银染法观察葡萄球菌生物被膜

[目的]探讨银染法观察葡萄球菌生物被膜方法的可靠性。[方法]建立细菌生物被膜,分别用银染法和扫描电镜进行观察。[结果]银染后普通光学显微镜观察和扫描电镜观察生物被膜的结果完全相符。[结论]用银染法观察细菌生物被膜的变化方便、可靠。     

不同浓度头孢他啶对腹膜透析管大肠杆菌生物被膜的干预作用

目的 探讨不同浓度头孢他啶对大肠杆菌生物被膜的影响.方法 采用刚果红染色鉴定临床分离的大肠杆菌形成生物被膜的能力,透析后腹膜透析液一腹膜透析管系统建立大肠杆菌生物被膜,分别用连续稀释涂板细菌菌落计数和银染法染色后显微镜观察细菌生物被膜在低浓度(1 ×MIC)和高浓度(1×MBC)头孢他啶作用前后的变化情况.结果 该大肠杆菌菌株建模7d形成成熟生物被膜.低浓度头孢他啶对成熟生物被膜作用不显著(P＞0.05),而高浓度头孢他啶能显著减少成熟生物被膜内活菌数(P＜0.01),且破坏生物被膜作用明显.结论 高浓度头孢他啶能破坏成熟大肠杆菌生物被膜.     

银染法鉴定铜绿假单胞菌生物膜

目的:观察银染法鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)生物膜的效果。方法:体外平板法制备PA生物膜模型,用银染法及扫描电镜进行观察鉴定。结果:银染后普通光学显微镜和扫描电镜对生物膜观察结果相符。结论:可以用银染法观察细菌生物膜,方法简单、可靠。     

大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物被膜的影响

目的：观察不同结构的大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物被膜的影响,为临床合理应用大环内酯类药物治疗细菌生物被膜病提供理论依据。方法：平板培养法培养细菌生物被膜,银染法鉴定,经不同浓度大环内酯类药物与加替沙星对生物被膜处理后,用MTT法测定存活细菌数。结晶紫染色法观察不同浓度大环内酯类药物对铜绿假单胞菌粘附性的影响。结果：1／16,1／4MIC的克拉霉素,阿齐霉素强减少加替沙星作用后被膜存活菌数（P＜0．05）,并可减少细菌对硅胶片的粘附（P＜0．05）,而螺旋霉素无明显作用。结论：减少细菌的粘附,防止细菌生物被膜的形成,是克拉霉素,阿齐霉素可与抗菌药物（加替沙星）起到协同杀菌作用的可能原因之一。     

阿奇霉素对气管导管内流感嗜血杆菌生物被膜的影响

目的：观察流感嗜血杆菌是否可在气管导管内形成生物被膜并评价阿奇霉素对气管导管内流感嗜血杆菌形成生物被膜的影响。方法选取 Wistar 大鼠120只,分为空白对照组、感染组及给药组;流感嗜血杆菌制备成琼脂小珠,接种于气管插管大鼠,扫描电镜观察气管导管生物被膜形成情况,并通过细菌计数评价疗效。结果接种细菌后第1天扫描电镜可见导管壁表面凹凸不平,外被黏液样物质,并可见细长的菌体被覆其中,给予阿奇霉素治疗后,感染组和给药组均可在气管插管形成生物被膜,但给药组细菌数明显降低。结论流感嗜血杆菌可在气管插管形成生物被膜,阿奇霉素对流感嗜血杆菌气道内导管早期生物被膜有一定抑制作用。     

抗藻酸盐血清与加替沙星联合对铜绿假单胞菌生物被膜形态的影响

目的　探讨抗藻酸盐血清对黏液型铜绿假单胞菌生物被膜中细菌形态上的影响。方法采用改良的组织培养平板法建立黏液型铜绿假单胞菌生物被膜模型 ,经不同稀释度的抗藻酸盐血清与不同浓度的加替沙星联合应用处理后 ,以银染法快速鉴定 ,扫描电镜 (SEM)确认细菌生物被膜形态 ,并采用计算机图像处理系统进行图像分析。结果　计算机图像分析系统显示 ,空白组生物被膜的平均光密度为 0 82± 0 0 6 ;加入抗藻酸盐血清后 ,抗藻酸盐血清组、抗藻酸盐血清与加替沙星联合用药组生物被膜的平均光密度值分别为 0 79± 0 0 6和 0 70± 0 0 4 ,加替沙星单独用药组生物被膜平均光密度值为 0 76± 0 0 7的 ;光镜和电镜图像可见黏液样物变稀疏 ,细菌数减少 ,形态不甚规则。结论抗藻酸盐血清能够影响黏液型铜绿假单胞菌生物被膜构建和形态 ,与加替沙星联用后可以使黏液型铜绿假单胞菌生物被膜结构发生不同程度破坏。     

阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制作用

目的研究阿奇霉素对铜绿假单胞茵生物被膜的抑制作用。方法将阿奇霉素标准品用生理盐水配成不同的浓度，与培养的铜绿假单胞茵生物被膜作用，6d后用扫描电镜观察生物被膜的情况。结果未用阿奇霉素的硅胶片上可见较厚的生物被膜形成，而应用阿奇霉素后可见生物被膜较对照组薄且有碎裂，其变化与阿奇霉素的浓度相关。结论阿奇霉素可能抑制铜绿假单胞茵生物被膜的形成。     

抗生素对生物被膜菌产生β-内酰胺酶的影响

目的探讨生物被膜肺炎克雷伯杆菌耐药机制,为临床选用抗生素提供理论依据。方法用改良平板培养法建立肺炎克雷伯杆菌生物被膜模型。用银染法及扫描电镜对生物被膜进行鉴定。分别检测浮游菌(A组)、生物被膜菌(B组)、亚胺培南作用生物被膜菌(C组)、头孢西丁作用生物被膜菌(D组)、阿奇霉素作用生物被膜菌(E组)产生β-内酰胺酶的活性。结果B组β-内酰胺酶活性(0.550±0.099)u/mg高于A组(0.333±0.029)u/mg,是A组1.65倍(P<0.01);C组(0.773±0.038)u/mg、D组(0.663±0.056)u/mg均高于B组(P<0.01);C组高于D组(P<0.01);B组高于E组(0.417±0.025)u/mg(P<0.01)。结论生物被膜肺炎克雷伯杆菌产生大量β-内酰胺酶是其耐药主要原因之一,阿奇霉素能够减少生物被膜肺炎克雷伯杆菌β-内酰胺酶的产生。     

置入性导管相关感染的病原菌与生物被膜形成

目的检测分析置入性导管相关的细菌感染中病原菌的构成及其生物被膜形成的情况。方法对引起感染的导管表面刮取物进行分离、培养及菌种鉴定,同时用阿利新蓝-刚果红染色法观察细菌生物被膜的形成情况,分析两者间的关系。结果气管插管中的病原菌以铜绿假单胞菌为主,导尿管内大肠埃希菌检出率最高,感染导管表面细菌生物被膜形成的阳性率为50.28%(89/177),其中铜绿假单胞菌成膜率最高70.42%(50/71)。结论导管相关性细菌感染的病原体以革兰阴性杆菌为主,容易形成生物被膜是其重要因素,阿利新蓝-刚果红染色法简便快速,可用于细菌生物被膜的初步观察和检测。     

气管导管壳聚糖涂膜的制备与性能研究

目的:制备能有效抑制细菌生物被膜(BF)生成的壳聚糖气管导管涂膜。方法:以分子量5 000和100万的壳聚糖为原料制备在气管导管内壁制膜(按2:1比例混合后涂膜),考察壳聚糖膜的成膜性、与气管导管的黏附性。以空白导管(对照组)和涂膜后的导管为载体,依次设为第1、2实验组,构建形成7d的大肠埃希菌生物被膜,然后细菌计数、生物被膜定量、扫描电镜(SEM)观察。结果:涂膜可紧密贴含在气管导管内壁,生理条件下与气管导管黏附时间为18d。对照组和实验组的细菌计数分别是2.29×10~7CFU/ml、1.19×10~7CFU/ml;吸光度为0.137、0.050;扫描电镜下,对照组的细菌密集、均匀,细胞壁较光滑、菌体规则;实验组的细菌少,呈聚集状,菌体有凹陷、扭曲现象。结论:按该方法制备的涂膜有较好的成膜性、黏附性和抑制BF效果。     

百肤青抗铜绿假单胞菌生物膜的作用

目的:观察百肤青体外抗铜绿假单胞菌生物膜的作用.方法:通过琼脂稀释法测定铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),用改良平板法建立体外铜绿假单胞菌生物膜并检定不同MIC浓度的抗铜绿假单胞菌生物膜的作用,扫描电镜确认. 结果:4种不同MIC的百肤青都有抗铜绿假单胞菌生物膜的作用.结论:中药复方百肤青由于其有抗铜绿假单胞菌生物膜的作用,不仅可用于治疗细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV),还有预防BV的作用.     

