HINT1对人黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

目的 探讨HINTl基因对人黑素瘤细胞A375增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 应用构建的peDNA.3.1/mye-His(-)A-HINTl真核表达载体,建立稳定转染且能高表达HINTI的A375细胞模型.用M1rr法检测细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,TUNEL法检测细胞凋亡.分光光度法检测Caspase 3,Caspase 8及Caspase 9的相对活性.Western印迹法检测bcl-2、bax、细胞色素C及p53的表达.结果 与空载体-A375及未转染A375细胞相比,HINT1-A375细胞生长速度明显减慢(P<0.05);Gl期细胞增多(73.17%±3.99%,F=25.65,P<0.05),S期细胞减少(16.75%±1.62%.F=75.48,P<0.01),细胞出现明显的晚期凋亡(23.57%±9.58%,F=11.71,P<0.01). TUNEL法显示凋亡阳性细胞百分比(12%±1%)显著增高(F=358.02,P<0.01);Caspase 9(0.45±0.03,F=135.62,P<0.01)和Caspase 3表达(0.46±0.04,F=90.28,P<0.01)升高.凋亡相关蛋白bax、细胞色素C及p53表达增加,bel-2表达降低.结论 高表达H1NT1可抑制A375细胞的增殖,促进其凋亡,细胞周期出现G_1期阻滞,提示HINT1可能是人黑素瘤的抑癌基因.     

miR-21、miR-494对黑素瘤A375细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 探讨miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞的最佳有效转染浓度及其对黑素瘤A375细胞增殖的影响.方法 取6个浓度梯度的miR-21抑制物和miR-494模拟物转染A375细胞,实时荧光定量PCR法检测相应的miRNA.继而用Cy5标记的miRNA模拟物阴性对照转染A375细胞,荧光显微镜下观察转染效率.用流式细胞仪检测转染后细胞增殖的变化.结果 从A375细胞中成功提出miRNA.定量PCR结果显示,当转染物miR-21抑制物浓度为120 nmol/L时,转染细胞内有miR-21模拟物最大程度的下调表达,2-△△Ct值为0.80(0.65 ～ 0.92),低于对照组;当miR-494模拟物浓度为250 nmol/L时,转染细胞内有miR-494模拟物最大程度的上调,2-△△Ct值为126.82(111.52～144.22),明显高于对照组;miR-21抑制物转染组与miR-494模拟物转染组G1期细胞比率分别为(61.61±3.25)％、(61.05±3.17)％,高于对照组(P＜0.05);增殖指数分别为(38.39±3.25)％、(38.95±3.17)％,低于对照组(P＜0.05);细胞凋亡率分别为(27.74±1.39)％、(34.30±2.35)％,高于对照组(P＜0.01),细胞转染效率达90％以上.结论 miR-21抑制物和miR-494模拟物促使肿瘤细胞的G1期阻滞和促进凋亡作用,miR-21可增强A375细胞增殖,有原癌基因样功能;miR-494可抑制A375细胞增殖,有抑癌基因样作用.     

泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA慢病毒载体构建及其对A375细胞生物学行为的影响

目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA（shRNA）重组慢病毒载体,探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法 设计并合成3条沉默Cbl-b 基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA,构建慢病毒载体。将A375细胞分成5组,即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组,阴性对照组（阴性对照shRNA转染）,空白对照组（转染空载体）。应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率;CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力;流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期,Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力。结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体,Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率最高。CCK8检测表明,CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低（均P < 0.01）。流式细胞仪检测示,CBLB-shRNA-3组凋亡率［（22.73 ± 6.58）%］明显高于阴性对照组［（6.08 ± 1.35）%］和空白对照组［（6.34 ± 1.07）%,均P < 0.01］。CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P < 0.01）,而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组（P < 0.01）。Transwell检测示,阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60 ± 1.82、73.20 ± 3.83、19.60 ± 1.14,差异有统计学意义（F = 794.50,P < 0.01）。结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体,其可促进A375细胞凋亡,抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力。     

泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨恶性黑素瘤（MM）组织中泛素结合酶2S（UBE2S）的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法 应用免疫组化检测UBE2S在128例原发性MM、64例转移性MM、16份非瘤组织（8份瘤旁组织、8份正常表皮组织）芯片中的表达。实时定量PCR检测A375、MUM?2B及MUM?2C黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。将黑素瘤A375及MUM?2B细胞株分别分为两组,干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列的慢病毒转染,对照组使用含有对照序列的慢病毒转染, 72 h后实时定量PCR检测 A375和MUM?2B黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。用试剂盒检测各组细胞caspase3/7活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布;应用Transwell法及Western印迹分别检测敲减UBE2S对A375细胞迁移侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布数据组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,非正态分布数据比较采用Mann?Whitney U检验,通过Spearman系数评估UBE2S表达水平与T分期的相关性。结果 UBE2S在98例（51.0%）MM组织中高表达,16例非瘤组织中均低表达,两组间高表达率差异有统计学意义（χ2 = 11.905,P＜0.01）;UBE2S表达水平与肿瘤T分期呈负相关（ρ = -0.210,P = 0.043）。A375、MUM?2B、MUM?2C细胞间UBE2S mRNA相对表达量差异有统计学意义（F = 817.228,P＜0.01）。Caspase3/7活性在干扰组A375细胞（t = 17.572,P＜0.01）与干扰组MUM?2B细胞（t = 24.552,P＜0.01）分别较相应对照组明显增加;干扰组A375细胞较对照组G1期细胞比例明显升高（t = 7.365,P＜0.01）,而S期比例明显降低（t = -9.190,P＜0.01）,G2/M期无明显变化（t = -0.227,P＞0.05）;干扰组MUM?2B细胞G1期（t = 12.676,P＜0.01）、G2/M期（t = 13.045,P＜0.01）细胞比例高于对照组,但S期比例低于对照组（t = -15.718,P＜0.01）。Transwell实验显示,干扰组较对照组A375细胞迁移（t = -35.727,P＜0.05）及侵袭（t = -125.000,P＜0.01）能力降低。Western印迹检测显示,干扰组较对照组A375细胞N-钙黏蛋白表达下调。结论 UBE2S在黑素瘤组织过表达,其表达水平与肿瘤分期相关;敲减UBE2S对黑素瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力均有影响,并且可能通过调控N-钙黏蛋白表达促进MM细胞转移。     

miR-769-5p在皮肤黑素瘤中的表达及其对细胞增殖的影响

目的探究miR-769-5p在皮肤黑素瘤(malignant melanoma,MM)中的表达,以及其对人黑素瘤A375、G361细胞增殖的影响,以期为疾病的临床治疗提供新思路。方法收集本院保存的62例MM患者肿瘤组织以及对应癌旁组织进行研究,实时定量PCR(qRT-PCR)检测组织中miR-769-5p的表达,分析miR-769-5p表达与患者临床病理参数的关系,体外培养A375、G361细胞,转染miR-769-5p inhibitor分为空白对照组、阴性转染组、miR-769-5p转染组,MTT法检测细胞增殖情况;平板细胞克隆实验检测菌落形成情况;流式细胞仪检测细胞凋亡以及周期分布情况;裸鼠模型肿瘤形成实验评估体内肿瘤生长情况。结果 MM组患者miR-769-5p mRNA表达明显高于癌旁组织(P0.05)。miR-769-5p表达与性别、年龄、病灶溃疡情况无关,与淋巴结转移、临床分期相关(P0.05)。与HEM-L细胞系相比,A375、G361细胞系miR-769-5p mRNA表达均升高(P0.05)。与空白对照组、阴性转染组相比,miR-769-5p转染组细胞中miR-769-5p表达、菌落数量、小鼠肿瘤体积均降低,细胞抑制率、G1期DNA含量均升高(P0.05)。结论 miR-769-5p在MM中呈高表达,抑制其表达后能够影响细胞周期的进展,使细胞阻滞于G0/G1期,进而降低细胞增殖进程。     

