2种菌株来源的左旋门冬酰胺酶的鉴别和效价测定研究

目的:探讨由大肠埃希菌(E.coliASI.357)和欧文菌(Erwinia carotovora)制备的左旋门冬酰胺酶的鉴别方法,以及效价测定的最适酶促反应条件。方法:采用高效液相色谱法及等电聚焦电泳法对2种菌株来源的左旋门冬酰胺酶进行鉴别;考察缓冲液的种类及pH值对左旋门冬酰胺酶效价测定的酶促反应的影响。结果:大肠埃希菌和欧文菌2种来源的左旋门冬酰胺酶的色谱图有差别,主峰保留时间分别为11.0、11.8min,等电点色带分别为4.65～5.1、7.1～8.20;效价测定的最适酶促反应条件分别是三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH=9.0)、0.2mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=8.0)。结论:2种菌株来源的左旋门冬酰胺酶的等电点有显著差别,效价测定的最适酶促反应条件亦不相同,应作为2个品种制定质量标准。     

基于液质联用技术的溶菌酶一级结构分析研究

目的:使用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法(UPLC-Q TOF MS法)对国内外3家企业溶菌酶的一级结构进行分析研究。方法:采用BEH300 C₄(50 mm×2.1 mm, 1.7μm)色谱柱和BEH300 C₁₈(150 mm×2.1 mm, 1.7μm)色谱柱，以0.1%甲酸/水溶液为流动相A,0.1%甲酸/乙腈溶液为流动相B,梯度洗脱，流速0.2 mL·min^-1;采用Q TOF MS的电喷雾正离子模式，相对分子质量测定时采用MS模式进行扫描，氨基酸序列和二硫键连接方式测定时采用MS^E模式进行扫描。结果:3种来源溶菌酶相对分子质量与理论值一致；肽图结果显示各样品的氨基酸序列均与理论一致；二硫键连接方式均为Cys6-Cys127、Cys30-Cys115、Cys64-Cys80、Cys76-Cys94。结论:UPLC-Q TOF MS法可用于溶菌酶一级结构的分析。     

蛇毒血凝酶纯度分析方法研究

目的:建立蛇毒血凝酶纯度测定方法。方法:分别采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和等电聚焦法(IEF),对凝胶考染并扫描;采用体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC),使用TSK G3000SW(7.8 mm×300 mm)凝胶柱,流动相为55 mmol.L-1柠檬酸钠-0.01%Tween 80溶液;流速0.5 mL.min-1,检测波长280 nm;采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),使用C8Vydac(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为0.1%三氟乙酸溶液(A)-含0.1%三氟乙酸的90%乙腈(B),梯度洗脱,流速0.8 mL.min-1,;柱温为45℃,检测波长:280 nm。结果:4种方法测得蛇毒血凝酶的纯度分别为89.3%,88.5%,95.4%,87.4%。结论:对于蛇毒血凝酶纯度测定,非还原SDS-PAGE、IEF及RP-HPLC法均可准确地反映其样品纯度。     

复杂抗生素多黏菌素E甲磺酸钠的组分与杂质谱研究及在质量控制中的应用

目的:建立二维液质联用方法确定多黏菌素E甲磺酸钠(CMS)杂质的结构及来源,进而用于药物质量控制研究。方法:一维系统：采用Acquity UPLC^?Peptide CSH C₁₈(150 mm×2.1 mm, 1.7μm)色谱柱,以磷酸盐缓冲液(7.8 g·L^-1磷酸二氢钠,用1 mol·L^-1氢氧化钠溶液调节pH至6.4)-乙腈(19∶1)为流动相A,磷酸盐缓冲液-乙腈(1∶1)为流动相B,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1,柱温30℃;二维系统：采用Acquity BEH C₁₈柱(50 mm×2.1 mm, 1.7μm)色谱柱,以甲酸铵(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱,流速0.2 mL·min^-1,柱温40℃,检测波长210 nm。质谱检测器采用ESI源,负离子扫描模式。结果:采用2D-LC-Q TOF MS法,推定了CMS中55个杂质的结构,并推测其主要来源为多黏菌素E1-I、多黏菌素E1-7MOA、多黏菌素E3及多黏...     

