3-methyladenine下调自噬对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响

目的探讨自噬对脑缺血再灌注损伤的影响。方法 54只CD-1小鼠随机分为假手术对照组6只,缺血再灌注组24只,盐水对照组9只和3-MA组15只。缺血再灌注组再分为6、12、24和48h组,每组6只。采用线拴法建立t-MCAO模型。假手术组和缺血再灌注组小鼠不给药,盐水对照组小鼠给予5μL生理盐水;3-MA组小鼠麻醉后置于立体定位架,术前30min用Hamilton注射器于左侧侧脑室定位后分别注射5μL浓度为2、10、50mM的3-MA。采用Western blot半定量检测再灌注后缺血侧/左侧皮层、海马和纹状体LC3Ⅱ蛋白表达变化,TTC染色观察3-MA(10mM)组和对照组缺血再灌注后24h脑梗死体积及水肿率。结果缺血再灌注组6、12、24、48h皮层、海马和纹状体LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达均有升高趋势,其中皮层和海马区LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达于24h升高最为明显,与假手术组比较,差异有统计学意义(P0.05);而缺血再灌注组各个时间点纹状体区LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达量与假手术组比较,差异均无统计学意义(P0.05);与盐水对照组比较,3-MA(10mM)组小鼠脑梗死体积明显减少[(26.72±1.53)mm~3对(51.80±2.85)mm~3,P0.001],水肿率明显降低[(7.82±0.75)%对(16.55±4.47)%,P0.01]。结论自噬的下调对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用。     

脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响

目的：探讨脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响。方法：72只大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组（分别再灌0、6、12、24、36 h）,每组12只。采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。神经功能缺损评分评价大鼠海马神经功能,HE染色检测大鼠海马神经细胞损伤,透射电镜下观察海马神经元内自噬小体,Western blot检测Beclin-1、LC3 II、p62、p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表达。结果：与假手术组比,随着脑缺血再灌注的时间延长,脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、自噬小体数量均增加（均P＜0.05）;随着脑缺血再灌注的时间延长,大鼠海马组织自噬相关蛋白Beclin-1和LC3 II表达显著上调、p62表达下调（P＜0.05）;PI3K/mTOR通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达显著下调（P＜0.05）。结论：脑缺血再灌注可增强大鼠海马神经元自噬,抑制PI3K/mTOR信号通路。     

自噬在缺血预处理减轻大鼠肢体缺血再灌注心肌损伤中的作用

目的 探讨自噬在缺血预处理减轻大鼠肢体缺血再灌注心肌损伤中的作用。 方法 雄性SD大鼠28只,8周龄,体重200~250 g,采用随机数字表法,将其分为4组(n_i=7):假手术组(S组)、肢体缺血再灌注组(IR组)、肢体缺血预处理组(IPR组)、自噬抑制剂处理组(3-MA组)。采用夹闭双侧股动脉缺血4 h后恢复灌注4 h的方法建立肢体缺血再灌注模型;采用股动脉夹闭前30 min实施缺血5 min,再灌注5 min,循环3次后建立肢体缺血预处理模型;3-MA组于缺血预处理前30 min腹腔注射3-甲基腺嘌呤1.5 ml/kg。再灌注4 h后处死大鼠取心肌组织,电镜下观察自噬小体形成情况和病理学结果,采用HE染色和TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况,采用Western blot法检测LC3-Ⅱ的表达情况。 结果 与S组相比,IR组、IPR组、3-MA组心肌细胞凋亡比例明显升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达上调(P<0.05);与IR组相比,IPR组细胞凋亡降低、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达下调(P<0.05);与IPR组相比,3-MA组细胞凋亡比例升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达下调(P<0.05)。 结论 自噬参与了肢体缺血预处理减轻大鼠肢体缺血再灌注心肌损伤的作用。      