辛伐他汀对缺氧黑素瘤细胞A375增殖凋亡及迁移的影响

目的 探讨辛伐他汀对缺氧黑素瘤细胞A375增殖、凋亡、迁移调控的分子机制.方法 在常氧或缺氧环境下体外培养A375细胞,细胞分为辛伐他汀处理的辛伐他汀组与二甲基亚砜处理的对照组,通过CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞活力,Annexin V/PI凋亡实验检测细胞凋亡,插入式细胞培养皿transwell迁移实验检测细胞迁移.RT-PCR法、Western印迹法检测辛伐他汀组与对照组细胞低氧诱导因子(HIF)-1α、生存素、细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(P27),以及沉默缺氧A375细胞的HIF-1α后的生存素、p27 mRNA与蛋白表达水平.结果 常氧或缺氧环境下,辛伐他汀组与对照组A375细胞增殖活力、凋亡细胞比例、细胞迁移数组间差异均有统计学意义(F值95.84、37.22、177.5,均P＜0.001),缺氧对照组A375细胞的增殖活力(1.391±0.129)、细胞迁移数(322.550±26.226)均高于常氧对照组(0.807±0.049、125.583±17.256)、缺氧辛伐他汀组(0.685±0.417、115.167±12.050)(P＜ 0.001);缺氧对照组细胞凋亡比例(6.167％±2.714％)均低于常氧对照组(11.833％±2.483％)、缺氧辛伐他汀组(17.833％±2.714％)(P＜0.01).缺氧辛伐他汀组HIF-1αmRNA与蛋白水平、生存素mRNA与蛋白水平均低于对照组(P＜ 0.05);P27mRNA与蛋白水平均高于对照组(P＜0.05).沉默缺氧A375细胞中HIF-1α后,生存素mRNA与蛋白水平均低于对照组(t值为5.346、8.281,P＜0.05),P27 mRNA与蛋白水平高于对照组(t值为31.37、9.954,P＜0.01).结论 辛伐他汀可抑制缺氧A375细胞的增殖及迁移,促进凋亡,其机制可能与HIF通路有关.     

腺病毒介导p27mt基因转移诱导恶性黑素瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨突变型p27基因(p27mutant type gene;p27mt)对恶性黑素瘤A375细胞凋亡的调节作用。方法:利用重组腺病毒Ad-p27mt转染培养的人恶性黑素瘤A375细胞,用3H-TdR掺入法检测细胞增殖;流式细胞术、DNA片段分析法、TUNEL法检测细胞凋亡。结果:重组腺病毒Ad-p27mt在MOI≥50时,可达到100%的转导效率。Ad-p27mt转染恶性黑素瘤细胞A375后,3H-TdR掺入法检测发现细胞增殖抑制;流式细胞术检测在G1期前出现亚二倍体凋亡峰;细胞DNA抽提电泳后发现凋亡特征性梯带。TUNEL法检测凋亡指数分别为48.5±3.6(Ad-p27mt组)及4.2±0.8(空白对照组),差异有显著性(P<0.01)。结论:重组腺病毒介导的p27mt基因转移可诱导恶性黑素瘤A375细胞在Gl期阻滞并导致细胞凋亡。     

转染c-kit基因对A375细胞增殖和凋亡的影响

目的:明确转染c-kit基因对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法:体外培养人恶性黑素瘤A375细胞,分为A组(实验组)、B组(转染空病毒载体的阴性对照组)、C组(空白对照组)。转染后采用RT-PCR检测c-kit mRNA表达情况,在倒置相差显微镜观察A375细胞分化及形态,MTT比色分析法检测对A375细胞增殖抑制的影响,流式细胞分析术,Anexin-v-PI双染色检测细胞早期凋亡的变化。结果:转染后A组细胞出现不同程度的皱缩、破裂,漂浮细胞增多。RT-PCR半定量分析结果显示,A组扩增出c-kit c DNA 230 bp大小片段,而B、C组则没有扩增出相应大小的片段。转染后A组OD值低于B、C组(P0.05),A组早期凋亡率高于B、C组有显著性差异(P0.05)。结论:转染c-kit后A375细胞增殖被抑制,早期凋亡增加。     

