黄芪含药血清对氯化钴诱导ARPE-19细胞缺氧损伤的保护作用

目的：研究黄芪含药血清对氯化钴(CoCl₂)诱导人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞缺氧损伤的保护作用,从而探讨黄芪是否通过抗氧化应激来改善糖尿病视网膜病变(DR)。

方法：建立CoCl₂诱导ARPE-19细胞缺氧模型,并分为以下5组：正常组(细胞正常培养,不加任何处理)、缺氧模型组(200μmol/L CoCl₂)、空白血清组(200μmol/L CoCl₂+空白血清)、低剂量含药血清组(200μmol/L CoCl₂+10%含药血清)、高剂量含药血清组(200μmol/L CoCl₂+20%含药血清)。CCK-8检测细胞活性; 试剂盒检测细胞上清液中还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平; ELISA检测细胞培养基中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量; 实时荧光定量PCR(qPCR)检测VEGF、HIF-1α和脯氨酰羟化酶-2(PHD-2)的mRNA水平; Western Blot法检测VEGF、HIF-1α和PHD-2的表达情况。

结果：采用200μmol/L的CoCl₂浓度可成功建立ARPE-19细胞缺氧模型。低剂量和高剂量黄芪含药血清可抑制缺氧诱导的ARPE-19细胞增殖(P<0.05),升高ARPE-19细胞缺氧损伤中GSH水平,降低MDA含量(P<0.05)。低剂量和高剂量黄芪含药血清可抑制ARPE-19细胞缺氧损伤上清液中HIF-1α和VEGF的表达(P<0.05),以及ARPE-19细胞中VEGF、HIF-1α、PHD-2的mRNA表达和蛋白表达(P<0.05)。

结论：低剂量和高剂量黄芪含药血清通过抗氧化作用减轻CoCl₂诱导ARPE-19细胞缺氧损伤。     

α-倒捻子素对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的：研究α-倒捻子素对过氧化氢(H₂O₂)诱导的人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19氧化损伤的保护作用。

方法：分别用不同浓度的α-倒捻子素和H₂O₂处理ARPE-19,CCK8法检测α-倒捻子素和H₂O₂对ARPE-19细胞毒性作用。不同浓度的α-倒捻子素预处理ARPE-19,再用200μmol/L H₂O₂处理24h,观察细胞活性变化。流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平变化,免疫印迹法(Western blot)检测NF-κB蛋白表达变化。

结果：CCK8法检测结果显示：当α-倒捻子素浓度在0～12μmol/L时,ARPE-19活性无明显变化; 当浓度达到16μmol/L时,细胞活性开始下降(P<0.05)。H₂O₂诱导后,当α-倒捻子素浓度在0～16μmol/L之内时,α-倒捻子素预处理均可提高ARPE-19细胞活性。ROS结果表示：H₂O₂诱导后,ROS表达量增高(P<0.05); 8和12μmol/L α-倒捻子素预处理,均可有效清除H₂O₂诱导产生的ROS(P<0.05)。Western blot结果显示：H₂O₂诱导后NF-κB蛋白表达增高(P<0.05),12μmol/Lα-倒捻子素预处理可以继续上调H₂O₂诱导后ARPE-19的NF-κB蛋白表达(P<0.05)。

结论：H₂O₂诱导ARPE-19细胞氧化损伤,造成细胞活性下降,ROS表达量增加,经过α-倒捻子素预处理后,可有效提高细胞活性,清除ROS,活化NF-κB。     

[已撤稿]人视网膜色素上皮细胞在缺氧和高糖环境中VEGF165及VEGF165b的表达及意义

目的：研究体外培养的人视网膜色素上皮细胞在人工模拟的缺氧和高糖环境中VEGF₁₆₅ 及VEGF_165b 表达的情况。

方法：正常接种并体外培养人视网膜色素上皮细胞,待细胞稳定生长后以150μmol/L CoCl₂ 和25mmol/L 葡萄糖浓度分别模拟细胞缺氧和高糖环境,将接种细胞分为正常组(5.56mmol/L 葡萄糖)、缺氧组(5.56mmol/L 葡萄糖+150μmol/L CoCl₂)、高糖组(25mmol/L 葡萄糖,不加CoCl₂)、联合组(25mmol/L 葡萄糖+150μmol/L CoCl₂)共四组。每组分别于12、24、36、48h提取RNA。MTT 比色法检测细胞活力及增长趋势; RT-PCR 法检测不同时间点四组RPE 细胞VEGF₁₆₅ mRNA 和VEGF_165b mRNA 的相对表达量。

