新型环烯烃聚合物微流控芯片的设计及其在大肠埃希菌O157:H7快速检测中的应用

目的建立一种可快速检测大肠埃希菌O157:H7的新型微流控芯片方法,用于细菌的早期鉴别与诊断。方法采用激光雕刻技术制作微流控芯片,在OCA光学透明胶上雕刻1条微通道,再将上、下2层环烯烃聚合物(COP)不可逆键合,最后通过免疫荧光方法检测大肠埃希菌O157:H7。比较微流控芯片法与培养法检测结果的总体符合率。结果成功建立了一种新型、简易的微流控芯片系统,对大肠埃希菌O157:H7的检测限为10~3CFU/mL,且有良好的特异性和可重复性,与培养法的总体符合率为95%。结论新型COP塑料芯片系统可实现对大肠埃希菌O157:H7的低成本、快速检测。     

阀控多通道微流控芯片高通量快速检测大肠埃希菌O157:H7

摘要：目的：建立一种基于气阀控制的多通道微流控芯片系统,实现高通量、低成本、快速检测大肠埃希菌O157:H7。 方法：采用集成多条反应通道和控制气阀的微流控芯片,用气阀控制芯片通道内反应的顺序,在通道交叉处构建出10个检测区。然后以免疫荧光技术为检测手段,检测水和粪便标本中的大肠埃希菌O157:H7。 结果：成功建立了一种基于气阀控制的多通道微流控芯片系统,并应用于大肠埃希菌O157:H7的快速检测。此芯片一次可同时检测10个样本,单个样本检测时间少于10 min、试剂消耗量仅为0.5 μL,对大肠埃希菌O157:H7的最低检测限为1×10³ CFU/mL。检测大肠埃希菌O157:H7组的荧光信号（4 122±164）与大肠埃希菌ATCC 25922（2.67±0.45）及伤寒沙门菌（3.33±0.94）比较,差异有统计学意义（t分别为35.78和30.79,P均<0.01）。批内精密度为5.2%。将本法用于模拟临床样品中大肠埃希菌O157:H7的测定,敏感性和特异性分别为62%和100%,与培养法的总体符合率为81%。 结论：于气阀控制的多通道微流控芯片系统可实现高通量、低成本、快速检测大肠埃希菌O157:H7,有望成为一种高效和快捷的新检测方法。     

基于DNA杂交CD式微流控芯片筛查苯丙酮尿症方法的建立

目的 建立一种基于往复流的DNA杂交CD式微流控芯片技术,用于PKU基因突变快速筛查.方法 设计并加工一种具有12个微通道的CD式微流控芯片,芯片采用PDMS-玻璃双层结构,分别含有微通道和水凝胶结合探针区.探针区包括R243Q、V245V和空白对照.将PAH外显子7扩增产物加入芯片的进样孔,在离心力的作用下进入杂交微通道区.芯片在离心机中交替旋转或暂停从而进行杂交反应.杂交后将芯片置于荧光显微镜下观察结果并分析荧光信号.评价该方法检测特异性、检测限及重复性.对30例疑似PKU孕妇DNA标本进行检测,并将检测结果与测序比较.结果 利用基于往复流的DNA杂交CD式微流控芯片只需1.5μl样品,杂交时间为15 min,杂交检测限为0.7 ng/μl.对于PKU患者组与健康对照组,芯片检测结果与测序结果一致.挑选不同批次的5张芯片及每张芯片内5个微通道重复检测同一V245V突变PKU患者DNA标本,结果均为阳性,说明重复性较好.对30例疑似PKU孕妇标本进行检测,筛查出4例携带V245V突变,1例携带R243Q突变.结论 建立了一种基于往复流的DNA杂交CD式微流控芯片检测PKU基因突变的方法,该方法简便、快速、高灵敏,可以用于PKU产前筛查.     

基于微流控芯片技术的三维细胞培养模式的建立及研究

目的建立适于进行三维联合细胞培养的微流控芯片平台。方法设计与制作一个多通道连接的高通量微流控芯片平台,通过向微通道内灌注含有细胞悬液胶质的方法构建三维立体培养体系,并通过注射泵连续供给细胞营养物质以模拟体内细胞生存的微环境,将肺癌细胞与人肺成纤维细胞置于体系中进行近似于人体生理条件下的三维联合细胞培养。结果成功建立了适于进行三维联合细胞培养的微流控芯片平台,实现了肺癌细胞与人肺成纤维细胞的联合三维培养。三维培养状态下的细胞生长状态良好,人肺癌细胞围绕肺成纤维细胞成串状生长,与二维单层培养模式的伸展状态明显不同。结论以基于微流控芯片技术的三维细胞培养模式为模型进行肿瘤生物学方面的研究,能够比较真实的反映肿瘤细胞的生物学特征,为微流控芯片技术在医学和生物学研究方面提供了一个新思路。     

