实时荧光RT-PCR快速检测肠道病毒RNA及其临床意义

目的应用实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法快速检测肠道病毒RNA,为手足口病的早期诊断提供临床依据。方法采用实时荧光RT-PCR法检测手足口病患儿粪便、脑脊液中肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组16(CA16)和肠道病毒71型(EV71)RNA。结果 234份粪便标本中肠道病毒通用型阳性214例,检出率为91.45%;CA16阳性56例,阳性率为23.50%;EV71阳性87例,阳性率37.17%,其中有4例同时检出CA16和EV71。2份脑脊液标本中3种肠道病毒核酸结果均为阴性。结论实时荧光RT-PCR能对肠道病毒RNA进行快速检测,为手足口病的早期诊断提供诊断依据,并对手足口病患儿的病情分析、治疗及预后观察起到指导作用。     

单管多重RT-PCR检测肠道病毒核酸及其临床应用

目的建立一种快速检测肠道病毒通用型(EV)、科萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)核酸的单管多重反转录聚合酶链反应(RT-PCR),并探讨其临床应用价值。方法建立单管多重RT-PCR检测EV、CA16和EV71的反应体系,并优化退火温度、各引物比例和循环参数等反应条件;采用自建RT-PCR体系检测136例手足口病患儿大便标本的肠道病毒核酸。结果单管多重RT-PCR检测体系的最佳反应条件:退火温度为54℃;EV、CA16和EV71引物比例为2∶1∶1;循环参数为35。采用自建单管多重RT-PCR从136例标本中检出EV阳性46例(33.82%),CA16阳性14例(10.29%),EV71阳性14例(10.29%),其中CA16、EV71同时阳性2例。结论成功建立检测EV、CA16和EV71核酸的单管多重RT-PCR,并应用于手足口病患儿的病原学检测。     

捕获ELISA法测定抗EV71-IgM抗体用于EV71感染早期诊断

目的探讨捕获ELISA法测定抗肠道病毒71型(EV71)IgM抗体在EV71感染所致手足口病(HFMD)早期诊断中的价值。方法以实时荧光RT-PCR检测89例临床初诊为HFMD患儿的粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子的肠道病毒RNA。用40例排除HFMD的5岁以下儿童血清为抗EV71-IgM抗体阴性对照,以捕获ELISA法检测患儿不同发病期血清中抗EV71-IgM抗体。结果经实时荧光RT-PCR检测,89例HFMD患儿粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子中EV71感染28例,柯萨奇病毒A16(CA16)感染43例,非EV71和CA16的肠道病毒感染14例,非肠道病毒感染4例。EV71感染者发病1～3 d、4～6 d及>6 d的血清抗EV71-IgM抗体阳性率分别为81.3%、100%和100%;CA16感染者分别为10.0%、26.4%和65.7%;非EV71和CA16的肠道病毒感染者及非肠道病毒感染者在发病1～3 d和4～6 d无1例阳性;阴性对照组无1例阳性。抗EV71-IgM抗体在EV71感染的早期(急性期)的诊断敏感性和特异性分别为81.3%和92.9%。结论 EV71感染者与CA16感染者血清抗EV71-IgM抗体在发病4 d后存在较明显的交叉反应。抗EV71-IgM抗体可用作EV71感染早期诊断的血清学标志物。     

肠道病毒71型手足口病ELISA诊断试剂盒研制与临床应用

目的 研制早期快速检测抗肠道病毒71型(EV71)抗体的ELISA血清学诊断性试剂盒,评价其临床应用价值.方法 将表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原,建立EV71型手足口病间接ELISA的血清学检测方法 .通过与逆转录(RT)PCR方法 、EV71病毒分离试验和微量血清中和试验比较,评价抗.EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清学诊断方法 在EV71型手足口病的诊断价值.结果 与RT-PCR比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83%、85%、81%和87%;抗.EV71 IgG敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72%、74%、68%和77%.与EV71病毒分离方法 比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度分别为85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度分别为75%和77%.通过直线相关分析发现,抗-EV71 IgG抗体滴度和中和抗体滴度呈显著正相关(r=0.72,P＜0.05).EV71型手足口病患儿恢复期血清抗IgG滴度较急性期升高(P＜0.01),但抗IgM滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用VP1重组蛋白作为包被抗原,成功开发ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒.     