结果：缺氧和高糖环境下RPE 细胞分裂增殖受限,细胞活力降低。同一组细胞不同时间点比较,正常组VEGF₁₆₅和VEGF_165b随时间变化的表达差异无统计学意义(P >0.05),而缺氧组、高糖组、联合组VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达则随时间变化而变化,差异有统计学意义(P<0.05)。同一时间点各组相互比较,在缺氧模型建立后12h 各组细胞间VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达差异无统计学意义(P >0.05),而24、36、48h 时各组细胞VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：体外培养RPE细胞能够正常表达VEGF_165b,缺氧和高糖是在转录水平诱导VEGF₁₆₅ mRNA的表达上调,同时降低了VEGF_165b mRNA的表达量。     

lncRNA HIF1A-AS1对长春新碱耐药视网膜母细胞瘤细胞化疗敏感性的影响

目的：探讨长链非编码RNA-HIF1A-AS1(lncRNA HIF1A-AS1)调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α))表达对长春新碱(VCR)耐药视网膜母细胞瘤(RB)细胞化疗敏感性的影响。

方法：建立人RB VCR耐药细胞株SO-RB50/VCR，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测SO-RB50与SO-RB50/VCR细胞lncRNA HIF1A-AS1表达； 在SO-RB50/VCR细胞中抑制lncRNA HIF1A-AS1表达或同时过表达HIF-1α，检测SO-RB50/VCR细胞对VCR的半数抑制浓度(IC₅₀)及细胞增殖、凋亡情况； Western blot检测HIF-1α、多药耐药相关蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达。

结果：与SO-RB50细胞相比，SO-RB50/VCR细胞中lncRNA HIF1A-AS1与HIF-1α蛋白表达水平升高(P<0.05)； 在SO-RB50/VCR细胞中抑制lncRNA HIF1A-AS1表达后，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，细胞吸光度(OD₄₅₀)值显著降低，VCR对细胞的IC₅₀值及HIF-1α、MRP、P-gp蛋白表达水平显著降低(P<0.05)； 过表达HIF-1α可减弱下调lncRNA HIF1A-AS1表达对SO-RB50/VCR细胞耐药性的抑制作用。

结论：lncRNA HIF1A-AS1在SO-RB50/VCR细胞中高表达，抑制lncRNA HIF1A-AS1表达可通过下调HIF-1α表达，降低SO-RB50/VCR细胞对VCR的耐药性。     

Dickkopf-1调控Wnt通路在缺氧诱导的晶状体上皮细胞转分化中的作用

目的：探讨缺氧条件下Wnt/β-catenin通路在晶状体上皮细胞上皮-间充质转化(EMT)中的作用，分析Dickkopf-1(DKK-1)的表达对晶状体上皮细胞EMT的影响。

方法：将体外培养人晶状体上皮细胞(HLEB3细胞)分为正常氧培养组(加入含10% FBS的DMEM培养液)和缺氧培养组(加入含100μmol/L CoCl₂溶液的培养液进行缺氧处理6、12、24、48h)。利用免疫荧光染色法检测Wnt3a和DKK-1蛋白的表达及β-catenin蛋白的表达和定位； 利用qRT-PCR法检测DKK-1 mRNA的表达。

结果：免疫荧光染色结果显示，随着缺氧时间的延长，HLEB3细胞中Wnt3a和DKK-1蛋白表达水平明显上调，β-catenin蛋白在细胞核内积聚逐渐增多。qRT-PCR检测结果显示，与正常氧培养组相比较，缺氧培养6h组细胞中DKK-1 mRNA无显著差异(P>0.05)，而缺氧培养12、24、48h组细胞中DKK-1 mRNA表达明显增加(P<0.001)。