鼠尾草酸通过减少β-catenin表达抑制人黑素瘤A375细胞增殖

目的研究鼠尾草酸(CA)对人黑素瘤A375细胞增殖的影响并初步探讨其作用机制,为寻找新的黑素瘤临床治疗药物奠定一定的理论基础。方法 A375细胞传代培养后分为正常组、10μmol/L CA组(10μmol/L CA处理24h)、20μmol/L CA组、50μmol/L CA组,FH535 (β-catenin抑制剂)组(20μmol/L FH535处理24h)。MTT法检测细胞抑制情况;平板细胞克隆形成实验检测克隆形成情况;流式细胞仪检测细胞周期以及细胞凋亡变化; RT-PCR法检测A375细胞中β-catenin、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、淋巴增强因子1(LEF1)、原癌基因(C-myc) mRNA的表达; Western blot检测A375细胞中β-catenin、CyclinD1、LEF1、C-myc蛋白表达。结果与正常组相比,CA各组、FH535组细胞抑制率增加,CA各组呈时间、剂量依赖性增加(P 0. 05); CA各组、FH535组克隆形成数量均降低,CA各组克隆形成数量呈剂量依赖性降低(P 0. 05)。流式细胞仪检测显示与正常组相比,CA各组、FH535组G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低,CA各组G1期细胞比例呈剂量依赖性升高,S期细胞比例呈剂量依赖性降低(P 0. 05); CA各组、FH535组细胞凋亡率升高,CA各组凋亡率呈剂量依赖性升高(P 0. 05)。与正常组相比,CA各组、FH535组β-catenin、CyclinD1、LEF1、C-myc mRNA、蛋白表达降低,CA各组呈剂量依赖性降低(P 0. 05)。结论 CA可能通过抑制β-catenin的表达,引起细胞周期G1期阻滞,进而抑制人黑素瘤A375细胞增殖。     

血管内皮生长因子-siRNA对恶性黑素瘤细胞生长的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响。方法 构建针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA将其表达载体经电穿孔转染A375细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫酶联吸附实验(ELISA)方法 检测转染后的A375细胞VEGF的mRNA和蛋白表达,应用细胞计数比较转染组和对照组A375细胞增殖能力,将含转染组和对照组A375细胞的上清液分别培养人静脉内皮细胞(ECV-304),观察其生长情况,并用流式细胞仪观察转染pU-VEGF-siRNA载体对A375细胞凋亡的影响。结果 转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375细胞的VEGFmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降,并且其生长缓慢,其细胞周期出现亚二倍凋亡峰。用转染pU-VEGF-siRNA的A375细胞上清液培养的ECV-304细胞增殖力较对照组下降。结论 通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达,可抑制A375和ECV-304细胞增殖,诱导A375细胞凋亡。     

短发夹RNA干扰STAT3基因对恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 研究短发夹RNA（shRNA）沉默STAT3基因表达对人恶性黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的作用。 方法 设计和构建靶向STAT3基因有小发夹结构的正义和反义寡核苷酸,退火后克隆入psiRNA-hH1neo质粒,使用脂质体转染A375。实验分为对照组、空载体组和STAT3转染组。通过RT-PCR和Western印迹检测A375细胞中STAT3 基因mRNA和蛋白表达水平,MTT比色法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期分布,观察细胞凋亡。结果 STAT3转染组A375细胞STAT3 mRNA和蛋白表达水平（分别为0.2136 ± 0.0626、0.8214 ± 0.0430）明显低于对照组（0.7826 ± 0.0701、3.1693 ± 0.0846）和空载体组（0.8518 ± 0.0783、3.2180 ± 0.0780）,P值均 < 0.01。STAT3转染24、48、72 h组的细胞增殖抑制率明显增高（分别为21.35% ± 2.12%、32.52% ± 2.64%、40.40% ± 3.08%）,与正常对照组（1.39% ± 0.53%、3.05% ± 1.16%、4.41% ± 1.42%）、空载体组（2.63% ± 1.38%、5.84% ± 2.47%、10.32% ± 2.48%）比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）。流式细胞仪检测显示,STAT3转染组细胞的凋亡率（81.06% ± 2.10%）较对照组（26.28% ± 0.47%）和空载体组（27.31% ± 1.05%）明显增高,差异有统计学意义（P < 0.01）。细胞周期分析显示,STAT3转染组G0 / G1期细胞比例（68.43% ± 4.00%）增高,S期细胞比例（17.40% ± 2.05%）降低,与对照组（分别为60.07% ± 2.47%、28.40% ± 2.09%）及空载体组（分别为60.29% ± 2.26%、27.34% ± 3.63%）相比,差异有统计学意义（P < 0.01或 < 0.05）。结论 针对STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒能够下调STAT3 基因和蛋白表达,抑制A375的增殖能力,诱导细胞凋亡。     