2008-2011年湖北省宜昌市手足口病的流行特征分析

目的 了解湖北省宜昌市手足口病的流行特征, 为手足口病的综合防治提供科学依据。 方法 收集2008-2011年宜昌市包括各县(市、区)报告的手足口病疫情病例和聚集性病例的相关标本, 采用荧光定量RT-PCR方法进行检测。 结果 在473份标本中, 男女性别比为1.26:1,手足口病发病高峰在春末和夏初;疱疹液的阳性检出率高于咽拭子(2=8.026,P0.01)和口漱液(2=12.67,P0.01);共检测到肠道通用病毒阳性标本298份, 总检出率为73%,其中肠道病毒71型(EV71)阳性标本191 份,柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)阳性标本78份,其他肠道病毒为29份,EV71的检出率高于Cox A16(2=86.517,P0.01)和其他肠道病毒(2=189.089,P0.01)。 结论 宜昌市手足口病的病原体主要是EV71(64.1%)和Cox A16(26.2%), 随不同年份优势毒株稍有差异,EV71是引起宜昌市2008-2011年手足口病病例的主要优势毒株类型。     

实时荧光聚合酶链反应检测患儿手足口病病原体

目的采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测患儿手足口病病原体,为防治手足口病提供依据。方法收集手足口病疑似患儿189例(按年龄分为<3岁组113例、3～5岁组76例)及39例手足口病密切接触儿童的咽拭子、疱疹液,用FQ-PCR检测标本中的肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CoxA16),并与酶联免疫吸附试验(ELISA)结果进行比对。结果 189例手足口病患儿疑似组FQ-PCR检测EV阳性141例,阳性率为74.6%,其中<3岁阳性91例、3～5岁阳性50例,3～5岁组EV检出率明显低于<3岁组(P<0.05);EV71阳性135例,CoxA16阳性65例;咽拭子标本阳性率为74.5%(120/161),疮疹液标本阳性率为82.1%(23/28);ELISA检测EV阳性76例(40.2%);39例手足口病密切接触者FQ-PCR检测EV阳性率为33.3%(13/39),ELISA检测阳性率为17.9%(7/39)。结论 FQ-PCR是一种特异性强、灵敏度高、检测较快速、效率高的方法,对检测手足口病病原体及进行相关流行病调研有重要价值。     

2009-2010年江苏省徐州市儿童手足口病病原学检测分析

目的了解江苏省徐州地区2009-2010年儿童手足口病流行的病原学特征。方法 2009年3-8月和2010年1-12月共采集徐州儿童医院门诊、住院及常规监测的511例疑似手足口病(HFMD)儿童患者的咽拭、肛拭标本,提取病毒RNA,用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法同时进行肠道病毒(EV),肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16(Cox A16)的特异性基因检测。结果 511例疑似手足口病患儿的标本中,总肠道病毒阳性288例,占56.36%;288个肠道病毒核酸阳性病例中,EV71核酸阳性202例,Cox A16核酸阳性55例,构成比分别为70.14%和19.10%。≤5岁儿童感染的肠道病毒有EV71型、Cox A16型及非EV71非Cox A16的其他肠道病毒感染,>5岁儿童则只有EV71感染病例。结论 2009-2010年徐州地区儿童手足口病患儿以1～3岁儿童为主,其主要病原是肠道病毒EV71型,其次是Cox A16型。     

502例手足口病患儿实验室检测结果的分析

目的观察手足口病患儿的实验室检测结果,并探讨其意义。方法收集502例(重症型104例,轻症型398例)手足口病住院患儿的咽试子标本,采用实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)法对手足口病患儿肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)以及柯萨奇病毒A组16型(CA16)核酸进行检测。同时检测白细胞(WBC)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脱氢酶(LDH)并进行分析。结果 502例手足口病患儿中,EV、EV71、CA16感染阳性分别为384例(76.49%)、262例(52.19%)、39例(7.76%)。男性患儿多于女性患儿,104例重症型手足口病患儿中,EV71阳性率为92.31%;502例手足口病患儿中有402例3岁。104例重症型患儿有97例(93.27%)3岁;其中EV71阳性率92.78%(90/97)。重症型与轻症型相比,重症型手足口病患儿WBC、LDH、CK-MB、DBIL和ALT水平较高(P0.05)。结论手足口病患儿以3岁为主,感染的肠道病毒主要为EV,引起重症型的主要病原体为EV71。     