结论：缺氧可以激活晶状体上皮细胞Wnt/β-catenin通路，并诱导Dickkopf-1的表达，参与调控Wnt/β-catenin通路，影响EMT进程。     

水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞表达VEGF

目的：研究水蛭提取液对视网膜母细胞瘤细胞(WERI-RB-1细胞)表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响及相关分子机制。

方法：将体外培养的WERI-RB-1细胞分为对照组、0.04U/mL水蛭提取液组、0.08U/mL水蛭提取液组,对照组采用完全培养基培养48h,水蛭提取液组分别采用含0.04、0.08U/mL含药培养基培养48h。采用ELISA法检测各组细胞培养基上清液中VEGF表达水平; 采用RT-PCR法检测各组细胞缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA相对表达水平; 采用Western Blot法检测各组细胞HIF-1a、MMP-9、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、人磷酸化蛋白激酶(p-AKT)相对表达水平。

结果：与对照组比较,水蛭提取液组细胞培养基上清液中VEGF表达均降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对VEGF表达抑制率分别为32.43%、38.92%。与对照组比较,水蛭提取液组细胞HIF-1a和MMP-9 mRNA相对表达水平均明显降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对HIF-1a mRNA表达抑制率分别为27.64%、24.75%,对MMP-9 mRNA表达抑制率分别为43.97%、51.48%。与对照组比较,水蛭提取液组细胞HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白相对表达水平均明显降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对HIF-1a蛋白表达抑制率分别为55.81%、43.85%,对MMP-9蛋白表达抑制率分别为39.49%、47.23%,对PI3K蛋白表达抑制率分别为33.27%、29.83%,对p-AKT蛋白表达抑制率分别为52.07%、30.21%。

结论：水蛭提取液可能通过VEGF/PI3K/AKT通路及HIF-1a、MMP-9因子抑制WERI-RB-1细胞VEGF的表达。     

siRNA特异性沉默HIF-1α对缺氧培养的OCM-1细胞中Vimentin表达的影响

目的：研究小干扰RNA(siRNA)特异性沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对缺氧状态下人眼葡萄膜黑色瘤OCM-1细胞中波形蛋白(Vimentin)表达的影响,初步探讨HIF-1α对葡萄膜黑色瘤上皮-间质转化(EMT)的调控作用。

方法：体外常氧培养及缺氧培养OCM-1细胞。其中,缺氧培养是通过在培养基中加入浓度为100μmol/L的氯化钴(CoCl₂)模拟肿瘤内部缺氧微环境,并将缺氧培养细胞分为单纯缺氧组、HIF-1α干扰组、β-actin阳性对照组、无义寡核苷酸阴性对照组及空载脂质体对照组。体外设计合成siRNA(包括HIF-1α-siRNA、β-actin-siRNA及阴性对照),以Lipofectamine^TM 2000为载体介导siRNA转染缺氧培养的OCM-1细胞,以RT-PCR和Western blot检测缺氧培养前后及转染前后HIF-1α、Vimentin基因和蛋白的表达。

结果：单纯缺氧组与常氧组相比,HIF-1αmRNA表达无明显差异(P>0.05),蛋白表达显著升高(P<0.01),而Vimentin mRNA和蛋白的表达均显著升高(P<0.01)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(P<0.01),证实转染成功; 干扰组HIF-1α、Vimentin mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.01),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。

结论：缺氧可促使OCM-1细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高,并可通过转录激活下游靶基因Vimentin,使其在mRNA和蛋白水平表达均升高,提示HIF-1α可能参与调控葡萄膜黑色瘤的EMT,进而促进肿瘤侵袭、转移; HIF-1α-siRNA转染OCM-1细胞可成功下调HIF-1α及Vimentin的表达,说明从分子水平抑制HIF-1α的表达,可能抑制肿瘤侵袭、转移,从而为肿瘤治疗提供新方向。     

小干扰RNA沉默 HIF-1α对缺氧状态下脉络膜黑色素瘤细胞中MMP-2 表达的影响

目的：以小干扰RNA沉默人眼脉络膜黑色素瘤细胞中的低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)基因,在缺氧状态下观察其对人眼脉络膜黑色素瘤(human uveal melanoma cell,OCM-1)细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。

