同种异体共培养大鼠骨髓间充质干细胞的神经分化诱导鉴定

目的：探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外的共培养方法，并行神经分化诱导。方法：分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，各传至第3代后。取等量细胞混合后共培养，共培养的细胞再次传代后进行神经方向诱导，并行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：共培养的大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后出现神经元和胶质细胞形态，经Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色证实为神经细胞。结论：同种异体共培养的骨髓间充质干细胞可在体外定向诱导为神经元和胶质细胞等神经细胞。     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.     

缝隙连接阻断剂1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体软骨分化的影响

[目的]研究缝隙连接阻断剂1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体外软骨分化的影响。[方法]体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,以生长分化因子-5(GDF-5)(100ng/ml)和1-庚醇(2.5μmol/L)干预培养后,MTT法测定1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞增殖的影响,RT-PCR和免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达,Westernblotting检测Cx43蛋白的表达,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。[结果]MTT结果显示2.5μmol/L浓度1-庚醇对小鼠MSCs的增殖不产生影响,对细胞没有毒性抑制作用;RT-PCR和免疫细胞化学显示1-庚醇能够抑制Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达;Alcian染色结果显示1-庚醇抑制分化细胞分泌蛋白多糖基质;Western blotting结果表明1-庚醇对Cx43蛋白的表达没有作用。[结论]GDF-5能够定向诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨方向分化,Cx43蛋白介导的缝隙连接细胞间通讯在GDF-5诱导软骨分化中发挥着很重要的作用。     

不同浓度转化生长因子-β1对人骨髓间充质干细胞/海藻酸钠复合物体外软骨形成能力的影响

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSCS）体外定向分化为软骨样组织的可行性以及不同浓度TGF-β1对人MSCs／海藻酸钠复合物体外软骨形成能力的影响。方法将体外培养扩增的人骨髓间充质干细胞与海藻酸钠结合，制成MSCs／海藻酸钠复合物，诱导培养液中添加不同浓度TGF-β1，在培养的不同时间进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学，原位杂交，蛋白多糖的特殊染色，以及蛋白多糖的定量检测。结果细胞在海藻酸钠中生长良好，可见细胞分裂增殖，形成同源细胞团。10μg／L诱导组Ⅱ型胶原表达阳性，基质中有红染的黏多糖物质的堆积，蛋白多糖定量检测均高于其他实验组（P〈0.05）。结论TGF-β1浓度过低不能诱导软骨形成，而浓度过高则不利于软骨形成，10μg／L是体外诱导软骨形成的适宜浓度。海藻酸钠是运载MSCs的理想载体和支架。     

人骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化的研究

目的探讨体外单层培养中诱导人骨髓间充质干细胞(Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,hBMSCs)向软骨细胞定向分化的条件.方法采集志愿者骨髓3例,分离培养BMSCs,流式细胞仪分析表面标志.用含TGF-β1的无血清诱导培养基培养7d后,分别行Ⅱ型胶原免疫组化、原位杂交检测,碱性磷酸酶染色,3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验检测细胞的增殖情况.结果培养的BMSCs表达CD9,而CD34、CD38、CD45、CD61呈阴性.细胞经诱导培养7d后免疫组化、原位杂交可检测到Ⅱ型胶原的表达,碱性磷酸酶染色呈弱阳性,但细胞3H-TdR掺入量低于对照组(P<0.05).结论BMSCs在特定的诱导下能向软骨细胞方向分化,但在无血清培养基中无法有效的增殖.     

自体富血小板血浆诱导兔脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]体外分离、培养、鉴定兔脂肪干细胞,探讨富血小板血浆体外诱导脂肪干细胞成软骨分化潜能。[方法]取Ⅰ型胶原酶消化兔脂肪后,贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代细胞分别予以成脂、成骨诱导,证实其多向分化潜能;同时取第3代细胞予以富血小板血浆诱导,2周后倒置显微镜观察细胞形态,行Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。[结果]可以从兔脂肪中培养出脂肪干细胞,成脂、成骨诱导证实其多向分化潜能。经自体富血小板血浆诱导的脂肪干细胞,其Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。实时荧光定量PCR检测发现经自体富血小板血浆诱导的兔脂肪干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于对照组未经诱导的兔脂肪干细胞(P<0.01)。[结论]自体富血小板血浆可以有效诱导兔脂肪干细胞表达II型胶原和蛋白聚糖,可以诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化。     

质粒修饰BMSC联合纳米支架促进软骨缺损修复的相关研究

目的探究慢病毒介导聚蛋白多糖(Aggrecan)过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架向软骨细胞转化及软骨缺损修复的作用效果。方法构建慢病毒聚蛋白多糖过表达载体,培养骨髓间充质干细胞,构建兔模型软骨缺损模型,实验组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+转染聚蛋白多糖过表达载体骨髓间充质干细胞复合物;阴性对照组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物;模型组造模后加入生理盐水处理。体外实验利用HE染色和免疫组织化学染色检测骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架的联合培养体系向软骨细胞转化中聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。构建兔膝关节软骨缺损模型,HE染色和免疫组织化学分析复合支架材料对软骨缺损的修复效果。结果 a)实验组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)中支架表面黏附的细胞与对照组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+未转染骨髓间充质干细胞)相比,细胞数明显增多;b)动物模型大体观察结果显示,实验组的修复效果要明显优于阴性对照组;c)动物模型HE染色结果显示,阴性对照组多为纤维性修复,而实验组多为细胞性修复;d)免疫组织化学染色结果显示,实验组修复软骨组织中Aggrecan和Ⅱ型胶原含量要明显优于阴性对照组。结论 Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以促进BMSC向软骨细胞的分化,并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型胶原成分的细胞外基质,从而发挥其促进软骨缺损修复的作用。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的研究体外三维培养条件下,成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化软骨细胞可行性。方法用密度梯度离心法分离纯化BMSCs,并传代扩增后,用离心三维培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养,以常规培养液培养的BMSCs作为阴性对照,于诱导培养第21天取出标本行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、s-100蛋白免疫组织化学检测。结果BMSCs经21d的离心三维诱导培养后,培养管出现软骨外观组织块,组织切片甲苯胺蓝染色呈明显异染,s-100蛋白免疫细胞化学检测阳性。对照组阴性。结论成人BMSCs在三维培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞。