慢病毒介导骨形成蛋白-2基因转染骨髓间质干细胞修复大鼠颅骨骨缺损

目的 观察携带人骨形成蛋白-2(hBMP-2)基因的慢病毒(lentivirus)转染骨髓间质干细胞构建的组织工程化骨对大鼠颅骨极量骨缺损的修复效果. 方法 300～350g雄性 SD大鼠取股骨骨髓体外培养扩增骨髓间质干细胞(BMSC),以lentivirus载体介导hBMP-2基因转染BMSC,诱导其向成骨细胞分化.将细胞接种于经纤维连接蛋白修饰的β-磷酸三钙(β-TCP),共同培养10d.30只大鼠均造成颅骨极量缺损(直径8mm)模型,分为Lev- BMP2转染细胞+β-TCP组(A组:n=10);BMSC +β-TCP组(B组:n=10);β-TCP组(C组:n=10)于第4、8、12、20周从影像学及组织学角度观察比较颅骨缺损修复情况.结果 无论X线摄片及组织切片均表明,A组颅骨骨缺损修复优于同期的B组和C组.在各时间点A组和B组在植骨区均有新骨形成,而C组仅见边缘区成骨.术后20周新生骨小梁相对体积(TBV,%)A组为(60.83±11.49),B组为(40.37±9.02),C组为(18.37±6.02),差异有统计学意义(P<0.01). 结论 Lev- BMP2转染BMSC复合β-TCP构建的组织工程化骨对大鼠颅骨极量骨缺损有较好的修复效果.     

BMSC向成骨细胞分化的信号传导通路

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)是一种多潜能干细胞,具有向成骨细胞分化的能力.在BMSC向成骨细胞分化中,有膜内成骨和软骨内成骨2条途径,而且受到众多信号传导通路调控.本文结合相关文献,简要介绍BMWSmads、Runx2/osterix、Hedgehog、Wnt/β-Catenin和MAPK信号传导通路.     

高糖对骨形态发生蛋白-2、胰岛素样生长因子-1基因转染大鼠骨髓基质干细胞增殖的影响

目的 观察高糖环境下骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)后BMSC的增殖.方法 用Ad-BMP-2和Ad-IGF-1转染大鼠BMSC,Wester blot检测蛋白表达.噻唑蓝(MTT)比色法及流式细胞术检测细胞增殖.结果 Western blot检测到转染组细胞中有目的 蛋白表达.MTT结果显示第5天细胞增殖能力达到高峰,5 d光吸收值:A～E组分别为0.324±0.027、0.319±0.017、0.622±0.028、0.626±0.020、0.778±0.031.流式细胞术结果显示A～E组细胞处于增殖期的比重分别为23.92±3.07、23.51±2.11、34.37±6.85、35.04±1.45、42.56±1.15.结论 高糖环境下BMP-2和IGF-1基因转染均能促进BMSC增殖,联合转染对BMSC增殖有协同效应.

Abstract：

Objective To observe the proliferation of bone marrow stromal cell (BMSC) transfected by bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and insulin-like growth factor-1 ( IGF-1 ) gene under high glucose condition.Methods Ad-BMP-2 and Ad-IGF-1 transfected rat BMSC,protein expression of BMSC were detected by Western blotting analysis.Methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay and flow cytometry to observe the proliferation potential of BMSC.Results In the Western blotting analysis,positive signal lane of protein was observed in transfected group.MTT assay show that proliferation reached the peak in all groups on the fifth day,and the absorbency values of A to E group were 0.324 ± 0.027,0.319 ± 0.017,0.622 ±0.028,0.626 ± 0.020,0.778 ± 0.031.Flow cytometry show that the proliferative percentage from A to E group were 23.92 ±3.07,23.51 ±2.11,34.37 ±6.85,35.04 ± 1.45,42.56 ± 1.15.Conclusion BMP-2 or IGF-1 can promote the proliferation of BMSC under high glucose condition,but the combined has the synergy effect.     

