冷冻胚胎经序贯共培养用于建立人胚胎干细胞系

目的:利用长期冷冻人卵裂期胚胎经序贯共培养形成的囊胚建立人类胚胎干细胞系。方法:将冷冻≥10年的卵裂期胚胎复苏后,采用单层卵丘细胞序贯共培养至囊胚期,经辅助孵出,置鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层全胚培养,原代培养6d后加入20%MEF条件培养基培养至形成原代克隆。观察人胚胎干细胞集落的生长状态并通过碱性磷酸酶染色、Oct-4基因表达、核型分析及体外分化实验等方法进行生物学鉴定。结果:9枚冷冻卵裂期胚胎经序贯共培养,有6枚发育到囊胚期,最终获得1株胚胎干细胞系。经鉴定该细胞系具有碱性磷酸酶活性、表达Oct-4胚胎干细胞特异标记、形成拟胚体、在体外形成具有自动节律性的心肌细胞、并具有46,XY核型等5种特性。结论:冷冻胚胎经序贯共培养能够改善胚胎发育潜能,有助于建立人胚胎干细胞系。     

诱导人胚胎干细胞向子宫内膜样细胞分化的初步研究

目的:探讨无饲养层培养的人胚胎干细胞诱导分化为子宫内膜样细胞的方法。方法:将无饲养层培养的人胚胎干细胞分别通过共培养诱导法和细胞因子诱导法向子宫内膜样细胞诱导,流式细胞术检测分化的细胞中子宫内膜上皮细胞标志物细胞角蛋白18和间质细胞标志物波形蛋白的表达情况。结果:共培养诱导法和细胞因子诱导法在分化第7天均出现长梭状细胞样改变。分化第8天通过流式细胞术检测发现细胞波形蛋白表达均为阴性,部分细胞角蛋白18表达阳性,共培养诱导法分化率高于细胞因子诱导法[(55.63±10.29)%vs.(13.90±0.26)%,P<0.05]。结论:共培养诱导法和细胞因子诱导法均可使人胚胎干细胞分化为子宫内膜上皮样细胞,但前者的分化效率更高。     

人胚胎干细胞向肝脏样细胞诱导分化中限定性内胚层分化的研究进展

胚胎干细胞(ESC)是来源于囊胚内细胞团的一种高度未分化细胞,具有无限增殖和发育全能性等特点,可自发分化为多种细胞类型,如神经细胞、肝脏细胞、胰腺细胞和心肌细胞等.在之前的诱导分化方案中,主要通过ESC形成拟胚体后,再进一步进行各种细胞的诱导分化,诱导分化效率较低.目前的研究表明,直接添加诱导因子能够使ESC直接分化成限定性内胚层,并在此基础上进一步诱导分化形成肝脏细胞,从而显著提高向肝脏细胞的诱导分化效率.通过鉴定限定性内胚层的表面标记因子SOX17和FOX2来评定限定性内胚层的诱导分化效率.但是,何种诱导因子的组合诱导分化效率最高并最接近人胚胎正常发育过程并不十分明确.     

胚胎肝细胞提取液体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎肝细胞提取液体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化的可行性。方法通过密度梯度分离法分离出骨髓中单个核细胞,进行体外培养和鉴定。在BMSCs传代培养7d后,把培养细胞分为诱导组和非诱导组;诱导组加入胚胎肝细胞提取液的培养体系,非诱导组加入不含胚胎肝细胞提取液的基础培养体系。在诱导培养d0,d10,d20,d30,d40对诱导分化的细胞进行形态学观察、肝系细胞特异性标志物的鉴定。结果①形态学:诱导培养2周后,长梭形细胞大多数转变成圆形、卵圆形及多角形,细胞呈肝干细胞样圆形。②免疫细胞化学检测:诱导培养d10～20细胞表达AFP、CKl9逐渐增强,d30~40逐渐减弱;诱导培养d10~40细胞表达ALB呈上升趋势;阳性染色细胞胞浆内出现棕黄色颗粒。非诱导组细胞不表达AFP、CKl9、ALB3种蛋白,为阴性染色。③糖原染色:诱导培养的细胞d10~40BMSCs均有糖原表达,非诱导细胞未见糖原表达(P﹤0.05)。结论胚胎肝细胞提取液在体外可以诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化,并分化为具有合成、代谢、分泌及储存功能的肝系细胞。     