2010-2013年济南地区肠道病毒71型感染手足口病流行病学分析

目的 分析2010-2013年济南地区肠道病毒71型(EV71)感染手足口病的流行病学特征,为手足口病防控提供参考依据。方法 选取济南地区2010-2013年临床诊断为手足口病的病例为对象,采集患者发病1周内的粪便、咽拭子等标本,采用肠道病毒通用(PE)、EV71和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)特异性引物通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行病原学鉴定。结果 2010-2013年接受病原学检测的手足口病患儿共3351例(包括114例重症病例),2548例检测到肠道病毒(76.04%);其中EV71阳性1001例,占阳性病例的39.29%(1001/2548)。2010-2013年EV71阳性率分别为23.51% (190/808)、39.95%(334/836)、22.12%(190/859)和33.84%(287/848);重症病例EV71阳性率为80.70%(92/114),普通病例EV71阳性率为28.08%(909/3237),两者之间差异有统计学意义(2=131.9135, P0.01);重症病例中EV71阳性率显著高于其他病毒类型 (2=245.24, P0.01)。1001例感染EV71的手足口病患儿中,男女性别比为1.60:1;病例年龄主要集中于4岁以下儿童(84.42%),尤其是1~3岁年龄组(48.65%);重症病例男女比例更高(2.83:1),年龄以3岁以下幼童为主(89.13%),其中2例死亡病例均不到1岁。结论 济南地区不同年度EV71流行强度与趋势不同,EV71是重症及死亡病例的主要病原。     

内江地区手足口病肠道病毒核酸检测及流行特征分析

目的分析内江地区2014年1月至2015年12月手足口病的病原学特征,为手足口病的预防控制提供病原学依据。方法选取2014年1月至2015年12月临床疑似手足口病685例作为研究对象。采集疑似手足口病患儿发病1周内的疱疹液、咽拭子或肛拭子标本,用实时荧光RT-PCR进行肠道病毒通用型(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)核酸扩增,并分析患儿性别、年龄以及近2年流行时间的分布。结果 685例疑似手足口病中,肠道病毒阳性599例,检出率87.45%(599/685),其中EV71型、CoxA16型、肠道病毒其他型分别占肠道病毒感染阳性的16.53%(99/599)、12.35%(74/599)和71.12%(426/599)。EV71与CoxA16型手足口病的患儿以0~4岁儿童为主,性别差异无统计学意义(P0.05);4-7月与10-11月为该地2个发病高峰。结论对内江地区类似手足口病症状的儿童进行病原学检测,及早发现并治疗,有利于疫情控制及应对突发事件,是降低手足口病死亡率的关键。     

一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒

目的探讨实时荧光RT-PCR在手足口病(HFMD)肠道病毒快速检测中的应用价值。方法以实时荧光RT-PCR检测64例临床初诊为HFMD患儿标本中总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71),用RD细胞、Vero细胞和Hep-2细胞进行病毒分离培养,以免疫荧光法鉴别分离培养的EV71。结果64例标本中,EV(+)/EV71(+)为23.4%(15/64)、EV(+)/CA16(+)为48.4%(31/64)、EV(+)/EV71(-)/CA16(-)为10.9%(7/64)、EV(-)/EV71(-)/CA16(-)为17.2%(11/64)。实时荧光RT-PCR检测为EV71且病毒分离培养出现细胞病变效应的培养细胞经抗EV71单克隆抗体免疫荧光检测均为阳性,未发生细胞病变效应或非EV71的培养细胞均为阴性。结论实时荧光RT-PCR检测HFMD病原具有特异和快速等优点,与病毒分离培养具有较高的一致性,可用于手足口病的早期诊断和鉴别诊断。     

2008-2011年辽宁省锦州市手足口病病原监测结果分析

目的 了解辽宁省锦州地区手足口病的病原学特征及变化趋势,为手足口病防治工作提供参考依据。 方法 日常监测工作中收集2008-2011年锦州地区294例手足口病临床确诊患儿的330份样本检测结果,其中咽拭子274份,粪便标本56份,进行病原学检测。 结果 294例被检测患儿中246例为肠道病毒阳性,阳性率为83.67％,其中肠道病毒71型(EV71)阳性率30.61%,柯萨奇A组16型(Cox A16)阳性率32.31%,EV71、Cox A16混合感染阳性率0.34%,其他肠道病毒阳性率20.41%。330份标本中咽拭子阳性率82.12％(225／274),粪便阳性率71.43%(40/56)。2008-2011年病例的咽拭及粪便标本采用不同检测方法、不同试剂的阳性检出率差异无统计学意义(P﹥0.05)。 结论 锦州市儿童手足口病病原体以EV71和Cox A16为主,每年略有不同,近年其他肠道病毒感染率逐年增高。手足口病患者的咽拭和粪便标本的阳性检出率无差异。     