骨髓间充质干细胞外泌体在骨质疏松中的研究进展

骨质疏松症(osteoporosis,OP)的发病与骨代谢平衡的破坏有关,骨吸收作用增强,骨形成作用不足,骨稳态发生改变,均会引起骨质疏松。成骨不足与骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BMSC)分化方向密切相关。BMSC向成骨分化方向减少、成脂分化增多是骨质疏松症发病的重要机制,因此,寻找决定BMSC分化方向的关键因子为OP的研究和治疗提供了新思路。外泌体是由细胞分泌到胞外的膜性囊泡,富含不同种类的核酸、蛋白质、脂质和信号分子等多种生物学活性物质,参与调节和完成细胞间的信息交流与传递,影响胞内信号转导发挥生物学功能。研究表明, BMSC来源的外泌体可有效改善骨质疏松症状,促进BMSC增殖、成骨分化及骨再生。本文对BMSC来源的外泌体应用于OP的研究进展进行综述,旨在为今后的研究提供参考和思路。     

混合共培养条件下骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞成骨性能分析

目的探讨混合共培养条件下骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)和脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSC)成骨分化潜能变化。方法无菌条件下获取BMSC和ADSC,纯化后倒置显微镜下观察细胞形态,对两种细胞分别进行成脂肪诱导、成软骨、成骨诱导,分别利用油红O染色、甲苯胺蓝染色、茜素红染色进行鉴定。实验分四组:A组:BMSC+ADSC未诱导(BMSC︰ADSC=1︰1);B组:BMSC诱导组;C组:ADSC诱导组;D组:BMSC+ADSC诱导组(BMSC︰ADSC=1︰1)。诱导组采用成骨诱导液进行成骨诱导,体外培养14d后Real-time PCR检测骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runt相关转录因子2(Runx-2)基因表达情况,以及通过Western-blot法检测OCN及Runx-2蛋白表达情况。结果两种细胞在体外诱导后油红O染色、甲苯胺蓝染色、茜素红染色均为阳性,q-PCR结果显示D组OCN及Runx-2表达量明显高于A、B、C组(P0.05),Westernblot结果显示OCN及Runx-2蛋白表达量D组明显高于其他三组P0.05)。结论 BMSC与ADSC在体外混合共培养条件下可促进干细胞的成骨性能。     

骨髓基质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对兔骨髓基质干细胞(BMSC)体外增殖、分化为软骨样细胞的影响。方法 24只兔等分为4组,抽取骨髓,分离基质干细胞,体外连续传代培养,A组为基础培养液,B、C、D组分别加入TGF-β1、b-FGF、TGF-β1和b-FGF,观察细胞生长情况及形态特征,阿新蓝染色,Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果B组细胞形态变化、C组增殖速度、D组增殖速度及形态变化均较A组加快。阿新蓝染色:原代阴性,传代细胞,A、c组淡染或阴性,B组呈蓝色,D组呈深蓝色。Ⅱ型胶原mRNA表达:A、c组未检出,B组阳性,D组有较强阳性表达。结论 兔BMSC在体外适当条件下可分化为软骨样细胞,TGF-β1能诱导BMSC向软骨方向分化,b-FGF不仅能促进BMSC的增殖,且能延长其生存时间。     

不同孔径β-TCP对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨作用的体外研究

目的 探讨不同孔径β-磷酸三钙(β-TCP)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖及成骨分化的作用.方法 体外原代培养BMSC,取第2代细胞悬液100μl(细胞浓度2×106/ml)接种于5组不同孔径(187～300、300～375、375～500、500～750、750～830 μm)的圆盘状多孔 β-TCP材料中.采用细胞计数试剂盒(CCK-8)测定BMSC接种后3、24、48、72 h增殖情况;扫描电镜观察接种72 h后BMSC在多孔β-TCP上贴附、生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测接种72 h后BMSC的ALP活性.结果 接种后48 h BMCS在各组多孔β-TCP上均有显著增殖,其中500～750 μm组增殖最快(P＜0.05);扫描电镜观察显示,BMCS在多孔β-TCP材料上黏附、伸展、聚集,生长状态良好;接种后72 h各组BMCS的ALP活性均明显增高,其中500～750 μm组ALP活性最高(P＜0.05).结论 不同孔径的多孔β-TCP对BMSC增殖及成骨分化均有促进作用,其中500～750 μm孔径的促进作用最明显,可能是促进BMSC增殖及成骨分化的最适孔径.     

以海藻酸三维支架构建骨髓间充质干细胞源性生物人工肝组织的实验研究

目的 以骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)为种子细胞,以海藻酸三维支架为载体,研究两者的相容性及其构建生物人工肝组织的可能性.方法 将大鼠BMSC接种于海藻酸三维支架上,采用倒置相差显微镜、扫描电镜分别检测BMSC的黏附、生长与增殖情况,评价两者的相容性;同时以表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维生长因子4(FGF-4)等细胞因子混合液诱导BMSC向肝细胞分化,检测培养液内尿素氮和白蛋白含量,RT-PCR检测培养细胞ALB和AFP基因的表达,糖原染色及免疫荧光法检测细胞糖原合成功能和CK-18的表达. 结果大鼠BMSC在海藻酸三维支架上能正常地黏附、生长和增殖;于海藻酸三维支架内加入诱导液作用于BMSC后,培养液内尿素和ALB的含量逐渐上升,RT-PCR检测到培养细胞有AFP和ALB基因的表达,同时被诱导的细胞具有糖原储存的功能并表达CK-18.结论 海藻酸三维支架与大鼠BMSC具有良好的相容性;以EGF、HGF、FGF-4等细胞因子混合液为诱导因子,能在海藻酸三维支架上成功诱导BMSC向肝细胞分化;海藻酸三维支架和BMSC可望成为肝脏组织工程理想的种子细胞和细胞载体.     

骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系

[目的]探讨骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(A recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene,Ad-BMP-2)在成骨过程中和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)相互关系。[方法]应用人骨形态发生蛋白-2腺病毒载体体外感染兔骨髓间质干细胞(bone marrow stem cells,BMSC),感染后观察BMP-2、VEGF和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达及钙结节形成。同时将30μl Ad-BMP-2行裸鼠左后肢肌组织内注射,术后20 d取材,免疫组化和原位杂交法观察BMP-2与VEGF体内表达情况。30μlβ半乳糖苷酶腺病毒载体(Adβgal)右后肢肌内注射作为对照。[结果]BMSC被Ad-BMP-2感染后,向成骨细胞分化,上调VEGF的表达。在体内成骨过程中,BMP-2在软骨细胞、成骨细胞和再生骨组织周围单核细胞表达阳性,VEGF在软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞均表达阳性。[结论]BMP-2和VEGF两者协调一致,互为促进,完成了骨组织的发生。     

骨髓间充质干细胞来源的外泌体对骨再生机制研究

目的本研究旨在检测骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-Exos)的特征,并通过体内体外实验探讨其对成骨分化的影响及对骨再生的机制。方法①原代培养人骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对其表面抗原和多系分化潜能进行鉴定;②收集BMSC的P4～P6代细胞培养的培养上清液,应用试剂盒提取BMSC-Exos;③透射电镜观察BMSC-Exos的形态结构,免疫电泳检测BMSC-Exos的表面抗原;④茜素红、ALP染色验证BMSC-Exos在体外成骨分化中的作用;⑤通过大鼠颅骨缺损动物模型验证BMSC-Exos在体内骨再生的作用;⑥通过免疫电泳和qRT-PCR检测加入BMSC-Exos后的成骨细胞中相关蛋白和基因的表达情况。结果①分离培养的BMSCs形态呈多角形或长梭形,表面抗原CD90、CD29、CD44为阳性,符合间充质干细胞的特征;②BMSC-Exos呈双面凹的圆形或椭圆形,直径约40～120 nm(81.7±19.9),表面抗原与BMSC一致;③经茜素红染色和ALP染色后,染色强度与Exo浓度呈正相关;④通过对大鼠颅骨缺损模型拍摄X片、组织学分析,外泌体可促进大鼠颅骨缺损的修复和新生骨的形成;⑤免疫电泳显示经外泌体处理后,BMSC中的OCN、Runx2、β-catenin蛋白含量增加,qRT-PCR结果显示Runx2、β-catenin的基因表达上调。结论 BMSC-Exos有促进骨再生的能力,并与上调Wnt/β-catenin通路有关。     

骨髓间质干细胞培养上清液调控肝细胞的体外研究

目的探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)培养上清液对肝细胞增殖、凋亡的影响,初步探讨BMSC治疗肝纤维化的旁分泌机制。方法采用密度梯度离心及贴壁细胞分离相结合提取BMSC。培养48h的BMSC细胞培养上清液按BMSC不同处理(培养)时间和含量两种方法建组。不同处理时间建组:取培养48hBMSC上清液处理肝细胞(完全培养),分为处理24h、48h、72h组,对照组为1640培养基处理24h的肝细胞。不同含量BMSC建组:实验1组为完全BMSC培养上清液(含肝细胞的6孔板中每孔加入BMSC上清液2ml)处理肝细胞;实验2组为部分BMSC培养上清液(每孔加BMSC上清液1ml+1640培养基1ml)处理肝细胞;对照组为完全细胞培养基(每孔加1640培养基2ml)处理肝细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测BMSC旁分泌肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)情况及培养时间对其的影响;用流式细胞仪观察肝细胞细胞分期和检测凋亡细胞数;用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测样本上清液中白蛋白的表达。结果 BMSC分泌HGF,其含量变化具有时间依赖性。加入BMSC培养上清液后,与对照组相比,实验1组中的培养上清液可以明显促进肝细胞增殖、抑制其凋亡,并随着处理时间的延长而增加(处理72h>处理48h>处理24h,均为P<0.05);实验组(1组、2组)的白蛋白分泌较对照组上调,且随着处理时间的延长白蛋白含量增加。结论 BMSC有可能通过分泌HGF促进肝细胞增殖、抑制凋亡,促进白蛋白分泌,从而抑制肝脏纤维化。     