缺血预处理通过增强自噬水平及抑制自噬性细胞死亡保护脊髓神经

目的:探讨缺血预处理保护脊髓神经的具体机制?方法:50只成年SD大鼠随机分为假手术组(A组5只)?缺血再灌注组(B组20只)?缺血预处理组(C组5只)?缺血预处理+缺血再灌注组(D组20只)?A组动物麻醉后仅切开腹腔后关腹;B组和D组采用左肾下方0.5 cm处腹主动脉夹闭法夹闭0.5 h后松开,再灌注3?6?12?24 h,其中D组在缺血再灌注损伤前行缺血5 min?再灌注5 min缺血预处理,共3次;C组仅行3次缺血预处理?造模成功后,利用HE染色和免疫组化评估各组神经元的存活率,透射电镜观察自噬活性,免疫组化和蛋白印迹分析自噬标志物LC3-Ⅱ和自噬相关蛋白Beclin-1的表达情况?结果:缺血再灌注组中,LC3-Ⅱ蛋白在再灌注3 h后显著升高达到峰值后明显下降,24 h后几乎无表达;Beclin-1蛋白于再灌注后3 h开始升高且在24 h达到峰值;再灌注24 h后实验动物表现出明显的脊髓损伤症状,脊髓神经细胞存活率明显降低?缺血预处理+缺血再灌注组中,LC3-Ⅱ蛋白表达从再灌注3 h开始升高并持续至再灌注24 h;Beclin-1蛋白在再灌注24 h后才开始升高;与缺血再灌注组相比,缺血预处理+缺血再灌注组脊髓神经元死亡率明显降低?结论:缺血预处理通过维持缺血再灌注后神经细胞自噬水平并抑制自噬性细胞死亡从而保护脊髓神经细胞?     

半胱氨酰白三烯受体拮抗剂通过下调自噬减轻长爪沙鼠的全脑缺血再灌注损伤

目的 探讨半胱氨酰白三烯受体拮抗剂(普鲁司特?HAMI 3379)对长爪沙鼠全脑缺血再灌注损的保护作用及其作用机制?方法 采用结扎双侧颈总动脉缺血10 min 再灌注24 h,建立长爪沙鼠全脑缺血再灌注损伤模型,随机分为假手术组?模型组?普鲁司特?HAMI 3379 组,每组20 只,术前3 d 开始腹腔注射给药,1 次/ 日,术前30 min 给药1 次?观察再灌注24 h 神经症状及功能;尼氏染色法观察皮层及海马区神经元;免疫印迹法检测皮层?海马中自噬相关蛋白beclin-1 及LC3 的表达情况;电镜观察海马区自噬小体?结果与模型组比较,普鲁司特?HAMI 3379 组可提高神经症状评分,减少神经功能损伤,减轻皮层及海马区神经元损伤及丢失,减少自噬相关蛋白beclin-1 及LC3 的表达及海马区自噬小体的数量?结论 半胱氨酰白三烯受体拮抗剂通过下调大脑皮层?海马区的自噬减轻长爪沙鼠全脑缺血再灌注损伤?     

二甲双胍促进AMPK、TFEB表达改善自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:探究二甲双胍(Met)对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及机制。方法:建立大鼠脑缺血再灌注模型，随机分为假手术组、缺血再灌注组、Met预处理组[造模前3周腹腔注射Met 100 mg/(kg·d)],TTC染色检测各组大鼠脑梗死体积改变，HE染色观察脑组织病理变化；蛋白免疫印迹法检测各组大鼠脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62等自噬相关蛋白以及AMP活化蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK(Thr172)、转录因子EB(TFEB)相关通路蛋白含量。结果:与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠脑组织病理损伤严重，脑梗死体积增高(P<0.001);与缺血再灌注组相比，Met预处理组大鼠脑梗死体积减少(P<0.01),脑组织病理损伤减轻。与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平表达减少(P<0.05),p62蛋白表达增多(P<0.001);与缺血再灌注组相比，Met预处理组大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达均增多(P<0.05),p62蛋白表达减少(P<0.01);与假手术组相比，缺血再...     

氯离子通道3在脑缺血再灌注大鼠皮质和海马中的表达

目的研究大鼠脑缺血再灌注后额叶皮质和海马电压门控氯离子通道3(ClC-3)mRNA和蛋白的表达。方法健康雄性SD大鼠48只随机分为对照组(n=8)、假手术组(n=8)和模型组(n=32),对照组不作任何处理,模型组按再灌注后处死的时间分为6、24、48、72 h共4个亚组。除对照组外用线栓法制作大鼠全脑缺血再灌注模型,模型组将预先经多聚赖氨酸及肝素处理过的3/0尼龙线经切口顺颈总动脉插入颈内动脉(19.5±0.5)mm,而假手术组置线栓深度为10 mm。应用RT-PCR、Western blot技术检测大鼠皮质和海马ClC-3 mRNA及蛋白的表达。结果 ClC-3 mRNA在对照组及假手术组大鼠额叶皮质和海马中均有少量表达。模型组大鼠额叶皮质与海马在缺血再灌注6 h后ClC-3 mRNA开始升高,24 h为表达高峰,48 h开始下降,与对照组和假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot与RT-PCR结果基本一致。结论 ClC-3表达上调可能增强缺血再灌注后细胞对氧化应激、炎性反应、凋亡的适应性。     