方法：将脉络膜黑色素瘤细胞分为正常组与缺氧组,其中将缺氧组再分成单纯缺氧组、干扰组、脂质体对照组、阳性对照组和阴性对照组; 对正常组细胞用含有浓度为10%的胎牛血清和1%的双抗(青-链霉素混合液)的DMEM高糖培养基进行培养。在缺氧组人眼OCM-1细胞的培养瓶中加入100μmol/L CoCl₂以构建肿瘤细胞内部的缺氧微环境。干扰组转染HIF-1α siRNA,阴性对照组转染无义siRNA,阳性对照组转染β-actin siRNA,脂质体对照组转染空脂质体。RT-PCR检测细胞中HIF-1α和MMP-2 mRNA的表达,行Western-blot检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达。

结果：与正常组相比,单纯缺氧组HIF-1α蛋白的表达增高(P<0.05),而其mRNA表达量无明显变化(P>0.05); MMP-2 mRNA及蛋白的表达升高(P<0.05)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(P<0.05),证实转染成功; 干扰组HIF-1αmRNA和MMP-2 mRNA和蛋白表达均下降(P<0.05),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。

结论：缺氧条件下可以提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞中HIF-1α蛋白的表达,而且HIF-1α蛋白的表达水平可以影响MMP-2的转录与翻译,从而可能进一步影响人眼脉络膜瘤细胞的外周浸润和远处转移能力。     

Mcc950对H2O2诱导的ARPE-19细胞炎性损伤的保护作用

目的：探讨Mcc950对过氧化氢(H₂O₂)诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)炎性损伤的保护作用。

方法：将ARPE-19细胞分为正常对照组、H₂O₂损伤组、单纯Mcc950给药组、Mcc950预处理+H₂O₂损伤组,采用 CCK-8法检测细胞活力并确定H₂O₂和Mcc950合适的实验浓度,ELISA法检测细胞分泌的IL-1β浓度,免疫印迹(Western blot)法检测细胞中NLRP3炎性小体相关蛋白的表达情况,TUNEL染色法观察细胞凋亡情况。

结果：细胞活力随H₂O₂刺激浓度的增加逐渐下降,H₂O₂浓度为400μmol/L时细胞活力显著降低; 而0.1、1μmol/L Mcc950对细胞活力无显著影响,故选取400μmol/L H₂O₂和1μmol/L Mcc950作为合适的实验浓度。与正常对照组相比,H₂O₂损伤组细胞活力显著降低,细胞上清液中IL-1β浓度显著升高,细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),而与H₂O₂损伤组比较,Mcc950预处理+H₂O₂损伤组细胞活力明显升高,细胞上清液中IL-1β浓度和细胞凋亡率均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,H₂O₂能够促进细胞中NLRP3、Pro-caspase1和caspase1的表达,而Mcc950预处理+H₂O₂损伤组细胞中NLRP3、Pro-caspase1依然保持高表达,但caspase1表达水平得到明显抑制,表明Mcc950能有效抑制NLRP3炎性小体的激活从而干扰具有细胞凋亡作用的成熟caspase1的产生。

结论：Mcc950能够有效抑制H₂O₂诱导的NLRP3炎性小体激活,恢复细胞活力,抑制细胞凋亡。     

miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响

目的：探讨miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响,并初步研究其分子机制。

方法：选择人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19细胞),将细胞分为7组：空白对照组(不处理)、无义miRNA组(转染mimic NC)、miRNA-147模拟物组(转染miRNA-147 模拟物)、抑制剂阴性对照组(转染shRNA NC)、VEGF抑制剂组(转染VEGF抑制剂)、miRNA-147模拟物+空载病毒载体组(转染miRNA-147模拟物和空载体)和miRNA-147模拟物+VEGF过表达组(转染miRNA-147模拟物和VEGF过表达)。使用RT-qPCR检测各组细胞miRNA-147及VEGF mRNA表达水平; 双荧光素酶实验验证miRNA-147与VEGF靶向关系; Western blot检测VEGF蛋白表达水平; MTT法检测细胞增殖; 流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞周期的改变; 细胞划痕实验检测细胞迁移。