p62通过调控PI3K/AKT通路促进黑素瘤增殖

目的探讨p62促进黑素瘤A375细胞生长增殖的作用及具体机制。方法取生长状态良好的黑素瘤A375细胞,采用干扰p62表达的siRNA片段转染A375细胞;EDU着色法检测干扰组和对照组的细胞分裂情况;采用Western blot检测干扰组和对照组PI3K/AKT/mTOR及下游因子的表达情况。结果干扰组的EDU着色数目较对照组明显减少;p62干扰后PI3K/AKT/mTOR及下游因子的表达明显受抑制。结论p62可能通过调控PI3K/AKT通路发挥促进黑素瘤增殖的作用。     

Nutlin-3对人A375黑素瘤细胞生物学行为的影响及可能机制

目的 观察顺式咪唑啉衍生物nutlin-3对人A375黑素瘤细胞生物学行为的影响,研究其机制。 方法 将A375细胞分为实验组和对照组,实验组细胞接受2.5、5、10 μmol/L nutlin-3处理,对照组细胞采用二甲基亚砜处理。分别于作用24、48、72 h后,噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况;Western印迹检测p53蛋白表达的改变;流式细胞仪检测细胞周期分布以及细胞凋亡;Transwell法检测迁移性变化。采用重复测量的方差分析进行统计学检验。 结果 2.5、5、10 μmol/L nutlin-3处理A375细胞24、48、72 h后,MTT法显示不同时间点间的增殖抑制率差异有统计学意义（F = 67.43,P < 0.01）,不同浓度间的抑制率差异有统计学意义（F = 135.58,P < 0.01）,浓度越高抑制率越高;时间和浓度之间有交互作用（F = 26.95,P < 0.01）。Western印迹 、流式细胞仪、Transwell法检测显示,不同时间点之间A375细胞的p53表达、G2期细胞百分率、凋亡率、迁移抑制率差异均有统计学意义（F值分别为1255.00、831.38、809.45、1100.00,均P < 0.01）,除p53外,时间越长各项指标值越高;不同浓度间各项指标值差异均有统计学意义（F值分别为9196.00、267.99、723.83、1667.00,均P < 0.01）,浓度越高各项指标值越高;时间与浓度之间交互作用有统计学意义（F值分别为826.79、21.602、44.48、313.09,均P < 0.01）。 结论 nutlin-3可能通过p53蛋白积累途径抑制人A375细胞的增殖和迁移,促进细胞周期停滞和细胞凋亡。     

芳姜黄酮衍生物对A375人黑素瘤细胞增殖及凋亡作用的机制研究

目的：研究一种芳姜黄酮衍生物（ATD）对人皮肤黑色素瘤A375细胞增殖及凋亡的影响。方法不同浓度（5、10、20、40、80μmol/L）ATD、长春新碱及芳姜黄酮体外作用A375及人皮肤成纤维细胞（HSF）48 h。CCK?8法检测细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色,倒置显微镜观察细胞凋亡形态;DNA片段化检测细胞凋亡;比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）活性;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期。结果ATD、长春新碱及芳姜黄酮对A375细胞有抑制增殖作用,且呈剂量依赖性（ATD：R2=0.99,F=340.96;长春新碱：R2=0.99,F=349.19;芳姜黄酮：R2=0.89,F=25.41,均P<0.05）,三者IC50分别为（15.96±0.02）、（77.00±0.04）及（356.95±0.01）μmol/L。当药物浓度为5μmol/L及10μmol/L时,ATD对HSF增殖抑制率分别为（8±0.06）%和（25±0.02）%,长春新碱为（33±0.04）%和（29±0.08）%,芳姜黄酮为（49±0.09）%和（34±0.07）%;ATD对A375细胞抑制率分别为（26±0.06）%和（39±0.02）%,长春新碱为（8±0.04）%和（17±0.08）%,芳姜黄酮为（6±0.09）%和（10±0.07）%,与二甲基亚砜相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）,且ATD对A375细胞增殖抑制活性强于长春新碱及芳姜黄酮（P＜0.05）,但对HSF细胞毒性却明显低于长春新碱及芳姜黄酮（P＜0.05）。ATD、长春新碱及芳姜黄酮均可诱导A375细胞凋亡,caspase?3活性随3种药物浓度增加而增强,且药效为ATD>长春新碱>芳姜黄酮。流式细胞仪检测证实,3种药物都能诱导细胞发生不同程度凋亡,同芳姜黄酮及长春新碱相比,ATD能显著诱导细胞凋亡,且以晚期凋亡为主。随药物浓度增加,ATD组G1期A375细胞逐渐增多,G2期及S期细胞数明显减少。结论 ATD对A375细胞有抑制增殖及促凋亡作用,该作用明显强于芳姜黄酮及长春新碱,其机制可能是激活caspase?3,使细胞周期阻滞在G1期,进而抑制肿瘤细胞分化与增殖。     