Apelin-13对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究

目的:研究Apelin-13对缺血/再灌注小鼠脑损伤的作用,并初步探讨其对自噬性细胞死亡的影响。方法:取健康雄性CD-1小鼠,随机分为假手术(sham)组、生理盐水(Saline)组、Apelin组;Apelin组和Saline组首先建立脑缺血再灌注(MCAO/R)模型,再灌注即刻给予同侧侧脑室注射Apelin-13或等量生理盐水,然后在再灌注48 h后,进行神经功能方面检测,同时利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评估脑梗死体积;缺血再灌注24 h和48 h后,采用West-blot法检测各组自噬相关蛋白LC3的表达情况。结果:Apelin-13可显著降低小鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损症状,减少脑梗死体积,减低自噬相关蛋白LC3的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。结论:Apelin-13对小鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用,抑制神经细胞的自噬性死亡可能是其作用机制之一。     

异丙酚通过诱导幼鼠海马神经元线粒体自噬减轻其肝缺血再灌注后脑损伤

目的:探究异丙酚对肝缺血再灌注后幼鼠海马神经元线粒体自噬的影响。方法: C57BL/6两周龄的小鼠40只被随机分成4组（n=10）:假手术组(S组),肝缺血再灌注组（IR组）,异丙酚组（P组）,异丙酚+自噬抑制剂3-MA组（3-MA组）,除S组仅进行开关腹操作外,其余各组均行缺血60 min,再灌注6h建模。取血组织标本及海马组织标本。ELISA法检测血清中脑损伤标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）和S100β浓度及炎症因子白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度;透射电镜法观察自噬小体和线粒体超微结构;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Nix及凋亡蛋白Caspase-3的表达水平。结果:（1）脑损伤标志物和炎症因子水平, 3-MA组最高,其次为IR组,P组居中,S组最低（P＜0.05）;（2）自噬小体,P组最多,且线粒体结构较完整,依次为IR和S组,3-MA组自噬最少,线粒体肿胀,分裂最多;（3）LC3Ⅱ、Nix蛋白表达水平同上述线粒体自噬水平一致,Caspase-3与此相反（P＜0.05）。结论:异丙酚可促进肝缺血再灌注后幼鼠海马神经元的线粒体自噬,减轻炎症反应,减少细胞凋亡。     

通络清脑注射粉针对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑保护作用及神经元自噬相关蛋白表达的影响研究

背景　细胞自噬所致神经元凋亡是脑缺血后神经损伤的重要环节,而以通络清脑注射粉针为代表的清热解毒通络疗法在只辨病、不辨证的情况下治疗大鼠脑缺血亦能取得良好疗效,因此推测通络清脑注射粉针发挥脑保护作用的机制很可能与抑制细胞自噬有关。目的　探讨通络清脑注射粉针对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑保护作用及神经元自噬相关蛋白表达的影响。方法　本实验于2019年1月-2020年3月实施,共选取SPF级成年雄性SD大鼠36只,编号后采用随机数字表法分为假手术组、模型组、通络清脑组,每组12只。采用线栓法制备大鼠脑缺血-再灌注损伤模型（假手术组大鼠只进行血管分离、不进行其他操作）,通络清脑组大鼠经尾静脉缓慢推注浓度为18.75 mg/ml的通络清脑溶液3.2 ml/kg,假手术组、模型组大鼠经尾静脉注射等体积0.9%氯化钠溶液。比较三组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比及再灌注24 h后海马区神经元损伤情况、海马区和皮质区自噬体形成情况、海马区神经元自噬相关蛋白〔包括磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）、Beclin1、自噬微管相关蛋白1轻链3（LC3）〕表达情况。结果　模型组、通络清脑组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比高于假手术组,而通络清脑组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比低于模型组（P<0.05）。再灌注24 h后假手术组大鼠海马区神经元未见明显坏死、海马区和皮质区均偶见自噬体,模型组大鼠海马区缺血区神经元结构破坏严重、大量神经元丢失且海马区和皮质区均可见双层膜结构自噬体,通络清脑组大鼠海马区缺血区神经元坏死范围较模型组缩小、神经元损伤明显缓解且海马区和皮质区自噬体数量均减少。再灌注24 h后模型组、通络清脑组大鼠海马区p-NF-κB、LC3相对表达量及模型组Beclin1相对表达量高于假手术组,而通络清脑组大鼠海马区p-NF-κB、Beclin1、LC3相对表达量低于模型组（P<0.01）。结论　通络清脑注射粉针可有效改善脑缺血-再灌注损伤大鼠神经功能,减轻脑梗死程度、神经元损伤,减少自噬体形成及神经元凋亡,抑制神经元自噬相关蛋白p-NF-κB、Beclin1、LC3的表达,其发挥脑保护作用的机制可能与抑制神经元过度自噬有关。