结果：与空白对照组和无义miRNA组相比,miRNA-147模拟物组miRNA-147表达水平显著升高,VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与抑制剂阴性对照组相比,VEGF抑制剂组VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与miRNA-147模拟物+空载病毒载体组相比,miRNA-147模拟物+VEGF过表达组VEGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告显示VEGF是miRNA-147的靶基因。转染miRNA-147 模拟物和VEGF抑制剂均可降低ARPE-19细胞增殖和迁移水平,促进细胞凋亡(P<0.05)。转染VEGF过表达可逆转miRNA-147 mimic对ARPE-19细胞增殖、迁移和凋亡的影响(P<0.05)。

结论：miRNA-147可通过靶向VEGF抑制ARPE-19细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。     

姜黄素抑制BN大鼠脉络膜新生血管的机制研究

目的:探讨姜黄素抑制BN大鼠脉络膜新生血管(CNV)的机制。方法:激光光凝诱导BN大鼠36只建立CNV模型,随机分为6组,每组6只。正常组BN大鼠正常饲养,不做干预;实验组BN大鼠行532nm倍频激光光凝后,根据不同分组分别干预14d:模型组：生理盐水灌胃14d;雷珠单抗组：光凝后第2d玻璃体腔注射雷珠单抗注射液(10mg/mL,0.2mL/支)1次5μL。姜黄素组：低[100mg/(kg·d)]、中[200mg/(kg·d)]、高[400mg/(kg·d)]剂量的姜黄素混悬液分别灌胃14d。光凝14d后进行眼底照相、FFA与ICGA检查。制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白...     

表皮生长因子通过EGFR/AKT信号通路对视网膜色素上皮细胞增殖和迁徙的影响

目的：探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增殖和迁徙的影响。

方法：体外培养人RPE细胞株(ARPE-19细胞),给予不同浓度EGF处理ARPE-19细胞,通过噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)实验、5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)吸收实验和细胞划痕实验检测EGF对ARPE-19细胞活力、增殖和迁徙的影响; 通过Western blot法检测EGF对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)蛋白表达的影响。

结果：MTT实验显示50、100ng/mL EGF处理12h诱导ARPE-19细胞活力增加; BrdU吸收实验显示100ng/mL EGF处理24h诱导BrdU染色阳性ARPE-19细胞数增加; 细胞划痕实验显示100ng/mL EGF处理24h可以诱导ARPE-19细胞迁徙能力增加。Western blot检测显示使用10～100ng/mL EGF 处理细胞 12h或者100ng/mL EGF 处理细胞15～180min均可以诱导磷酸化EGFR(pEGFR)表达升高和总EGFR表达降低,同时也可以诱导磷酸化AKT(pAKT)表达升高,但是对总AKT表达无显著影响。

结论：EGF通过EGFR/AKT信号通路增加RPE细胞的活力、增殖和迁徙能力,可能对增殖性玻璃体视网膜病变中RPE细胞的异常增殖和迁徙起到重要作用。     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)合成的影响.方法 研究人RPE细胞分别在150 μmol/L CoCl2 0 μh/mL TA(0μg/mL TA组)、150μmol/L CoCl2 50 μg/mL TA(50μg/mL TA组)和150 μmol/L CoCl2 200斗g/mL TA(200μg/mL TA组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组相比,50μg/mL TA组及200μg/mL TA组中VEGF mRNA及蛋白的表达明显下降,差异均具有统计学意义(P＜005),但HIF-1α mRNA及蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TA对缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α表达无影响,但能有效地抑制VEGF的表达,对缺血性视网膜病变新生血管形成具有防治作用.     

姜黄素对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF和NF-κB p65表达的抑制作用

目的：观察不同浓度姜黄素对体外高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(HRCECs)增殖及血管内皮生长因子(VEGF)、核因子-κB(NF-κB)p65表达的影响。

方法：用高糖培养基模拟糖尿病环境建立HRCECs体外高糖模型,将培养的细胞分为：正常对照组、高糖对照组、高糖+20、40、80μmol/L姜黄素组,分别用CCK-8法检测姜黄素干预后HRCECs的增殖能力,用Western-blot及免疫细胞化学法检测VEGF、NF-κB p65的表达。

