CD44在胃癌细胞株MKN45悬浮球体细胞中的表达及意义

目的：检测干细胞相关因子CD44在胃癌细胞株MKN45悬浮球体细胞中的表达。方法：选择人胃癌细胞株MKN45。在含有纤维生长因子-2及表皮生长因子无血清培养液中培养,观察球体形成情况;采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹分析法,检测干细胞相关基因CD44在球体细胞及原代贴壁细胞两组细胞中的表达差异。结果：胃癌细胞株MKN45在无血清培养条件下能形成悬浮球体,球体细胞中CD44的相对表达量高于原代贴壁细胞（P〈0．05）。结论：悬浮球培养法在胃癌细胞株MKN45中培养形成的球体细胞富集类肿瘤干细胞。该方法是分选和鉴定肿瘤干细胞的行之有效的方法。     

阿司匹林抑制胃癌干细胞的机制研究

目的 探讨阿司匹林对胃癌干细胞有无抑制作用及可能机制。方法 用RMPI-1640培养液培养人胃癌细胞株SGC7901,无血清培养基悬浮培养抽提富集微球体。MTT法检测阿司匹林对SGC7901细胞微球体生长的抑制情况。平板克隆实验观察阿司匹林对SGC7901微球体细胞克隆形成的影响。Transwell小室实验观察阿司匹林对SGC7901微球体迁移侵袭能力的影响。Western blot检测经过阿司匹林孵育后胃癌干细胞E2F1和Sox2蛋白的表达情况。结果 阿司匹林对人胃癌细胞株SGC7901微球体细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力具有显著的抑制作用。阿司匹林可剂量依赖性下调胃癌干细胞中E2F1和Sox2蛋白的表达。结论 阿司匹林对人胃癌细胞株SGC7901微球体细胞的恶性行为具有抑制作用,其抑制作用与E2F1和Sox2蛋白表达下降有关。     

高压CO2对胃癌细胞侵袭能力的影响

目的：探讨CO2对胃癌细胞腹腔转移能力的影响。方法：体外培养高侵袭力人胃癌MKN45细胞株,高压CO2（25mmHg）,及不同持续时间（1、2．3小时）干预后,应用流式细胞技术检测其MMP2和MMP9表达水平的变化。结果：高压CO2作用后,胃癌MKN45细胞株MMP2和MMP9蛋白表达有所变化,与常规细胞培养比较,MMP2和MMP9表达差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：高压CO2环境对癌细胞的侵袭能力影响较大,使胃癌细胞的侵润和转移能力有所增强。     

胃泌素及丙谷胺对胃癌细胞株MKN45增殖及EGF表达的影响

目的:观察五肽胃泌素(PG)及其受体拮抗剂丙谷胺(PGL)对人胃癌细胞株MKN45增殖及表皮生长因子(EGF)表达的影响。方法:MTT法检测人胃癌细胞株MKN45增殖;放射免疫法(RIA)测定表皮生长因子(EGF)的表达。结果:PG(10-6mol/L)明显促进人胃癌细胞株MKN45增殖,24、48h的促细胞增殖率分别为11.24%、17.63%,丙谷胺(2.0～10.0mmol/L)能阻断这一促增殖作用,并可剂量依赖性地抑制胃癌细胞的生长,且随作用时间延长而增强。同时,在胃癌细胞株MKN45培养液中可检测到EGF,且随培养时间延长EGF含量增加;PG(10-6mol/L)可显著增加MKN45培养液中EGF的含量,丙谷胺(6.0mmol/L)不仅明显阻断PG诱导的EGF增加,并且能够减少胃癌细胞MKN45培养液EGF的含量。结论:五肽胃泌素能促进胃癌细胞株MKN45增殖及EGF表达,而其受体拮抗剂丙谷胺不仅能阻断这一的促进作用,并可抑制胃癌细胞株MKN45增殖及EGF的表达。提示PG的促胃癌细胞增殖作用可能与促进EGF表达有关。     