体外诱导兔胚胎干细胞分化为神经细胞

目的:探讨体外诱导兔胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的方法。方法:应用多种诱导剂联合诱导兔ESCs,免疫荧光和流式细胞仪检测巢蛋白(Nestin)的表达。结果:诱导后兔ESCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,Nestin阳性表达。结论:在体外采用定向分化诱导,兔ESCs可直接定向分化为神经干细胞。     

体外诱导成人脂肪干细胞向心肌细胞分化的研究

目的 诱导成人脂肪干细胞（ADMSCs）分化为心肌细胞,为心肌再生提供良好的干细胞来源.方法 培养人脂肪来源的间充质干细胞,采用10 μmol/L的5-氮杂胞苷（5-Aza）诱导ADM-SCs 24 h,分别在第7、14、21天用免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞α-横纹肌肌动蛋白、MHC表达,PT-PCR法检测心肌相关基因心房钠尿肽（ANP）的表达.结果 10μmol/L 5-Aza诱导后7 d进行免疫细胞荧光染色,未见有α-横纹肌和MHC表达.14 d少量细胞α-横纹肌和MHC阳性表达,21 d表达α-横纹肌和MHC的细胞数量增多,并且RT-PCR结果显示ANP呈阳性表达.结论 经过5-Aza的诱导可以分化为心肌细胞,为心肌再生提供了更多的选择.     

体外培养胰岛干细胞分化为类胰岛样组织的研究

目的观察体外培养的胰岛干细胞是否可以被诱导分化为类胰岛样组织.方法体外培养胰岛干细胞,在胰岛素等外源性复合成分(ITS)诱导分化后,分别进行胰腺上皮干细胞特异性标志物CK-19、胰腺β细胞特异性成分胰岛素和胰腺α细胞特异性成分胰高糖素等的免疫细胞化学染色鉴定.结果体外培养的胰岛干细胞经诱导分化3 d后,在胰岛干细胞集落附近可见散在或成群分布的上皮样细胞,并呈CK-19免疫阳性反应.继续培养2～4周后,上皮样细胞增多,细胞圆形或呈鹅卵石样排列,进一步增生形成类胰岛样组织,其中大多数细胞呈胰岛素免疫反应阳性,少数细胞呈胰高糖素免疫反应阳性.结论体外培养的胰岛干细胞具有向类胰岛样组织分化的潜能,它能分化为胰岛的α细胞和β细胞.     

利用体外替代模型评价栀子黄色素的发育毒性

目的 利用胚胎干细胞试验、大鼠植入后全胚胎培养试验和微团培养试验评价栀子黄色素的胚胎发育毒性.方法 分别检测栀子黄色素对小鼠胚胎干细胞ES-D3及胚胎成纤维细胞BALB/3T3增殖的影响,并检测栀子黄色素对ES-D3细胞向心肌细胞分化能力的影响;分离孕9.5 d大鼠胚胎进行全胚胎培养,测量胚胎生长指标,并根据Brown...     

人胚神经干细胞向神经元样细胞诱导分化的研究

目的探讨通过一定的培养条件,使神经干细胞在体外向神经元方向分化。方法在贴壁培养的情况下以含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝素的培养基诱导神经干细胞分化,观察分化的细胞形态并用免疫细胞化学技术检测分化细胞的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。结果诱导7d后免疫细胞化学检测显示NSE阳性细胞占细胞总数的(47.3±1.7)%,明显高于对照组(P<0.01)。分化后细胞的胞体直径、表面积和突起长度也明显高于对照组(P<0.01)。结论在体外应用bFGF和肝素诱导神经干细胞向神经元分化是可行的,bFGF和肝素既能促进神经干细胞分化成更多的神经元,也可促进分化后神经元的成熟。     