某地区2010年手足口病患者肠道病毒RNA实时荧光逆转录PCR检测结果分析

目的用实时荧光定量RT-PCR技术检测惠州市2010年手足口病患者肠道病毒RNA,了解手足口病病例肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染策略提供依据。方法采集2010年1～12月本院送检的1712例手足口病患者的粪便、肛拭子、咽拭子和脑脊液等标本5849份,应用荧光RT-PCR技术检测样本中的肠道病毒(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)。结果男性及女性EV、EV71和CA16感染率分别为68.15%、43.61%、5.56%和61.23%、37.03%、5.70%;共检出1123份EV阳性标本,705份EV71阳性标本,96份CA16阳性标本,阳性率分别为60.28%、33.35%和5.13%;4～6月和7～9月是手足口病发病高峰期,感染肠道病毒EV、EV71型、CA16型人数分别占所有肠道病毒EV、EV71、CA16型感染者的36.33%、49.50%、42.70%和42.56%、38.72%、40.63%;0～4岁的儿童是手足口病的高发人群,占所有患者的85.46%。结论惠州市2010年手足口病的病原以肠道病毒71型为主,夏秋季节是手足口病发病高峰期,0～4岁儿童是感染肠道病毒的高危人群。     

实时荧光定量PCR快速诊断肠道病毒71型感染

目的探寻快速准确早期诊断肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)感染的方法。方法手足口病患儿871例,采用实时荧光定量PCR检测患儿咽拭子或疱液的EV71感染情况,实时荧光定量PCR检测EV71阳性患儿采用ELISA法检测血清EV71-IgM和EV71-IgG。结果871份标本中,RT-PCR检测EV71感染阳性率为17.91%,其中5月份检测阳性率(24.44%)最高,12月份检测阳性率(4.17%)最低;随机抽取64例RT-PCR检测阳性患儿外周血,EV71-IgM阳性率为51.56%,EV71-IgG阳性率为14.06%。结论 RT-PCR能快速准确诊断EV71早期感染。     

肠道病毒71型IgM抗体在手足口病诊断中的临床应用价值研究

目的：探讨检测人肠道病毒71型(EV71)的IgM抗体对于手足口病的诊断价值。方法收集2012年1月至2014年5月期间,我院收治的初治手足口病患者41例,取血清标本以及咽拭子标本分别进行EV71 IgM抗体、EV71特异性核酸以及肠道病毒(EV)通用型核酸检测。结果本组41例患者入院第1dEV71 IgM抗体阳性率为56.1%,入院第2d累计阳性率为58.5%,入院第4d累计阳性率为78.0%,第5d累计阳性率为92.7%,第6d累计阳性率为92.7%,稳定期EV71 IgM抗体阳性结果显著高于同期Real time RT-PCR检测EV71特异性核酸结果(92.7%vs 73.2%),P<0.05;EV通用型核酸阳性率与EV 71 IgM抗体阳性率依次为78.0%(32/41)和92.7%(38/41),两组对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论检测EV71 IgM抗体对于手足口病的早期诊断具有重要指导意义,值得推广应用。     

不同方法检测肠道病毒71型IgM抗体在手足口病诊断中的意义

目的：研究免疫层析法（ICA）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测肠道病毒71型（EV71）IgM 抗体在手足口病诊断中的意义。方法采集135例手足口病确诊患儿和44例排除手足口病诊断的患儿血清标本,采用ICA及ELISA检测EV71 IgM 抗体。结果135例手足口病患儿,ICA、ELISA 检测 EV71 IgM 抗体阳性率分别为21．48％（29/135）和20．74％（27/135）;44例非手足口病患儿,ICA、ELISA检测EV71 IgM抗体阳性率均为0．00％（0/44）。结论ICA或ELISA检测EV71 IgM抗体阳性者均可确诊为手足口病,但检测结果为阴性者,不能排除手足口病的可能性,应结合临床表现进行诊断。     

2007-2008年北京地区儿童手足口病的病原学分析

目的 通过病毒分离和鉴定了解2007-2008年春夏北京地区手足口病的病原学特征,为手足口病防治工作提供科学依据.方法 分别于2007年4-8月及2008年5-9月收集256例手足口病患儿的咽拭子和疱疹液标本共356份,其中咽拭子255份(包括10份重症患儿标本),疱疹液标本101份.将所有标本接种Vero细胞进行病毒分离,分离阳性的毒株用RT-PCR进行鉴定;对10份重症患儿标本除病毒分离外,还直接进行RT-PCR检测病毒核酸.结果 256例被检测患儿中188例为肠道病毒阳性,阳性率为73.4%.356份标本中共分离到239株肠道病毒,总阳性率为67.1%.其中疱疹液标本分离阳性率为75.2%(76/101),咽拭子标本分离阳性率63.9%(163/255),但两种标本接种细胞后出现病变的速度没有差别.重症患儿标本病毒分离阳性率50%(5/10).2007年的45例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测均为阳性,分型PCR显示,其中CA16占95.6%(43/45),EV71占4.4%(2/45);而2008年的143例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测142例为阳性,PCR分型显示,EV71占82.4%(117/142),CA16占16.8%(24/142).10份重症患儿标本直接分型检测结果均为EV71.结论 北京儿童手足口病病原体以EV71和CAV16为主,2007年与2008年流行的优势型别不同,2007年主要为CA16,而2008年主要为EV71.本组重症手足口病患儿的病原均为EV71.     