Bcl-2相关的永生基因4对胃癌干细胞自我更新能力的调控作用

目的：探讨Bcl-2相关的永生基因4(Bcl-2 associated athanogene 4,BAG4)在胃癌干细胞（gastric cancer stem cells,GCSCs）自我更新能力中的调控作用。方法：采用成球培养法分离/富集GCSCs,并对其生物学特征进行鉴定。采用慢病毒干扰技术构建沉默BAG4表达的MGC803胃癌细胞系,以平板克隆形成和成球实验分别检测沉默BAG4对胃癌细胞克隆形成和成球能力的影响。结果：成球培养法成功分离/富集出球细胞（sphere cell,SC）。与普通单层贴壁细胞相比,MGC803-SC高表达干性相关基因Sox2、Oct4和Bmi1,具有更强的克隆形成能力（198±17 vs. 92±11,P<0.001）,诱导分化后干性标志物CD44表达下降,在体外具有更强的侵袭能力（185±18 vs. 84±11,P<0.01）。上述实验结果证实MGC803-SC具有GCSCs特性。BAG4在GCSCs中的表达水平明显高于普通贴壁胃癌细胞,沉默BAG4明显降低胃癌细胞的克隆形成和成球能力。结论：沉默BAG4基因能有效抑制GCSCs的自我更...     

肾癌OS-RC-2细胞CD133的表达及意义

目的: 培养肾癌干细胞球,研究其表面分子特性.方法: 肾癌细胞悬浮于含有表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的无血清培养基中培养,培养7天后收集细胞球,流式细胞仪检测CD133及CD34的表达.结果: 悬浮培养2天后出现肾癌干细胞球,培养7天后干细胞球明显增多,流式细胞仪检测发现表达CD133+CD34-细胞约占(8.33±1.26)%,对照肾癌细胞组表达CD133+CD34-细胞只占(1.24±0.36)%;干细胞球通过含10%胎牛血清培养基继续培养,又恢复原来的生长特点.结论: 利用无血清悬浮培养方法得到的肾癌干细胞球高表达干细胞表面分子标记CD133.     

启动子甲基化致OPCML基因失活在胃癌发病中的作用

目的探讨OPCML基因在胃癌细胞株中的失表达及其与基因启动子CpG岛甲基化的关系,并分析OPCML对胃癌细胞增殖的影响。方法 (1)实验组为胃癌细胞株(SGC7901、AGS、MKN28、MKN45、N87、KATOⅢ和SNU1),对照组为正常胃组织,分别采用RT-PCR检测两组细胞OPCML mRNA的表达。(2)用亚硫酸盐修饰正常胃组织的DNA和胃癌细胞MKN45的DNA,分别采用甲基化特异性PCR法检测OPCML基因启动子区甲基化情况。(3)实验组为药物处理组,即5-氮胞苷(5-AZA)去甲基化处理胃癌细胞MKN45,对照组为未经药物处理的MKN45,分别采用RT-PCR检测OPCML mRNA的表达变化。(4)RT-PCR检测转染OPCML表达载体及pcDNA3.1空载体后mRNA的表达情况。(5)实验组为OPCML表达载体转染胃癌细胞AGS,对照组为空载体转染胃癌细胞AGS,使用浓度为0.5 mg/mL的新霉素(G418)对转染细胞进行筛选,观察OPCML对胃癌细胞AGS集落形成的影响。结果 (1)在胃癌细胞株中OPCML mRNA的表达率显著低于正常胃组织。(2)胃癌细胞AGS和MKN45的甲基化程度明显高于正常胃组织。(3)5-AZA处理MKN45细胞后,OPCML表达上调。(4)OPCML表达载体转染HEK293A、AGS、MKN45细胞后,RT-PCR检测显示OPCML高表达。(5)外源性表达OPCML可抑制胃癌细胞AGS的集落形成率。结论 OPCML基因作为肿瘤抑制基因,在胃癌细胞中的表达下调。OPCML表达下调与该基因启动子区甲基化密切相关。药物性去甲基化处理能够恢复OPCML的表达。在表达沉默的AGS细胞中外源性表达OPCML,抑制集落形成率。     