体外转染牛碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质干细胞增殖的影响

目的：观察牛碱性成纤维细胞生长因子（bbFGF）基因体外转染兔骨髓基质干细胞（BMSC）的生长特性。方法：用脂质体法把pHβ-bbFGF7质粒导入体外分离培养的BMSC，G418筛选出阳性克隆，建立TBMSC系，体外连续传代培养TBMSC，观察生长特性。结果：在无血清Dulbecco改良基础培养基（DMEM)培养下，空白对照（BMSC）、阴性对照（BMSC／pHβ0)，第1、2天细胞分裂指数为5‰，第3天后细胞生长停滞。处理组细胞倍增时间为26．0h，分裂指数为40‰，差异有非常显著性（P＜0．01）。结论：将pHβ-bbGFF质粒体外转染兔骨髓基质干细胞可明显促进骨髓基质干细胞增殖，为组织工程化软骨的研究提供了依据。     

骨髓间充质干细胞诱导同种异体B细胞向CD5~＋调节性B细胞转化体外实验

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSC）诱导高分泌IL-10的调节性B细胞（Breg）的产生及机制。方法采用成功分离的DA大鼠BMSC与Wistar大鼠B细胞共培养（BMSC＋B）96h后,ELISA检测BMSC＋B组细胞培养上清中IL-10的浓度和分泌细胞因子的变化,设单纯BMSC、单纯B细胞两组对照;流式细胞术分析B细胞表型的变化;通过加入中和抗体,观察细胞因子对BMSC诱导Breg细胞产生的影响。结果 BMSC＋B组成功诱导产生高分泌IL-10的Breg细胞（P=0.006）;Breg表型为CD19＋CD1d＋CD5＋;IFN-β促进BMSC诱导Breg的产生（P=0.034）。结论 BMSC能诱导高分泌IL-10的CD5＋Breg产生,该机制可能与BMSC自身分泌的IFN-β有关     

骨形成蛋白-2基因转染人骨髓间质干细胞诱导异位成骨的实验研究

目的 评价腺病毒介导的人骨形成蛋白—2基因(Adv—hBMP—2)转染人骨髓间质干细胞(MSCs)的诱导成骨能力。方法 从人骨髓中分离培养获取MSCs，分为三组：①Adv—hBMP—2转染细胞组；②Adv—βgal转染细胞组；③未转染细胞组。分别于体外行western immunoblot试验、碱性磷酸酶(ALP)和Von Kossa染色、ALP定量测定，以及裸鼠肌内诱导成骨试验。共9只裸鼠，双例股后肌群内注射，每组6例。结果 Adv—hBMP—2组MSCs可分泌BMP—2蛋白；转染后第9天ALP染色多数细胞为阳性，其它两组ALP染色阳性细胞少见；ALP活性第3天开始升高，12天达高峰为14．76单位，与其它两组比较有统计学意义(P＜0．05)；于第21天后出现钙结节，而其它两组未见。裸鼠肌内注射后4周Adv—hBMP—2组X线片均有异位成骨，Adv—βgal转染细胞组未见明显成骨，未转染细胞组仅有少量骨形成。组织学检查发现：Adv—hBMP—2组也可见典型的板层骨和骨髓腔形成，Adv—βgal组主要为纤维组织，未转染组也可见散在骨小粱形成。结论 Adv—hBMP—2基因转染可诱导人骨髓问质干细胞成骨。     

蜕皮甾酮和骨髓间充质干细胞对早期创面抗炎作用的初步研究

目的:研究蜕皮甾酮(EDS)及骨髓间充质干细胞(BMSC)对烫伤创面的早期抗炎作用.方法:新西兰大耳白兔18只,每只兔用烫伤仪制备4个创面并经病理证实为深Ⅱ度,随机标记为空白对照组(A组)、EDS组(B组)、BMSC(C组)、EDS+BMSC(D组).烫伤后5、10、15 d各处死6只家兔,观察炎性细胞浸润度、创面愈合...     