体外诱导胚胎干细胞分化为神经细胞特性的实验研究

目的研究体外利用全反视黄酸(RA)诱导小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为神经细胞的培养方法。方法悬滴3天转悬浮1天两者结合的培养方法得到胚体(EBs),再利用RA对其处理4天后,进行免疫组织化学、RT-PCR以及兴奋性功能的检测,观察神经细胞获得的效率及其生理特性。结果利用RA诱导方法得到的神经细胞,免疫组化表明nestin蛋白表达的阳性率为(53.49±6.02)%,且RT-PCR法分析其能表达nestin、glutaminase和Brn-3等神经细胞特异基因,同时在Glu刺激下具有与脑来源神经元相似的特性和功能。结论利用本实验诱导方法,获得神经细胞的比例较高,且具有与神经元相似的生物学特性。     

人皮肤成纤维细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定人皮肤成纤维细胞（HSF）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法利用逆转录病毒将Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因导入原代HSF细胞,将其编程为iPS细胞。检测细胞内源、外源基因表达量,鉴定外源基因是否插入iPS细胞,分析细胞核型,细胞碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色,体内分化畸胎瘤,体外分化拟胚体实验,对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS细胞内源多能基因（Nanog、Oct4、Rexl、Sox2）表达量增高,外源编程基因（Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc）表达量降低。（3）琼脂糖凝胶电泳实验证实外源基因插入iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常,碱性磷酸酶活性增高,表达ES细胞特异性蛋白。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。结论新建立的iPS细胞类似于ES细胞具有多向分化潜能。     

脐带间充质细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定脐带间充质细胞（UMC）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法以逆转录病毒作为Sox2、KIf4、Oct4、c—Myc基因转移载体,将UMC细胞编程为iPS细胞。应用RT-PCR检测细胞基因表达量,鉴定外源编程基因是否整合到iPS细胞核内,分析细胞核型,对细胞进行碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色,体内分化畸胎瘤和体外分化拟胚体实验,对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态学上类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS与ES细胞内源多能基因（Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2）表达谱相类似,外源编程基因（Sox-2、KIf4、Oct-4、c—Myc）表达发生沉默。（3）外源编程基因已被插入到iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常,碱性磷酸酶活性增高,表达Es细胞特异性膜蛋白（SSEA3、SSEA4）,质蛋白（TRA-1-60、TRA-1—81）,核蛋白（Nanog）。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。结论iPS细胞类似于Es细胞具有多向分化潜能。     

Germ cells and pluripotent stem cells in the mouse

For many years, attempts to achieve long-term culture of mouse primordial germ cells (PGCs) proved unsuccessful, even when feeder layers were used and individual growth factors were added to the medium. However, when three growth factors were added simultaneously to the medium, some of the cells continued to proliferate indefinitely. Similar to embryonic stem cell lines, these embryonic germ (EG) cell lines were capable of giving rise to embryoid bodies in vitro, and colonizing all cell lineages in chimeras, including the germline. Initially, EG cells were made from PGCs before migration, 8.5 days post coitum (dpc), and after entry into the genital ridge, 11.5 and 12.5 dpc. New EG cell lines from 9.5 dpc (migrating) and 11.5 dpc PGCs, carrying either a LacZ or GFP transgene, are described here. The developmental potential of the new EG cell lines in vitro, in vivo in chimeras, and in tissue aggregates in organ culture was studied. The EG cells were compared with PGCs at the stage from which the EG cells were derived. The two cell types show several similarities, but also some differences in gene expression and cell behaviour, which require further exploration.     

大鼠体外多器官细胞共培养模型的建立

目的 建立大鼠体外多器官细胞共培养方法.方法 采用胶原酶消化法、支气管灌洗分离法、两步消化法等方法分离大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞和真皮成纤维细胞,用锥虫蓝染色法检测细胞分离成活率,用单层贴壁法分别培养;采用飞片法,将5种细胞的飞片放入同一培养皿,用体积分数为10%的FBS DMEM培养基培养7 d,用噻唑蓝(MTT)比色法比较原代细胞在单独培养和共培养时的生长情况.结果 建立的大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、真皮成纤维细胞分离方法稳定,细胞分离成活率均达90%,其中胶原酶消化法培养肝细胞的存活率达90.3%,两步消化法培养肾细胞的细胞存活率达91.9%,心肌细胞的胶原酶消化法细胞存活率达93.0%.3～15 d的心肌细胞搏动频率比较,差异无统计学意义(P>0.05),差速贴壁法培养的肺泡巨噬细胞存活率可达90.8%,以胶原酶消化法培养的原代真皮细胞存活率达92.7%,细胞生长状态良好.5种原代细胞的多器官细胞共培养结果显示,共培养时细胞生长增殖情况良好,单独培养与共培养细胞生长曲线基本重合.结论 所建立的大鼠多器官细胞共培养方法是成功的.     