干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及对膀胱癌细胞体外增殖影响

目的:初步研究干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及其对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响?方法:利用免疫组织化学和免疫荧光法检测Sox2在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24的表达;将构建成功的pcDNA3.1-SOX2-EGFP质粒转染膀胱癌细胞,采用半定量RT-PCR和Western blot检测Sox2的表达,进一步通过MTT实验初步探讨Sox2对膀胱癌细胞T24体外增殖能力的影响?结果:膀胱癌Sox2高表达率为68.6%;构建的pcDNA3.1-SOX2-EGFP转染膀胱癌细胞T24后能够成功表达;MTT实验显示,Sox2可促进膀胱癌细胞株T24体外增殖(P < 0.05)?结论:Sox2在膀胱癌组织及细胞均可检测到表达,并能促进膀胱癌细胞株T24的体外增殖?     

Promoter methylation-induced OPCML expression silence in progression of gastric cancer

目的 探讨OPCML基因在胃癌细胞株中的失表达及其与基因启动子CpG岛甲基化的关系,并分析OPCML对胃癌细胞增殖的影响.方法 (1)实验组为胃癌细胞株(SGC7901、AGS、MKN28、MKN45、N87、KATOⅢ和SNU1),对照组为正常胃组织,分别采用RT-PCR检测两组细胞OPCML mRNA的表达.(2)用亚硫酸盐修饰正常胃组织的DNA和胃癌细胞MKN45的DNA,分别采用甲基化特异性PCR法检测OPCML基因启动子区甲基化情况.(3)实验组为药物处理组,即5-氮胞苷(5-AZA)去甲基化处理胃癌细胞MKN45,对照组为未经药物处理的MKN45,分别采用RT-PCR检测OPCML mRNA的表达变化.(4)RT-PCR检测转染OPCML表达载体及pcDNA3.1空载体后mRNA的表达情况.(5)实验组为OPCML表达载体转染胃癌细胞AGS,对照组为空载体转染胃癌细胞AGS,使用浓度为0.5 mg/mL的新霉素(G418)对转染细胞进行筛选,观察OPCML对胃癌细胞AGS集落形成的影响.结果 (1)在胃癌细胞株中OPCML mRNA 的表达率显著低于正常胃组织.(2)胃癌细胞AGS和MKN45的甲基化程度明显高于正常胃组织.(3)5-AZA处理MKN45细胞后,OPCML表达上调.(4)OPCML表达载体转染HEK293A、AGS、MKN45细胞后,RT-PCR检测显示OPCML高表达.(5)外源性表达OPCML可抑制胃癌细胞AGS的集落形成率.结论 OPCML基因作为肿瘤抑制基因,在胃癌细胞中的表达下调.OPCML表达下调与该基因启动子区甲基化密切相关.药物性去甲基化处理能够恢复OPCML的表达.在表达沉默的AGS细胞中外源性表达OPCML,抑制集落形成率.     

siRNA靶向抑制ATDC蛋白对胃癌细胞生物学行为的影响

目的通过比较ataxia—telangiectasiagroupDcomplementinggene（ATDC）在永生化胃黏膜细胞GES与胃癌细胞系MNK45、AGS中的表达差异,探讨其对胃癌细胞生长、增殖及侵袭能力的影响。方法应用Westernblot实验检测ATDC在胃癌细胞系MKN45、AGS及永生化胃黏膜细胞系GES表达差异,利用慢病毒携带的siRNA下调ATDC在MKN45细胞表达水平,采用MTT实验检测细胞生长能力、流式细胞术检测细胞周期、平板克隆实验检测细胞克隆形成能力以及transwell实验检测细胞侵袭能力。结果ATDC在人胃癌细胞系MKN45与AGS细胞中的表达水平均明显高于永生化胃黏膜细胞GES（均P〈0．05）;转染siRNA慢病毒后,与Con—MKN45及MKN45比较,Si—MKN45细胞的表达水平明显下降（P〈0．05）：下调ATDC表达后MKN45细胞的生长能力明显受到抑制（P〈0．05）,S期细胞明显减少、增殖指数克隆形成率及侵袭能力均明显降低（均P〈005）。结论慢病毒携带的siRNA下调ATDC表达后能够抑制胃癌细胞MKN45的生长、增殖与侵袭能力,可为胃癌的基因治疗提供新的靶点。     

