。Western印迹技术检测NaF各组骨外膜成骨细胞系细胞c-fos、c-jun的蛋白水平明显低于各自的对照组,吸光度值分别为123．32、116．60、115．97和108．30。成骨样细胞染氟12h,c-fos、c-jun mRNA含量明显增高,48h仍不见减少,其吸光度值分别为114．80、161．14、118．20和150．41,与对照组比较差异非常显著。结论 过量氟可以刺激大鼠成骨细胞系和培养的成骨样细胞激活,增殖能力增强,c-fos、c-jun在mRNA和蛋白质水平的表达增强,c-fos过表达在氟骨症骨相损害的发生发展中可能起重要的作用。     

实验性氟暴露对成骨细胞成骨功能表达的影响

我国不仅地方性氟病流行区域广 ,患者多 ,工业氟暴露对工人健康的影响也较明显。过量的氟摄入可引起全身骨及其他组织损害[1] 。其异常改变与氟中毒导致骨形成及骨矿化异常有关 ,但其机制尚不清楚。我们拟通过离体ＳＤ大鼠成骨细胞培养 ,研究过量氟对成骨细胞成骨活性的影响 ,从而在细胞学水平了解氟骨症的机制。碱性磷酸酶 (ＡＬＰ)和骨钙素 (ＯＣ)是成熟成骨细胞合成和分泌的两种主要的非胶原蛋白 ,代表成骨细胞活性状态 ,是检测骨形成的指标。因此 ,我们通过成骨细胞ＡＬＰ活力及细胞培养液中ＯＣ水平测定 ,了解氟过量对骨形成过程的影响…     

Effect of oxidative stress on fluoride-induced apoptosis in primary cultured Sertoli cells of rats

This study examined the effect of oxidative stress on the apoptosis of Sertoli cells induced by sodium fluoride (NaF). Cell viability, reactive oxygen species, malondialdehyde content, superoxide dismutase activity, mitochondrial membrane potential, and apoptosis were measured after the rat Sertoli cells were exposed to various concentrations of (0, 6, 12, and 24?μg/ml) sodium fluoride in the presence and absence of 2?mM N-acetylcysteine (NAC) for 24?h. The present study showed that decrease in cell viability and excessive oxidative stress were observed in NaF-treated cells. The treatment with NAC restored the decreased cell viability and excessive oxidative stress. Moreover, fluoride exposure decreased mitochondrial membrane potential and increased apoptosis in Sertoli cells. NAC was also found to suppress a loss of mitochondrial membrane potential and the percentage of apoptosis in NaF-treated Sertoli cells. This study proved that oxidative stress probably play a major role in NaF-induced apoptosis of Sertoli cells.     

氟化钠对乳鼠成骨细胞c—fos,c—jun基因表达及细胞增殖？…

目的 探讨氟对钠（ＮａＦ）对离体成骨细胞ｃ－Ｆｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ基因表达的调控及细胞增殖的影响。方法 采用新生大鼠头盖骨分离成骨细胞,在不同浓度ＮａＦ（１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ、１０＾－４ｍｏｌ／Ｌ、１０＾－３ｍｏｌ／Ｌ）中进行培养,用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞增殖,用免疫组化ＳＰ法结合计算机图像处理系统检测ＮａＦ诱导的ｃ－Ｆｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ表达。结果 实验表明ＮａＦ可刺激成骨细胞增殖,并诱导成骨细胞     

氟对saos-2细胞体外增殖的影响

目的探索无血清条件下不同剂量的氟对成骨细胞增殖活性的影响,及以转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）和骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）表达水平间接反映氟对成骨细胞在骨重建过程中的功能的影响。方法以四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）和AlamarBlue法测定氟作用下细胞的增殖。用反转录聚合式酶链反应观察TGF-β1和BMP-2表达水平。结果与对照组相比,氟化钠浓度≤40mg/L时,对细胞均呈现出增殖作用。其中以10mg/L组的促增殖作用最强。当氟化钠浓度〉40mg/L时,对细胞以抑制作用为主。两种方法的结果相似。与管家基因β-actin相比较,随氟化钠浓度增高,TGF-β1表达有逐渐增强的趋势,尤其是在80、160mg/L表达最强。BMP-2表达则呈现出在2.5～20mg/L表达明显较对照强,而40、80、160mg/L剂量组的表达较弱。结论氟化钠具有高剂量抑制细胞增殖的作用。即在过量氟作用下正常的成骨细胞合成和分解骨的因子间失去协同一致,偏离正常的动态平衡。     

大鼠成骨细胞系ROB-1的建立及氟对其DNA损伤的实验研究

目的 建立永生化大鼠成骨细胞系ROB－1并探讨氟对其DNA的损伤。方法 用酶消化法原代分离SD胎鼠颅骨成骨细胞，用Lipofect AMINE作载体对其转染SV40大T基因，并经PCR法鉴定大T细胞整合情况。采用碱性磷酸酶染 鉴定转染细胞系中成骨细胞的纯度；采用单细胞凝胶电泳（SCGE）方法检测2.0-3.0mmol/L氟化钠染毒24h对成骨细胞DNA损伤情况。结果 转染后成骨细胞的基因组中整合有SV40 T基因，碱性磷酸酶染色阳性细胞占95％以上；单细胞凝胶电泳发现NaF可不同程度地诱导细胞DNA链断裂，与溶剂对照组相比，各剂量组DNA断裂细胞百分率彗尾长度均有统计学意义的增加（P＜0.05）。结论 建立了永生化大鼠成骨细胞系ROB－1；氟对成骨细胞DNA有损伤作用。     

Expression of type II collagen gene and structural change in bone tissues of rats with experimental fluorosis

OBJECTIVE: To investigate the effects of excessive intake of fluoride on the expression of type II collagen gene and types and morphological change of collagen fiber in the bone tissues of rats. METHODS: A rat model with fluorosis was established by adding 221 mg/L of sodium fluoride (NaF) to drinking water for the rats for 15 days, 30 days and two months, respectively. Type II collagen alpha1 (II) cDNA probe was prepared, and cDNA-mRNA in-situ hybridization was employed to detect change in expression of type II collagen mRNA in the bone tissues of rats with excessive intake of fluoride (221 mg/L NaF). Picrosirius-polarization method was used to observe types of collagen and morphology of collagen fiber in the bone tissues. RESULTS: Chondroblasts were found in the femur and other bone tissues of the rats after exposure to fluoride. cDNA-mRNA in-situ hybridization showed that expression of type II collagen gene could be observed in the cytoplasm of chondrocytic lacuna and chondrified bone tissues. mRNA in collagen of chondrocytes of the rib cartilage reached the peak level 15 days after exposure to fluoride, and decreased gradually one month and two months after exposure. Polychromatic type II collagen, breakage of collagen fiber, disorder array and reduced content of type II collagen could be found in the bone tissues with picrosirius-polarization method. CONCLUSIONS: Excessive intake of fluoride could lead to changes in types and structure of collagen (cross-linkage) of bone tissues, which caused expression of type II collagen gene in the chondrified bone tissues and enhanced its expression in the rib cartilage tissues.     

持续氟铝联合暴露对子代大鼠骨组织蛋白激酶R样内质网激酶-酸化真核细胞起始因子2α-激活转录因子4信号通路的影响

目的了解妊娠期、哺乳期及成年前持续氟铝联合染毒对子代大鼠骨组织内蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-酸化真核细胞起始因子2α(e IF2α)-激活转录因子4(ATF4)信号通路的影响。方法将36只健康成年清洁级SD孕鼠随机分为9组,分别为对照(自来水)组和氟化钠(60、240 mg/L)组、氯化铝(600、1 000 mg/L)单独染毒组及氟化钠+氯化铝联合染毒组,每组4只。采用自由饮水方式染毒,母鼠从妊娠第0天至子代大鼠出生第21天(postnatal day 21,PND21)染毒;每组随机选取8只子代大鼠继续以同组剂量染毒至PND90。染毒结束后,收集大鼠骨组织,以qRT-PCR法检测骨组织中ATF4和e IF2α的mRNA表达水平,ELISA测定骨组织中p-PERK、ATF4蛋白含量。结果与对照组比较,除低铝、高氟+低铝联合染毒组外,其余各染毒组子代大鼠骨组织中p-PERK蛋白含量明显升高(P0.05);低氟组和低氟+高铝联合染毒组的ATF4蛋白含量高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。氟铝联合染毒对p-PERK蛋白含量的影响表现为拮抗型交互作用(P0.05);ATF4蛋白含量除高氟+低铝联合染毒组表现为协同型交互作用外,其他联合染毒组均表现为拮抗型交互作用(P0.05)。除低氟组大鼠骨组织中e IF2αmRNA的表达明显升高外,其余染毒组明显降低(P0.05)。除高氟+低铝联合染毒组大鼠骨组织中ATF4的mRNA表达明显升高外,其余各染毒组明显降低(P0.05)。单独高氟或高铝染毒组比单独的低氟或低铝染毒组ATF4 mRNA表达量高,差异有统计学意义(P0.05)。氟铝联合染毒对e IF2α及ATF4 mRNA表达水平的影响存在拮抗型交互作用(P0.05)。结论氟铝联合可通过亲代胎盘屏障、乳汁及子代大鼠自身摄入等途径进入子代大鼠体内,诱发骨细胞内质网应激,PERK-e IF2α-ATF4信号通路参与了氟铝联合持续暴露的子代大鼠骨损伤机制。     

氟对大鼠成骨细胞SPARC mRNA及其蛋白表达的影响

目的观察慢性氟中毒时大鼠成骨细胞中成骨相关蛋白SPARC mRNA及其蛋白表达水平的影响,并探讨SPARC在氟骨症发病机制中的可能作用。方法 36只健康SD大鼠按体重、性别随机分3组,对照组自由饮用自来水(氟<1mg/L),低、高氟组分别饮用添加氟化钠5、50mg/L的自来水。饲养8个月后,股动脉放血处死大鼠,用氟离子选择电极法测各组尿氟、骨氟含量。HE染色后光镜下观察股骨下段骨组织的病理学改变及形态计量学测量。免疫组织化学和原位杂交技术检测成骨细胞中SPARC蛋白及其mRNA的表达水平。结果低氟组大鼠尿氟、骨氟含量[(6.09±0.56)mg/L、(12.65±3.07)μg/g]显著高于对照组[(1.36±0.51)mg/L、0.67±0.16)μg/g],差异有统计学意义(P均<0.05),高氟组[(7.69±0.64)mg/L、(26.53±5.88)μg/g]较低氟组升高,差异有统计学意义(P均<0.05)。染氟组大鼠股骨下段呈骨质硬化表现。低氟组大鼠SPARC蛋白及其mRNA表达水平(125.24±1.91、100.90±1.13)明显高于对照组(109.70±1.70、88.03±1.26),差异有统计学意义(P均<0.05),高氟组(139.47±1.03、119.22±1.23)较低氟组升高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论过量氟可通过上调大鼠成骨细胞中SPARC蛋白及其mRNA表达水平来调节成骨细胞的增殖、分化、成熟等过程,使骨形成增加,表现为骨硬化型。