Comparison of neurosphere cells with cumulus cells after fusion with embryonic stem cells: reprogramming potential

Embryonic stem cells (ESCs) are the pluripotent cells that also have the capacity to induce the genomic reprogramming of differentiated somatic cells. The progressively restricted genomic potential of somatic cells observed during embryonic development can be reverted to a pluripotent state by the formation of cell hybrids with ESCs. To assess the reprogramming potential of ESCs, we investigated the reprogramming of one of two different somatic cell populations, neurosphere cells (NSCs) and cumulus cells (CCs), after fusion with ESCs. Specifically, hybrid cells were produced by cell fusion of E14 ESCs with either NSCs or CCs containing the neo/lacZ and Oct4-GFP transgenes. The first reprogramming event, observed by the presence of Oct4-GFP in the hybrid cells, could be identified on Day 2, at approximately 45 h after fusion in both ESC-NSC and ESC-CC hybrids. In addition, the two ESC-somatic cell hybrids exhibit a similar reprogramming rate and share characteristics with the E14 ESC line: (1) expression of pluripotent markers (Oct4, Rex-1 and nanog); (2) inactivation of differentiated tissue-specific gene expression; and (3) the capacity to differentiate into all three germ layers. Taken together, our results suggest that the ESC-somatic cell hybrids have fully acquired ESC characteristics and that somatic cells of different tissue origin have the same potential to be reprogrammed after fusion with ESCs.     

昆明鼠胚胎干细胞系建立中原代克隆生长及其传代方法的研究

目的:探讨昆明鼠胚胎内细胞团分离方法、原代干细胞克隆分离时机及干细胞传代方法对干细胞建系效率的影响。方法:取昆明鼠3.5d囊胚建胚胎干细胞系,比较全胚培养法与免疫外科法两种内细胞团分离方法对胚胎干细胞建系效率的影响,观察原代克隆的分离时机,机械法传代和酶消化传代对胚胎干细胞建系效率的影响。结果:全胚培养法30个囊胚建系3个,免疫外科法32个囊胚建系4个,两组均可以有效地形成胚胎干细胞系;昆明鼠原代干细胞克隆分离最佳时机是增殖4～6d;5代以前的干细胞以机械传代方法较好,5代后用酶消化法传代效果较好。结论:全胚培养法和免疫外科法均能有效建立昆明鼠胚胎干细胞系,采用机械化与酶消化法相结合传代更适合昆明鼠干细胞建系。     

Enrichment of blood from embryonic stem cells in vitro

Murine embryonic stem (ES) cells are pluripotent. When injected into blastocysts they can give rise to every cell type of a derived chimeric mouse including germ cells. Embryonic stem cells also possess remarkable in vitro differentiation potential. When removed from stromal support and leukaemia inhibitory factor (LIF), ES cells differentiate into structures known as embryoid bodies (EBs), in which all three germ layers develop and interact. As ES cells from humans become available there is increasing interest in the potential for EBs to provide an unlimited supply of stem cells for somatic transplantation therapies. Realisation of this potential will require greater understanding of the molecular determinants of cell fate within EBs. Also, culture techniques for selective expansion of cell lineages of interest will reduce the risks associated with transplantation of EB-derived cells. In this paper the kinetics of expression of mRNA and protein for early mesoderm markers within EBs is reported. In addition, a three-step culture system incorporating co-cultivation on the bone marrow derived stromal cell line, MC3T3-G2/PA6 (PA6), is explored as a way to select for haematopoietic progenitor cells (HPCs) and against undifferentiated ES cells. A system like this could enhance purification of haematopoietic stem cells (HSCs) from ES cells for bone marrow transplantation.