粤东地区2011年手足口病病原学检测及临床分析

目的 了解粤东地区2011年婴幼儿手足口病的病原体分型情况及其与临床的关系.方法 采集2011年1月至12月汕头大学医学院第二附属医院儿科手足口病住院患儿的咽拭子标本,RT-PCR检测肠道病毒71型（EV71）,柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）,肠道病毒属,并对扩增产物测序鉴定.结果 301例患儿中有214例咽拭子中检测到肠道病毒,病毒阳性率为71.1%,其中EV71 60例,占28.0%,CoxA16 108例,占50.5%,除EV71、CoxA16外的其他型别肠道病毒为46例,占21.5%;91例患儿有明显神经系统损害,其中33例EV71检测阳性（33/60,55.0%）,35例CoxA16检测阳性（35/108,32.4%）,8例除EV71、CoxA16外其他型别肠道病毒检测阳性（8/46,17.4%）,15例肠道病毒检测阴性.除1例由EV71引起的的危重型手足口病死亡外其余300例均痊愈出院.结论 粤东地区2011年手足口病病原体主要为CoxA16、EV71,但CoxA16已经成为当年优势病原体,其他型肠道病毒也占有一定比率.而EV71最容易引起神经系统损害和导致重症及危重症,EV71、CoxA16及其他型肠道病毒均可引起神经系统损害.     

2007-2008年北京地区儿童手足口病的病原学分析

目的 通过病毒分离和鉴定了解2007-2008年春夏北京地区手足口病的病原学特征,为手足口病防治工作提供科学依据.方法 分别于2007年4-8月及2008年5-9月收集256例手足口病患儿的咽拭子和疱疹液标本共356份,其中咽拭子255份(包括10份重症患儿标本),疱疹液标本101份.将所有标本接种Vero细胞进行病毒分离,分离阳性的毒株用RT-PCR进行鉴定;对10份重症患儿标本除病毒分离外,还直接进行RT-PCR检测病毒核酸.结果 256例被检测患儿中188例为肠道病毒阳性,阳性率为73.4%.356份标本中共分离到239株肠道病毒,总阳性率为67.1%.其中疱疹液标本分离阳性率为75.2%(76/101),咽拭子标本分离阳性率63.9%(163/255),但两种标本接种细胞后出现病变的速度没有差别.重症患儿标本病毒分离阳性率50%(5/10).2007年的45例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测均为阳性,分型PCR显示,其中CA16占95.6%(43/45),EV71占4.4%(2/45);而2008年的143例病毒分离株经肠道病毒通用引物PCR检测142例为阳性,PCR分型显示,EV71占82.4%(117/142),CA16占16.8%(24/142).10份重症患儿标本直接分型检测结果均为EV71.结论 北京儿童手足口病病原体以EV71和CAV16为主,2007年与2008年流行的优势型别不同,2007年主要为CA16,而2008年主要为EV71.本组重症手足口病患儿的病原均为EV71.     

胶体金免疫法对手足口病分型检测的研究

目的 建立胶体金免疫法(CGIA)对手足口病(HFMD)分型的检测方法.方法 用双抗体夹心检测原理建立CGIA对HFMD分型检测方法,分别检测136例HFMD患儿和30例健康儿童粪便中柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠病毒71型(EV71),以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)为金标准,评价CGIA检测性能.结果 CGIA 与RT-PCR检测136例HFMD患儿粪便EV71阳性率分别为27.2%和28.6%;CGIA与RT-PCR检测136例手足口病患儿粪便CA16阳性率分别为33.8%和35.3%;以RT-PCR为金标准,CGIA检测手足口病患儿粪便EV71的敏感性89.7%,特异性89.7%,阳性预测值94.5%,阴性预测值95.9%,准确度95.5%;CGIA检测手足口病患儿粪便CA16的敏感性85.4%,特异性94.3%,阳性预测值89.1%,阴性预测值92.2%,准确度91.1%.结论 CGIA法操作简单、方便、快速,特异性和敏感性好,为HFMD病原学早期分型诊断提供了一个有效的检测手段.