氨溴索联合左氧氟沙星对粘液型铜绿假单胞菌生物被膜的体外干预作用研究

目的探讨盐酸氨溴索（Ambroxol Hydrochloride,Amb）联合左氧氟沙星（Levofloxacin,LFX）对粘液型铜绿假单胞菌生物被膜（biofilm,BF）的影响。方法以铜绿假单胞菌粘液型菌株PDO300为实验菌株,构建体外BF模型。分为生理盐水对照组、Amb组、LFX组、Amb与LFX联合作用组,二倍稀释法测定LFX最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）,结晶紫染色法定量测定BF形成量。结果 PDO300培养7d后可形成稳定的BF。与单独应用LFX相对比,Amb与LFX联合作用后测定载体表面BF值显著降低（P〈0.01）,且载体表面BF随着LFX浓度增高而减少。结论 Amb可显著增强LFX对BF的破坏作用。     

三种细菌生物被膜中超广谱β-内酰胺酶的检测

目的检测肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞茵三种细菌的生物被膜(Biofilm,BF)中超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)的产生.方法用改良平板培养法在硅胶膜上建立肺炎克雷伯菌、大肠杆茵、铜绿假单胞茵BF的体外模型.用银染法及扫描电镜对BF进行鉴定.用双纸片试验检测ESBLs,等电聚焦电泳测定β-内酰胺酶的等电点.结果三种细菌的各30株中,BF肺炎克雷伯菌组(A2组)中ESBLs的产生率最高,为14株(46.7%),其浮游茵组(A1组)检出8株(26.7%);BF大肠杆菌组(B2组)其次为10株(33.3%),其浮游菌组(B1组)检出6株(20.0%);BF铜绿假单胞茵组(C2组)为3株(10%),其浮游组(C1组)为2株(6.7%).浮游菌组中ESBLs的产生率低于BF茵组,其中肺炎克雷伯菌及大肠杆菌的BF组和浮游茵组的检出率之间有显著差异,P＜0.05.A2组共检出14株产生ESBL,有4种ESBL,等电点分别为8.2(4株)、7.6(8株)、6.3(1株)和5.6(1株),A1组检出8株产生ESBLs,为3种ESBLs,等电点分别为8.2(2株)、7.6(5株)和5.6(1株);B2、B1组检出2种相同等电点分别为7.6(B1组4株,B2组6株)、8.2(B1组2株,B2组4株)的ESBLs;C1、C2组检出1种等电点为6.4的ESBLs(C1组2株,C2组3株).以pI为7.6的β-内酰胺酶的检出率为最高,其次是pI为8.2的酶.结论BF肺炎克雷伯茵比BF大肠杆菌、铜绿假单胞菌更易产生ESBLs,检出的ESBLs以SHV型为主.     

纳米银离子对铜绿假单胞菌生物被膜的细菌死亡率的影响

目的 探讨纳米银离子对细菌生物被膜(biofilm,BF)的细菌死亡率的影响.方法 采用摇床法,以纳米银离子含量不同的乙烯-醋酸乙烯酯(Ethylene-Vinyl acetate,EVA)塑料为细菌粘附载体,模拟体内铜绿假单胞菌(P.serugi-nosa,PA)BF形成的微环境,建立体外BF模型;将培养3 d的空白标本分别在扫描电子显微镜(SEM)下及用FITC-ConA染色后荧光显微镜下观察不含纳米银离子EVA中BF的形成情况;将生长0.5、1、2、3、5 d的BF模型行SYT09/PI染色,激光共聚焦扫描电镜(CLSM)下摄取不同层面的图像,然后采用Image Pro Plus 6.0分析软件分析不同干预条件下BF的细菌的死亡率.结果 运用SEM及荧光显微镜的方法 ,在以不含纳米银离子EVA塑料的细菌粘附载体上培养3 d的标本中均观察到流线状的BF形成;纳米银离子含量、作用时间对BF的细菌死亡率均有明显影响(F值分别为84.62,85.67,P<0.01);不同时间点含有纳米银离子材料的BF细菌死亡率均显著高于空白对照组(P<0.05),但纳米银离子含量不同的2种材料上BF的细菌死亡率无明显影响(P>0.05);纳米银离子含量不同的(0、0.05%、0.1%)材料上的BF,其第1、2、3天细菌死亡率均分别显著高于第0.5、5天的细菌死亡率(P<0.05);含纳米银离子0.1%的材料上BF在作用的第2天其细菌死亡率最高[(88.53±1.88)%].结论 运用摇床法成功建立了体外BF模型,纳米银离子对BF内的细菌有明显杀灭作用.     

氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统毒力因子及相关基因的影响

目的：探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜（BF）密度感应（QS）系统所调控的毒力因子编码基因以及各自对应毒力因子表达的影响．方法：通过平板培养法培养铜绿假单胞菌建立成熟的BF体外模型．采用不同浓度氨溴索干预后,应用实时荧光定量PCR（rRT—PCR）检测其对Qs系统各毒力因子编码基因表达的影响;采用ELISA法检测外毒素A和弹性蛋白酶水平;采用地衣酚-硫酸法检测鼠李糖脂水平;采用Folin——酚比色法检测碱性蛋白酶活性．结果：经氨溴索3．750g／L作用后基因taxA,rtlA,lasB,aprA mRNA相对于培养基对照组的表达量均显著减少,由1．000分别变化为（3．03±0．08）,（2．70±0．09）,（2．10±0．10）,（2．20±0．10）（P〈0．05）．同时毒力因子外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、碱性蛋白酶的表达量也较培养基对照组明显减少,分别由（15220．16±988．89）,（81．38±5．44）,（289．73±6．72）,（5011±108．78）减少至（3481．59±599．64）,（29．76±3．84）,（101．74±3．32）,（1757±57．21）（P〈0．05）．经氨溴索1．875g／L干预后具有同样趋势,但效应不如高浓度明显（P〈0．05）．结论：氨溴索可以降低BFQS系统调控的毒力因子编码基因以及各自对应的毒力因子的表达．     

微酸性电解水对根管内粪肠球菌生物膜抗菌作用的体外研究

  目的  研究微酸性电解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）作为根管冲洗液对根管内粪肠球菌（Enterococus faecalis，E. faecalis）生物膜的抗菌作用。  方法  离体牙根管内培养E.f生物膜，以1%次氯酸钠（sodium hypochlorite，NaClO）溶液为阳性对照，分别用浓度为50 mg/L、60 mg/L的SAEW冲洗1 min、3 min、5 min，扫描电镜（field emission scanning electron microscope，FE-SEM）观察E.f生物膜形态变化，共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）结合Live/Dead荧光染色观察E.f生物膜荧光染色情况并测定生物膜死菌比例。  结果  FE-SEM观察:50 mg/L及60 mg/L的SAEW、1% NaClO溶液随着冲洗时间的延长，生物膜中细菌减少，菌体皱缩破裂。CLSM观察:50 mg/L及60 mg/L的SAEW、1% NaClO溶液随着冲洗时间的延长，红色荧光增多，死菌比例逐步增高，三个时间点间比较差异有统计学意义（P < 0.05）；1% NaClO溶液冲洗1 min、3 min、5 min的死菌比例高于50 mg/L及60 mg/L的SAEW，差异有统计学意义（P < 0.05）。  结论  50 mg/L、60 mg/L的SAEW对根管内E. faecalis生物膜有一定的抗菌作用，但弱于1% NaClO溶液。     

流感嗜血杆菌体外生物被膜的形成

目的:观察流感嗜血杆菌体外生物被膜(bacterial biofilm,BBF)的形成。方法:分离慢性阻塞性肺病急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)患者痰液中的流感嗜血杆菌11株,采用结晶紫法和扫描电镜方法研究BBF的形成和结构。结果:不同菌株流感嗜血杆菌体外形成BBF的能力有所不同,超微结构显示由细菌菌体和胞外基质形成典型的膜状结构。结论:流感嗜血杆菌可在体外形成稳定的BBF,提示与AECOPD的发病有关。     

铜绿假单胞菌及其生物被膜影响A549细胞分泌细胞生长因子的实验研究

目的:通过观察经铜绿假单胞菌及其生物被膜作用后,肺泡上皮细胞A549分泌细胞生长因子水平的变化,探讨其在成纤维细胞活化和增殖及分化中的作用。方法:采用体外诱导铜绿假单胞菌形成生物被膜,应用乙醇沉淀法提取细菌被膜并纯化;选用人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为靶细胞,采用ELISA法分别定量检测经铜绿假单胞浮游茵及其生物被膜藻酸盐作用后上皮细胞分泌生长因子TGF-β1、FGF-2、CTGF、IGF-1表达量。结果:受铜绿假单胞生物被膜藻酸盐作用后,A549细胞表达TGF-β1、FGF-2、CTGF和IGF-1能力明显增强,CTGF在藻酸盐作用后24 h达到高峰后缓慢下降,其余3种生长因子均在在藻酸盐作用后48 h内持续升高,与对照相比较,差异有统计学意义(P<0.05);浮游菌作用后4种生长因子表达量无明显增加。结论:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐可增强A549细胞对TGF-β1、FGF-2、CTGF和IGF-1分泌能力。