低能量激光治疗在骨科领域的研究进展

低能量激光治疗(LLLT)可促进多种细胞的增殖和分化。例如,它可促进骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞分化,抑制其向脂肪细胞分化,促进骨形成;促进脂肪间充质干细胞(ADSC)增殖和分化,促进生长因子的分泌;促进成骨细胞及人BMSC增殖、黏附和成骨分化;促进成纤维细胞增殖等。LLLT在骨科中常用于促进骨愈合及骨修复、改善骨质疏松、抑制炎症和缓解疼痛、促进创面愈合、治疗腕管综合征及修复脊髓损伤和周围神经损伤等。该文就LLLT在骨科领域的研究进展作一综述。     

共培养条件下嗅鞘细胞对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响

目的:观察体外骨髓间充质干细胞(BMSC)和嗅鞘细胞(OEC)非接触共培养时,OEC对BMSC向神经样细胞诱导分化的影响.方法:采用5～6周龄、体重100g左右的SPF级雄性Sprague Dawley (SD)品系大鼠20只,分离培养大鼠BMSC和OEC,BMSC取自双侧股骨,OEC取自嗅上皮.使用6孔0.4μm的Transwell共培养系统进行培养.将2×104/cm2的第3代OEC置于共培养系统上层,3×104/cm2的第3代BMSC置于下层.对共培养7d和14d后的BMSC行免疫组化染色,检测神经细胞特异性蛋白巢蛋白(Nestin)、神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(Tuj-1)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.流式细胞仪检测Nestin、Tuj-1和GFAP阳性细胞的分布和所占的比例.结果:免疫组化检测显示,共培养7d和14d后BMSC均表达Nestin、Tuj-1和GFAP.流式细胞仪分析,共培养7d后Nestin、Tuj-1和GFAP阳性细胞比例分别为46.3％、76.5％和23.2％,共培养14d后分别为27.7％、89.1％和50％.结论:非接触共培养条件下,OEC能诱导BMSC向神经样细胞分化.     

骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的研究进展

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)是位于骨髓中的一种干细胞,因在体外经适当的培养条件可以向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等多种间充质来源的组织细胞分化,又被称为间充质干细胞(mesenchymal stem cell).骨髓基质细胞位于骨髓,具有取材方便,易于体外扩增,自体移植无免疫排斥性等优点,是骨组织工程中种子细胞的理想来源.骨髓基质细胞,其向成骨细胞的定向诱导分化将是关键的一步.笔者就骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化有关影响因素的研究进展作一综述.     

骨髓间充质干细胞、肌样细胞藻酸钙复合凝胶在压力性尿失禁大鼠尿道周围的成肌效应研究

目的 探索骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)藻酸钙复合凝胶与经5-氮杂胞苷诱导的肌样细胞藻酸钙复合凝胶在压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)大鼠尿道周围的成肌效应.方法 SD大鼠BMSC体外分离、培养、鉴定;用5-氮杂胞苷诱导生成肌样细胞;2％藻酸钠与1％氯化钙溶液以5∶1体积比配制藻酸钙凝胶,分别与BMSC和肌样细胞复合用于微量注射.72只6周龄雌性SD大鼠建立SUI模型后分为BMSC凝胶组、肌样细胞凝胶组、单纯凝胶组和空白对照4组,每组再分为3小组,于膀胱颈尿道移行部黏膜下肌层注射相应的复合凝胶.4周、8周时取各组大鼠尿道横截面进行HE染色、荧光示踪照相以及结蛋白、α-横纹肌动蛋白(α-SMA)染色检查. 结果 获得的BMSC第3代细胞表面细胞因子抗体CD29阳性率为89.4％、CD34为3.3％、CD45为2.5％、CD105为46.0％,荧光示踪照相见第3代培养细胞表达强绿色荧光.BMSC凝胶组和肌样细胞凝胶组4周、8周时,凝胶边缘血管长入并逐渐增多,荧光示踪BMSC聚集于新生血管周围,肌样细胞呈长梭形样生长,结蛋白、d-SMA明显阳性表达. 结论 BMSC、肌样细胞藻酸钙复合凝胶在大鼠SUI实验模型的微环境中具有向肌细胞分化的潜力.BMSC直接体内微环境诱导分化与5-氮杂胞苷体外诱导形成肌样细胞后植入体内微环境继续分化,短期结果无明显差异.     

骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤研究

20世纪90年代成功分离出骨髓间充质干细胞(BMSC)并移植用于治疗急性脊髓损伤动物模型,引起了广泛关注。BMSC移植治疗脊髓损伤的实验研究主要有单独移植、联合支架移植、联合细胞移植、联合药物移植及转基因干细胞移植等。该文就BMSC生物学特性、BMSC移植治疗脊髓损伤研究现状及进展作一简要综述。