结果：CCK-8法结果示：与正常对照组比较,高糖显著促进HRCECs增殖(P<0.01),各浓度姜黄素作用12、24、48h后与高糖对照组比较,细胞增殖均有明显抑制作用(P<0.01),且呈浓度与时间依赖性。Western-blot结果示：与正常对照组比较,高糖对照组中VEGF-A、NF-κB p65表达显著增加(P<0.01),各浓度姜黄素作用12、24、48h后与高糖对照组比较,VEGF-A、NF-κB p65的表达显著减少,且随着浓度增加、时间延长抑制作用增强,各加药组间两两比较均有差异(P<0.01)。免疫细胞化学法结果示：与正常对照组相比,高糖对照组VEGF表达显著增加(P<0.01),各浓度姜黄素干预24h后与高糖对照组比较,VEGF表达逐渐下降(P<0.01),各加药组间两两比较均有差异(P<0.01)。

结论：姜黄素可呈浓度与时间依赖性地抑制高糖诱导的HRCECs增殖以及VEGF、NF-κB p65的表达,这种增殖抑制作用可能与其下调VEGF、NF-κB p65表达有关。     

纳豆激酶对高糖缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨纳豆激酶(NK)对高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的保护作用。方法 不同浓度的葡萄糖和氯化钴(CoCl₂)诱导培养ARPE-19细胞24 h后,观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测ARPE-19细胞活性。Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1(ZO-1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18的表达情况,筛选最佳葡萄糖和CoCl₂浓度构建体外高糖缺氧的细胞模型。CCK-8法筛选合适的NK浓度,将ARPE-19细胞分为正常糖组(5.5 mmol·L^-1葡萄糖,NC组)、高糖+CoCl₂组(25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200μmol·L^-1 CoCl₂,HG+CoCl₂组)和NK处理组(1.0μmol·L^-1 NK+25.0 mmol·L^-1葡...     

柚皮素对ARPE-19和HUVEC细胞的抗氧化作用

目的：研究柚皮素对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的抗氧化作用。 方法：采用MTT的方法检测ARPE-19和HUVEC细胞的生存率及增殖率。 结果：3，10mg／L柚皮素能显著增加ARPE-19细胞的增殖率达10．8％和11．4％。10mg／L柚皮素能提高ARPE-19细胞在缺氧，0．3mmol／LNaN，及200μmol／L，H2O2条件下的生存率分别为55．2％，69．2％及50．3％。1mg／L柚皮素能提高ARPE-19细胞在50μmol／L t-BHP和30mg／LNaIO3条件下的生存率达20．2％和30．4％。30mg／L柚皮素能够促进ARPE-19细胞在50μmol／L t-BHP条件下的增殖率达32．2％，而1mg／L柚皮素可以提高30，100，300mg／LNaIO3处理的ARPE-19细胞的增殖率达30．3％，10．3％及18．5％。3，10及30mg／L柚皮素抑制HUVEC的增殖率分别为23．9％，70．4％及77．9％。1，3mg／L柚皮素能提高HUVEC细胞在缺氧条件下的生存率达10．7％和13．1％，以及提高在300mg／LNaIO3条件下的生存率达41．2％和37．7％。3mg／L柚皮素能提高HUVEC细胞在200，400μmol／L H2O2条件下的生存率达20．1％和21．5％． 结论：柚皮素能够促进ARPE-19细胞的增殖率，抑制HU-VEC生长，同时对这两种细胞均有抗氧化作用。因此，柚臾素是治疗老年黄斑变性的很有前景的候选药物。     

高糖诱导的人晶状体上皮细胞葡萄糖关键代谢酶的表达

目的：探讨葡萄糖关键代谢酶在高糖诱导的人晶状体上皮(HLEB3)细胞中的表达情况。

方法：将体外培养的HLEB3细胞分为正常对照组(采用DMEM培养液培养,含葡萄糖5mmol/L)、氧化应激组(采用含H₂O₂ 200μmol/L的DMEM培养液培养)、高糖诱导组(采用含葡萄糖30mmol/L的培养液培养),培养24h后检测细胞凋亡情况和细胞活力及6种葡萄糖关键代谢酶(6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶、柠檬酸合成酶、α-酮戊二酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶)的mRNA表达情况。