凝胶色谱法分离哌拉西林钠聚合物杂质

目的 建立聚苯乙烯基质的凝胶色谱柱(MKF-GPC-300)对哌拉西林钠中的聚合物杂质(或称缩合物杂质)的分离分析方法.方法 凝胶色谱柱为MKF-GPC-300柱(300mm×7.8mm,5μm),流动相为0.01mol/L醋酸铵缓冲液(pH7.0):乙腈(65:35),流速1.0mL/min,检测波长254nm.结果...     

促黄体生成激素释放激素拮抗类似物的分离纯化研究

目的 采用高效液相色谱(HPLC)法分离纯化促黄体生成激素释放激素(LHRH)拮抗类似物.方法 制备型色谱柱为Dynamax-300A型C18柱(250 mm×4.14 mm,5 μm),分析型色谱柱为Nucleosil型C18柱(250 mm×5 mm,5 μm);流动相A为含0.1%三氟醋酸和3%乙腈的水溶液(pH=2),流动相B为含70%乙腈的水溶液;流速为40 mL/min(用于分离)和1.2 mL/min(用于分析);检测波长为220 nm.结果 LHRH拮抗类似物纯品的产率可达22%～52%,纯度高达97%～99%,分离度大于1.5.结论 HPLC法分离纯化的LHRH拮抗类似物纯品产率大,纯度高,且该法操作简便、快捷.     

HPLC法结合LC-MS法测定硫酸鱼精蛋白含量及肽段鉴定

目的:建立了一种同时测定硫酸鱼精蛋白中主成分纯度和含量的HPLC方法，并采用LC-MS法对肽段氨基酸序列进行鉴定。方法:HPLC方法采用的色谱柱为ThermoHypersil GOLD色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相A为0.1 mol·L^-1磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH至1.8),流动相B为乙腈-0.1 mol·L^-1磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH至1.8)(6.5∶93.5),梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1,柱温55℃,紫外检测波长为214 nm,进样量100μL。LC-MS法先采用馏分收集方式对各肽段进行提取富集，然后液质联用采用Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C₁₈色谱柱(15 cm×0.21 cm, 1.7μm),流速为0.2 mL·min^-1,流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为5%乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脱；Thermo Q-Exactive Plus, ESI离子源，阳离子检测模式，雾化电压为...     

注射用绒促性素中纯度测定方法的研究

目的:建立了分子排阻法测定注射用绒促性素中纯度的方法,并在2010年度国家药品质量评价性抽验工作中,按照所建方法对国产注射用绒促性素进行了测定和评价。方法:采用两根TSK G3000SWXL凝胶色谱柱(7.8 mm×300 mm,5μm)串联,预柱为TSK SWXL(6.0 mm×40 mm,5μm),以0.05 mol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.0)-乙腈(80∶20)为流动相,流速0.6 mL·min-1,检测波长214 nm,面积归一化法定量。结果:卵泡刺激素(FSH)和绒促性素(HCG)分离完全,各辅料均无干扰,绒促性素的效价比活和纯度呈正相关。目前法定检验标准中无此检查项,76批样品全部合格,没有发现问题;若按本法进行纯度检查,则样品的不合格率显著增加。结论:本法具有较高的选择性,结果稳定、准确可靠,通过测定绒促性素的纯度可达到监控制剂生产过程中所使用原料的效价比活的目的。在此次专项抽验中发现现行标准存在缺陷,仍有待进一步提高,可采用专属性较强的仪器分析法如分子排阻法检查该品种的纯度或进行鉴别。     