水通道蛋白3-siRNA和磷脂酶D2-siRNA对黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨水通道蛋白(aquaporin,AQP)3-siRNA和磷脂酶D(phospholipase D,PLD)2-siRNA对黑素瘤(malignant melanoma,MM)细胞增殖和凋亡的影响。方法用脂质体转染法将siRNA导入人黑素瘤细胞株A375细胞。用CCK-8法检测细胞增殖。用细胞膜磷酯酰丝氨酸异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin-V-FITC/PI)双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染AQP3-siRNA、转染PLD2-siRNA、同时转染AQP3-siRNA和PLD2-siRNA后,A375细胞增殖均受到明显抑制(与正常培养组比较,P均0.01)。同时转染组与单独转染组(AQP3-siRNA组和PLD2-siRNA组)比较,细胞增殖差异有统计学意义(P均0.01)。转染AQP3-siRNA、同时转染AQP3-siRNA和PLD2-siRNA后,A375细胞凋亡明显增加(与正常培养组比较,P均0.05)。同时转染组与单独转染组(AQP3-siRNA组和PLD2-siRNA组)比较,细胞凋亡差异有统计学意义(P0.05;P0.01)。结论 AQP3和PLD2与MM增殖和凋亡相关,AQP3/PLD2信号分子在MM的发生中具有协同作用。     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

MEK/ERK通路阻断剂对黑素瘤细胞增殖的影响

目的研究MEK/ERK通路阻断剂U0126对黑素瘤细胞A375增殖的影响,并探讨其作用机制。方法噻唑蓝法(MTT)测定U0126和传统抗癌药物达卡巴嗪(DTIC)分别及联合作用时对黑素瘤细胞A375的增殖抑制作用;流式细胞术检测不同药物处理组的细胞周期及凋亡情况;Western blot检测U0126处理后细胞p-ERK1/2的表达。结果药物作用24h时U0126单一用药组对细胞的增殖抑制率高于DTIC单一用药组(P<0.01);联合应用U0126和DTIC对细胞的增殖抑制率明显高于DTIC用药组(P<0.01);U0126组与对照组相比,G1期细胞比例数提高了21.83%(P<0.01),凋亡率提高了13.96%(P<0.01),联合用药组与对照组相比G1期比例增加了26.64%(P<0.01),凋亡率亦明显提高了25.20%(P<0.01);不同浓度U0126处理细胞后,细胞的p-ERK1/2均明显降低(P<0.01)。结论 MEK/ERK通路阻断剂U0126可显著抑制黑素瘤细胞的增殖,其机制可能与降低p-ERK1/2的表达从而参与细胞周期调控有关;联合U0126用药有望成为治疗黑素瘤新的有效途径。     