结果：高糖诱导HLEB3细胞凋亡,高糖诱导组(63.43%±3.40%)细胞活力低于正常对照组(100.00%±0.00%)和氧化应激组(91.90%±5.11%),且高糖诱导组细胞6种葡萄糖代谢关键酶的mRNA表达水平均低于正常对照组和氧化应激组(均P<0.05)。

结论：高糖可以诱导HLEB3细胞葡萄糖关键代谢酶的表达水平降低,诱导细胞凋亡,影响细胞活性。     

脂联素对视网膜血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用及机制研究

目的：研究脂联素对缺氧损伤的恒河猴脉络膜/视网膜内皮(RF/6A)细胞的保护作用及相关机制。

方法：将体外培养的RF/6A细胞随机分为对照组、缺氧损伤(CoCl₂刺激诱导24h)组和缺氧损伤+脂联素(5、50、100μmol/L脂联素预处理6h)组。采用MTT法检测细胞活力,选择合适的脂联素内皮细胞保护作用浓度,并采用Western blot检测凋亡相关因子Bax、Bcl-2的表达情况,同时测定细胞内活力氧簇(ROS)的表达水平。

结果：与对照组相比,缺氧损伤组和各浓度脂联素预处理的RF/6A细胞活力均下降(均P<0.01); 与缺氧损伤组相比,各浓度脂联素预处理后细胞活力均显著增加(均P<0.05),其中50μmol/L脂联素是较为合适的保护作用浓度。与对照组相比,缺氧损伤组细胞活力降低,Bax蛋白表达量升高,Bcl-2蛋白表达量降低,ROS生成增加(P<0.01); 与缺氧损伤组相比,脂联素预处理后细胞活力增加,Bax蛋白表达量降低,Bcl-2蛋白表达量增加,ROS生成减少(P<0.01)。

结论：脂联素可明显减轻缺氧造成的视网膜血管内皮细胞损伤和凋亡,其机制可能与脂联素减轻氧化应激有关。     

lncRNA KCNQ1OT1通过miR-19a-3p/TSHZ3影响高糖诱导的人视网膜上皮细胞增殖与凋亡

目的：观察长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1OT1通过miR-19a-3p/TSHZ3影响高糖(HG)诱导的人视网膜上皮细胞(ARPE-19)增殖、凋亡与氧化应激情况。

方法：运用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测5、15、45、135mmol/L HG刺激的ARPE-19的细胞存活率。将ARPE-19细胞分为NC组、45mmol/L HG组、si-NC+45mmol/L HG组、si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组、miR-NC+45mmol/L HG组、miR-19a-3p mimics+45mmol/L HG组、si-con+45mmol/L HG组、si-TSHZ3+45mmol/LHG组、pcDNA+si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组、pcDNA-TSHZ3+si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组。运用CCK-8检测细胞存活率,qRT-PCR检测lncRNA KCNQ1OT1、miR-19a-3p和TSHZ3 mRNA表达,Western Blot检测TSHZ3、活化-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)蛋白质的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测氧化应激指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平。双荧光素酶活性检测lncRNA KCNQ1OT1和miR-19a-3p、miR-19a-3p和TSHZ3之间的靶向结合。

结果：15、45、135mmol/L HG抑制ARPE-19细胞的存活率,后续选择细胞存活率约50%的HG浓度45mmol/L。45mmol/L HG提高ARPE-19细胞中lncRNA KCNQ1OT1、TSHZ3 mRNA、TSHZ3蛋白表达水平、凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、ROS和MDA水平,降低miR-19a-3p表达水平、细胞存活率(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1、TSHZ3低表达或miR-19a-3p高表达提高HG诱导的ARPE-19细胞的存活率,降低凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、ROS和MDA水平(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1靶向miR-19a-3p,miR-19a-3p靶向TSHZ3,lncRNA KCNQ1OT13通过miR-19a-3p调控TSHZ3的表达。lncRNA KCNQ1OT1低表达对HG诱导的ARPE-19细胞存活率、凋亡以及氧化应激的影响被TSHZ3过表达所逆转。

结论：lncRNA KCNQ1OT13低表达通过miR-19a-3p/TSHZ3,促进HG诱导的ARPE-19,并抑制其凋亡和氧化应激。