胃癌单克隆细胞球和CD44~+及CD133~+亚群成瘤能力的比较

目的研究胃癌干细胞亚群的筛选方法,探讨建立胃癌干细胞稳定亚群的可行性。方法利用流式细胞仪从MKN45、MKN25、SGC7901细胞株和人胃癌组织中分选出不同CD44和CD133表型的亚群,比较不同亚群和无血清培养基培养的单克隆细胞球细胞在裸鼠移植瘤模型中的成瘤能力。结果不同细胞的CD44+和CD133+亚群在低数量级时几乎不具有裸鼠皮下成瘤能力,在高数量级接种时成瘤能力与母系细胞差异无统计学意义;单克隆细胞球细胞在各数量级下的成瘤能力、瘤体积和生瘤速度均显著高于母系细胞。结论与CD44和CD133等细胞表面标志物筛选法相比,单克隆细胞球细胞可更好的作为胃癌干细胞研究的细胞学基础。     

健脾解毒方通过抑制环氧化酶2下调幽门螺杆菌诱导的人胃癌细胞血管内皮生长因子表达

目的：探讨健脾解毒方对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染胃癌细胞诱导的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的调控作用及可能的机制。方法：采用Hp标准株NCTC11637与人胃癌MKN45细胞共培养的方法感染MKN45细胞,实验中共分7组：对照组、Hp感染组、NS398抑制组、空白血清组和5%、10%、20%健脾解毒方药物血清组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测Hp感染对人胃癌MKN45细胞VEGF和环氧化酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）mRNA表达的影响及健脾解毒方血清对Hp感染诱导的人胃癌MKN45细胞VEGF和COX-2mRNA表达的影响;采用COX-2特异性抑制剂NS398（50μmol/L）抑制COX-2的表达后,检测Hp感染后人胃癌MKN45细胞VEGF mRNA表达的变化。结果：与对照组比较,Hp感染MKN45细胞6h后,Hp感染组COX-2mRNA的表达明显上调（P〈0.01）;感染12h后,VEGF mRNA表达亦明显上调（P〈0.01）;而采用COX-2特异性抑制剂NS398抑制COX-2表达后,Hp感染组VEGF mRNA的表达相比抑制前明显下调（P〈0.01）。与Hp感染组比较,5%、10%和20%健脾解毒方药物血清均可下调Hp诱导的人胃癌MKN45细胞VEGF和COX-2mRNA的表达,并呈一定的剂量依赖效应。结论：Hp感染可诱导人胃癌细胞VEGF和COX-2表达,健脾解毒方通过下调COX-2表达进而下调VEGF的表达,这可能是其防治胃癌的重要作用机制之一。     

原癌基因c—met在胃癌细胞株中的表达

目的：观察原癌基因c—met在不同分化的胃癌细胞株中的表达水平。方法：采用实时荧光定量PCR仪和Westernblotting检测高分化胃癌MKN28、中分化胃癌SGC-7901、低分化胃癌MKN45和正常胃细胞GESl中c—met的表达情况。结果：荧光定量PCR显示原癌基因c—met在三个胃癌细胞株中均有高表达，但以中分化的胃癌细胞SGC-7901的表达（0．064606＋0．0025）显著高于低分化的胃癌细胞株MKN45（0．016657±0．0002）和高分化的胃癌细胞株MKN28（0．002419±0．0002）（P〈0．01）；Westernblotting显示c—met在蛋白水平的结果与前-致。结论：四个胃癌细胞株中，原癌基因c—met均有表达，以SGC-7901表达量最高。     

Enrichment of breast cancer stem cells using a keratinocyte serum-free medium

Background  Keratinocyte serum-free medium (K-SFM) is a defined medium used to support the growth of primary keratinocytes and embryonic stem cell. The aim of this research was to optimize enrichment of breast cancer stem cells (CSCs) using K-SFM.