液质联用技术用于醋酸阿托西班注射液中杂质结构鉴定

目的:采用高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱-四极杆串联静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q Orbitrap MS)技术对醋酸阿托西班注射液中杂质结构进行鉴定。方法:HPLC法采用Inertsil ODS-2 C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相A为乙腈-甲醇-三氟乙酸溶液(pH 3.2)(15∶10∶75),流动相B为乙腈-甲醇(60∶40),梯度洗脱，流速1.2 mL·min^-1,检测波长220 nm。UPLC-Q Orbitrap MS法采用BEH300 C₁₈色谱柱(150 mm×2.1 mm, 1.7μm),流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B),梯度洗脱，流速0.2 mL·min^-1;采用电喷雾离子源，选择正离子模式进行Full MS/dd-MS²扫描。结果:对5家企业各1批醋酸阿托西班注射液进行了有关物质测定，以面积归一化计算，含量>0.1%的杂质峰个数分别为9、10、13、9和6,总杂含量分别为0.35...     

萘普生对映体的手性分离和纯度检查

目的:建立萘普生手性分离和光学纯度检查的高效液相色谱方法。方法:采用Chiralpak AD-H(4.6 mm×250 mm,5μm,Daicel公司)手性色谱柱在正相条件下拆分萘普生对映体,考察了固定相种类、流动相组成、柱温及流速等对萘普生对映体分离的影响,流动相为正己烷-异丙醇(30∶70,v/v),检测波长272 nm,流速0.5 mL.min-1,柱温20℃。结果:在此条件下,萘普生及其(R)-(-)-构型体达到基线分离,分离度为3.3。结论:该法简单快速,重现性好,能够用于萘普生对映体的分离和纯度考察。     

重组人生长激素原液及注射液中有关物质UPLC分析方法建立

目的:建立超高效液相色谱法测定重组人生长激素原液及注射液中的有关物质。方法:采用Waters BEH C₁₈ 300?色谱柱(150 mm×2.1 mm, 1.7μm),以12.5 mmol·L^-1磷酸氢二钾缓冲溶液-乙腈为流动相,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1,检测波长220 nm,柱温45℃。结果:在选定的色谱条件下,能分离出较多有关物质,且主峰与各有关物质峰均能良好分离;质量浓度在0.25～5 mg·mL^-1的范围内线性关系良好。精密度、耐用性及稳定性(72 h内)良好。根据质谱定性结果,探索了制备脱酰胺杂质、氧化杂质、脱水杂质等主要有关物质的处理方法。对于重组人生长激素注射液,本方法与现有标准相比,能够弥补我国注册标准方法中检测有关物质数量少,彼此间分离度不高的缺点,同时也克服了欧洲药典需要2种机理不同的独立实验方能完成有关物质控制的问题。结论:本方法适用于测定重组人生长激素原液及注射液中的有关物质。     

阿昔洛韦片中杂质的色谱-质谱结构分析

目的 建立高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)联用法对阿昔洛韦片及其强制降解试验样品中的杂质进行结构分析。方法 采用Waters Xbridge BEH Shield RP18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以10 mmol·L^–1甲酸铵溶液(含0.15%甲酸)为流动相A,以10 mmol·L^–1甲酸铵溶液(含0.15%甲酸)-乙腈(50∶50)为流动相B,进行梯度洗脱,检测波长为254 nm,对阿昔洛韦片及其强制降解试验样品中的杂质进行分离,再采用QExactive Orbitrap-MS测定各杂质一级精确分子量及二级碎片离子,并进行结构鉴定。结果 阿昔洛韦及其杂质均分离良好,检测并鉴定出阿昔洛韦片及其强制降解试验样品中8个含量>0.1%的主要杂质,其中4个为欧洲药典10.0规定的已知杂质,而其他杂质均未见报道。结论 建立的液质联用技术能有效鉴定阿昔洛韦片的杂质,能够为其生产工艺的优化和质量控制提供参考。     

超高效液相色谱-串联质谱方法测定谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺含量

目的 建立超高效液相色谱-串联质谱方法 测定谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺的含量.方法 采用超高效液相色谱串联质谱仪,色谱柱为Atiantis T3柱(1100 mm×2 mm,3μm),柱温38℃.流动相以0.1％甲酸水溶液:乙腈,流速0.30 mL/min,采用多反应监测模式对谷氨酰胺胶囊中谷氨酰胺含量进行测定.结果 谷氨...     