抑癌基因DKK3对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及其对黑素瘤细胞A375增殖与凋亡的影响。方法 通过反转录（RT）？PCR及实时定量PCR分析DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤细胞系HM、A375、WM451、WM35、SK？MEL？1、Hs？695T和MDA？MB？435s及38例原发性黑素瘤、4例转移性黑素瘤和20例色素痣组织中的相对表达。分别转染恶性黑素瘤A375细胞pcDNA3.1（＋）？Flag？DKK3 质粒（实验组）和pcDNA3.1（＋）？Flag？Vector 质粒（对照组），RT？PCR 验证 DKK3 的过表达；通过CCK8法和平板克隆实验分析 DKK3 对A375细胞增殖的影响，流式细胞仪分析 DKK3对A375细胞凋亡的影响，Western印迹检测A375细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。结果 DKK3 mRNA 在WM35细胞系表达下调，HM、A375、WM451、SK？MEL？1和Hs？695T细胞系表达缺失，MDA？MB？435s细胞高表达。与色素痣相比，DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤组织表达降低（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比 （100%），实验组A375细胞克隆形成效率明显受到抑制（23.22% ± 3.55%）；同时转染后24、48、72 h细胞活性受到明显抑制（均P 〈 0.05）。流式细胞仪检测发现，与对照组A375细胞（G1期，25.38% ± 2.92%）相比，实验组A375细胞明显阻滞于G1期（48.68% ± 3.92%，P 〈 0.001），细胞凋亡率明显升高（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比，实验组周期凋亡相关蛋白p21、Bax、活化的parp和 活化的Caspase？3表达升高，细胞周期蛋白D1和Bcl2表达降低（均P 〈 0.001）。结论 DKK3在人皮肤恶性黑素瘤组织中表达下调，可能作为潜在的抑癌基因参与皮肤恶性黑素瘤的进展。     

转染反义微小RNA-155对人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431生长的影响

目的 观察转染反义微小RNA?155（miRNA?155）对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖、凋亡以及细胞迁移和侵袭的影响。方法 A431细胞分为3组,采用脂质体介导法转染无义序列miRNA?155（无义序列组）、反义序列 miRNA?155（反义序列组）或仅用含Lipofectamine 2000的DMEM（空白对照组）处理。实时定量聚合酶链反应检测转染后各组A431细胞miRNA?155的表达水平,噻唑蓝法检测转染后24、36、72、96、120 h细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡情况,Transwell法检测细胞迁移与侵袭力。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 转染后,无义序列组、反义序列组与空白对照组中A431细胞miRNA?155相对表达量分别为0.98 ± 0.02、0.28 ± 0.18、1.00 ± 0.01,3组差异有统计学意义（F = 634.57,P < 0.001）,反义序列组低于空白对照组和无义序列组,均P < 0.05。孵育72、96、120 h时,3组细胞存活率差异均有统计学意义（均P < 0.05）,反义序列组细胞存活率在3个时间点均低于空白对照组和无义序列组（均P < 0.05）;3组细胞G0/G1期细胞比例、S期细胞比例、细胞增殖指数差异均有统计学意义（F = 23.46、36.81、19.35,P < 0.01）。反义序列组G0/G1期细胞比例（74.63% ± 2.13%）高于空白对照组（62.92% ± 2.56%）和无义序列组（63.75% ± 3.06%）,均P < 0.05;S期细胞比例及细胞增殖指数（9.88% ± 1.83%、25.36 ± 2.13）低于空白对照组（18.86% ± 2.78%、37.08 ± 2.56）和无义序列组（18.33% ± 3.72%、36.25 ± 3.06）,均P < 0.05;反义序列组迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和无义序列组（均P < 0.05）。结论 皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染反义miRNA?155可减少miRNA?155的表达,有效抑制A431细胞增殖、迁移、侵袭,促进其凋亡。     

麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡

目的探讨麦冬皂苷B对人黑色素瘤(Melanoma)A375细胞增殖,凋亡和细胞周期的影响以及相关机制。方法麦冬皂苷B处理A375细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞仪检测A375细胞周期变化及细胞凋亡水平;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态;免疫印迹法检测麦冬皂苷B对A375细胞PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT蛋白以及通路下游凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase3表达的影响。结果麦冬皂苷B能抑制A375细胞增殖活力及PI3K/Akt/mTOR通路的活化;麦冬皂苷B促进了A375细胞内Bax和Cleaved-caspase 3的表达,抑制Bcl-2表达,诱导人黑色素瘤细胞发生凋亡;麦冬皂苷B阻滞了A375细胞细胞周期,G0/G1期细胞比例明显升高;PI3K/Akt/mTOR通路活化剂IGF-1处理A375细胞后抑制了麦冬皂苷B的上述作用。结论麦冬皂苷B能抑制A375细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,阻滞细胞周期于G0/G1期。