Methods  A K-SFM was used to enrich CSCs from two breast cancer cell lines and a primary culture of breast cancer. RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) was used as a control. CSCs were identified with flow cytometry using CD44⁺/CD24^– as molecular markers. The expression of a variety of CSC markers (Oct-4, ABCG2, Nanog, N-cadherin, and E-cadherin) was analyzed with real-time PCR.

Results  Much higher percentage of CSCs was achieved with K-SFM: 17.3% for MCF-7 cells, 17.4% for SKBR-3, and 20.0% for primary breast cancer culture. Less than 1% CSC was achieved using RPMI-1640 supplemented with 10% FCS. In comparison to the CSCs obtained with RPMI-1640, CSCs in the K-SFM expressed higher levels of Oct-4, ABCG2, Nanog and N-cadherin, and lower level of E-cadherin.

Conclusion  K-SFM is an optimal culture medium to maintain and to enrich breast CSCs.

     

奥曲肽抑制人胃癌细胞株MKN45的生长

目的 探讨奥曲肽（Octreotide,OCT)对人胃癌细胞株MKN45生长的调控作用。方法 采用MTT比色分析法分别测定OCT对生长于无血清培养基及含10％胎牛血清（FBS）培养基中MKN45细胞的调控作用。结果 OCT10^-2,10^-3,10^-4g/L对培养于无血清培养基中的MKN45的生长均有抑制作用，以10^-3g/L浓度的抑制作用最显著，为10．4％；而OCT10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6g/L对生长于含10％FBS培养基中的MKN45均未显示出抑制作用。结论 OCT可抑制无血清培养基中的MKN45的生长。胎牛血清中可能含有可快速降解OCT的肽酶，使得OCT未显示出对生长于含10％FBS培养基中的MKN45的抑制作用。     

小鼠胚胎神经干细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法:分离孕13～15d的小鼠胚胎脑组织,在加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的B27无血清培养基中克隆培养,并用10%的胎牛血清诱导其贴壁分化,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白(Nestin),β-微管蛋白(β-tublin),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对神经干细胞(NSCs)及其分化的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞可形成典型的神经球,并传代。细胞表达神经巢蛋白,并可诱导分化为神经细胞和神经胶质细胞。结论:小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下大量增殖,并且具有多向分化潜能。     

人肺癌细胞系A549中肿瘤干细胞样细胞的分离及鉴定

目的从人肺癌细胞系A549中分离并鉴定肺癌干细胞。方法将A549细胞置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,采用平皿克隆形成实验、MTT细胞增殖实验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术,检测并比较A549细胞和A549细胞球的增殖能力及干细胞相关标记的表达水平,鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性。结果利用无血清条件培养基从A549细胞中分离出肿瘤干细胞样细胞;相比A549细胞,细胞球呈悬浮生长,增殖能力和克隆形成数目(104±7)高于贴壁细胞[(37±3)(P<0.05)],且干细胞相关标记Sox2(2.68±0.39)和Oct4(1.23±0.12)表达水平明显提高[贴壁细胞Sox2(0.05±0.02)、Oct4(0.10±0.02),P<0.05]。结论运用无血清条件培养基可以从A549细胞系中有效富集肺癌干细胞样细胞。     

体外培养的人胃癌细胞株MKN45培养液中胃泌素的测定

用放免法测得体外培养的人胃癌细胞株ＭＫＮ４５培养液中含有胃泌素。癌细胞增殖时，胃泌素值高虽不明显，但二者呈正相关（ｒ＝０．９９８，Ｐ＜０．０５），研究结果提示ＭＫＮ４５细胞能分泌和释放胃泌素。