UPLC法测定人血浆中卡马西平的游离浓度

目的 建立一种测定人血浆中卡马西平游离浓度的中空纤维离心超滤(HFCF-UF)-超高效液相色谱(UPLC)法.方法 血浆样本经中空纤维离心超滤技术预处理.色谱柱:Waters UPLC BEH C18柱(50.0 mm×2.1 mm,1.7μm),流动相:乙腈-水=35:65,流速:0.2 mL·min-1,柱温:30...     

麦白霉素组分对其效价测定的影响

目的 对微生物管碟法与比浊法测定麦白霉素效价与组分的关系加以探讨研究,说明比浊法测定效价较管碟法测定效价的高灵敏度与高选择性.方法 比浊法以金黄色葡萄球菌为实验菌,加菌量约0.3%(V/V),(37±0.5)℃培养3.5-4.5h后测定吸光值.管碟法按照中国药典2005年版二部.HPLC法:色谱柱为phenomenex Gemini C18(4.6mm×250m);流动相为0.2mol/L甲酸铵溶液(pH7.6)-乙腈(60:40);流速为1.0mL/min;检测波长为232nm;柱温为30℃:进样量为10μL.结果 比浊法更好地反映了麦白霉素组分的变化,管碟法对组分的变化基本无反应.结论 比浊法较管碟法对组分变化的反应灵敏度高、选择性好,更好地反应了样品的实际质量.     

地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的快速检测方法研究

目的：利用高效液相色谱（HPLC）建立地衣芽孢杆菌活菌制剂中芽孢数的快速检测方法。 方法：采用HPLC,以Waters Xbridge C18为色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）、0.1%磷酸溶液：甲醇（92:8）为流动相等度洗脱、检测波长273nm、柱温30℃、流速0.8mL·min-1,建立地衣芽孢杆菌中2,6-吡啶二羧酸（DPA）含量的测定方法。以平板计数法对相应的芽孢悬液中芽孢数量进行统计,建立DPA浓度与芽孢数之间的关系曲线。同时采用上述方法检测3种地衣芽孢杆菌活菌制剂（片剂、胶囊剂和颗粒剂）的芽孢数。 结果：研究表明,所建立的DPA测定方法,检测结果的稳定性、精密度、重复性、加样回收率均良好,DPA线性范围为2.5-80 mg·L-1(r=0.999),平均回收率（n=6）为102.1%;芽孢最终浓度与DPA浓度呈线性关系,芽孢最终浓度线性范围为6.5×108-7.8×109 CFU·mL-1（r=0.993）。采用上述方法同时检测3种地衣芽孢杆菌活菌制剂（片剂、胶囊剂和颗粒剂）的芽孢数,结果无显著性差异。 结论：建立地衣芽孢杆菌活菌制剂中芽孢数的快速检测方法,效果好、简单、快速。     

甘精胰岛素注射液有关物质分析方法研究

目的:优化甘精胰岛素注射液有关物质分析方法,论证现行标准规定限度科学性,并对主要有关物质进行鉴别。方法:采用Thermo scientific Bio-Basic-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),以氯化钠-磷酸盐缓冲液-乙腈(18.4 g∶250 mL∶250 mL,加水至1 000 mL)为流动相A,氯化钠-磷酸盐缓冲液-乙腈(3.2 g∶250 mL∶650 mL,加水至1 000 mL)为流动相B,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,检测波长214 nm,柱温35℃。利用该方法收集含量最大有关物质组分并利用LC-MS方法进行鉴别。分析色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C₁₈ Column(100 mm×2.1 mm, 1.7μm, 300?),以0.1%甲酸水溶液为流动相A,0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B,进行梯度洗脱,柱温为50℃。质谱数据采集条件为MS~E模式,一级质谱能量40 V。结果:该RP-HPLC有关物质分析方法,方法学验证结果良好,能够有效分离并准确测定样品中的有关物...     

HPLC-RID 测定发酵虫草菌粉（Cs-4）中甘露醇的含量

目的：建立测定发酵虫草菌粉（Cs-4）中甘露醇含量的高效液相色谱 - 示差折光检测器法（HPLC-RID）。方法： 采用 Carbomix Ca-NP 5∶8 % 色谱柱（7.8 mm × 300 mm,5 μm）,以乙腈 - 水（10∶90）为流动相;流速为 0.5 mL/min ;柱 温为 80 ℃;示差折光检测器温度为 55 ℃。结果：甘露醇质量浓度在 0.099 ～ 3.955 mg/mL 范围内线性关系良好（r=0.999 7）; 方法的精密度、稳定性及重复性良好,RSD 均小于 2.0 % ;平均回收率为 96.0 %（RSD=1.67 %）。结论：经方法学验证,本 法可用于发酵虫草菌粉（Cs-4）中甘露醇的含量测定,为发酵虫草菌粉（Cs-4）的全面质量控制提供科学依据。     

甲磺酸沙芬酰胺的杂质分析与控制

目的从甲磺酸沙芬酰胺粗品中富集关键杂质并使用LC-MS推测其结构,利用HPLC法建立这些关键杂质的测定方法。方法采用柱分离的方法分离出3个杂质,使用LC-MS测得质荷比和主要碎片离子,以Waters Symmetry Sheild C8(150 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,含1 mg·L~(-1)辛基硫酸钠的25 mmol·L~(-1)的KH_2PO_4缓冲溶液-乙腈为流动相,检测波长:228 nm,柱温:35℃建立色谱条件。结果在拟定的色谱条件下,3个关键杂质在考察的质量浓度范围内与峰面积线性关系良好(r≥0.999),检测限为106~172μg·L~(-1),定量限为330~575μg·L~(-1),平均回收率为94.2%~103.4%,重复性及日间精密度小于2.0%。结论本方法可用于甲磺酸沙芬酰胺的关键杂质的质量控制。     

液-质联用法测定人血浆中卢非酰胺的浓度及其在药动学研究中的应用

目的:建立高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)测定人血浆中卢非酰胺浓度的方法。方法:40名健康受试者随机分成4组,分别单剂量口服给药卢非酰胺片200,400,800,1200 mg。血浆样品经乙腈沉淀蛋白提取分离,色谱柱为Ultimate^® AQ-C₁₈(100 mm×2.1 mm,5 μm,Welch Material Inc.);流动相为乙腈-5 mmol·L^-1乙酸胺水溶液(含0.1%甲酸)=32:68;流速为0.30 mL·min^-1;内标为埃索美拉唑。采用电喷雾离子源,以多反应监测(MRM)方式进行正离子检测。结果:卢非酰胺的血浆浓度在40~5000 ng·mL^-1范围内线性良好,定量下限为40 ng·mL^-1,日内精密度(RSD)均≤8.20%,日间精密度(RSD)均≤6.35%,提取回收率为91.94%~96.48%。卢非酰胺呈非线性药动学特征,单剂量空腹口服给药卢非酰胺片200,400,800,1200 mg后,C_max分别为1803.50±528.06, 2485.00±562.71, 3710.00±965.50和4158.00±1181.91 μg·L^-1。AUC_0-t分别为34522.13±9525.00, 56138.53±18021.98, 88848.53±23348.14和107058.03±34420.08 μg·h·L^-1。结论:该法操作简单,灵敏,准确,重复性好,适用于卢非酰胺片临床药动学研究。从药动学研究可知,卢非酰胺在中国健康受试者中呈非线性药动学特征。