微流控芯片用于分离蛋白质的影响因素及临床应用

目的建立微流控芯片电泳分离蛋白质的方法，并探讨微流控芯片电泳在分离临床尿液蛋白组份中的初步应用价值。方法①利用自制的微流控电泳分析仪和自制的石英芯片对电泳条件进行摸索，进行微流控芯片电泳分离蛋白质的方法学重复性、检测限及抗干扰实验；②利用全自动琼脂糖电泳仪与微流控芯片电泳仪对临床尿液标本进行电泳分离，对尿液中的蛋白质进行初步定性，判断尿液中蛋白质的来源。结果①在75mmol／L硼酸盐（pH10．5）含1％（v／v）乙胺电泳缓冲液中，进样电压500V，15s时电泳蛋白可得到基线分离；②在36例尿蛋白阳性患者中，用该法检测发现溢出性蛋白尿2例、选择性蛋白尿16例、非选择性蛋白尿18例，20例健康对照未检出蛋白峰。结论该法快速、简便，检测成本极低，有利于临床的诊断和预后判断，有较好的应用前景。     

丙型肝炎病毒核酸扩增及微流芯片检测方法的建立

目的建立稳定、可靠的核酸扩增和微流芯片分析法,用于血液中丙型肝炎病毒的检测。方法分别选取经2种酶联免疫吸附试验验证的丙型肝炎阴性（60份）和阳性（200份）血液标本;提取核酸后采用巢式PCR法进行扩增,最后用微流芯片法分析扩增产物。结果经过核酸扩增的丙型肝炎阳性血液经分析后皆出现预期大小片段的特异性条带,而阴性血液缺少相应的条带。结论本次建立的特异性巢式PCR扩增和微流芯片法检测结果可靠,可用于血液筛查。     

芯片实验室技术在POCT应用的研究进展

20世纪80年代兴起的微流控芯片技术,结合了医学领域中的化学技术、免疫层析技术、色谱、光谱、生物传感器及光电分析技术、计算机芯片技术、自动化技术等,在POCT中得到了广泛的应用。本文将从从核酸检测、蛋白检测和细胞检测及创新方法这四个方面简单介绍微流控芯片技术在POCT方面的应用实例。并对芯片技术在POCT的应用进行展望,相信随着高科技技术及生物技术的不断发展,微流控芯片在POCT方面的应用在功能及实用性等方面的会有更深层次的发展,可以为疾病的辅助诊断提供新的平台。     

微流控芯片技术研究梯度变化的剪切力诱导的血小板粘附、聚集效应

目的:应用微流控芯片分析技术研究梯度变化的剪切力对血小板聚集的影响。方法:应用微流控芯片模拟80%固定狭窄微通道，微通道狭窄模型利用三维建模软件sollidwork自带的有限元分析模块进行流体动力学行为分析。应用微流控芯片分析不同疾病患者血液的血小板粘附和聚集行为，以及采用流式细胞术检测血小板活化标志物CD62p的表达。同时使用抗血小板药物阿司匹林、替罗非班、原儿茶酸、CD42b处理血液，并通过荧光显微镜实时观察血小板粘附和聚集行为。结果:微流控芯片狭窄模型产生的梯度变化的流体剪切率能够诱导血小板聚集，且在一定剪切率范围内血小板粘附聚集程度随着剪切率的增加而增加。动脉血栓性疾病患者的血小板聚集效应明显高于正常对照组(P <0.05)，骨髓增生异常患者血小板聚集效应低于正常对照组(P <0.05)。结论:在剪切力存在环境下微流控芯片分析技术能够准确分析评估各种血栓性疾病的血小板黏附聚集效应，有助于临床血栓类疾病的辅助诊断。     

多种基于微流控芯片的检测方法用于细菌检测

致病菌常规检测方法以培养鉴定为主,该方法周期长,培养条件苛刻,难以做到快速检测。微流控芯片具有小型化、高通量、快速、集成、耗材少等优点,近年得到了快速发展并逐步应用于各个领域。利用微流控芯片技术可实现细菌的快速检测,将该技术与其他技术相结合也得到了广泛应用。该文就近些年联合其他细菌检测方法设计的微流控芯片进行了综述,并探讨各种协同方法的优缺点及临床应用前景或价值。     

微流控免疫芯片在医学检测中的现状和研究进展

传统免疫学检测需依靠大型且昂贵的仪器和熟练的操作人员,测量时间较长,敏感性却较低,同时即时检测需求也在不断上涨,故而临床需要一种高敏感、高准确、快速、便携的即时诊断方式。微流控芯片具有高敏感、高通量、自动化等优点,与临床即时诊断需求相契合。基于微流控技术和免疫检测开发的微流控免疫芯片成为近年来研究热点,在肿瘤标志物检测...     

HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.     

Capillary and microchip electrophoresis for rapid detection of known mutations by combining allele-specific DNA amplification with heteroduplex analysis

BACKGROUND: Detection of mutations by gel electrophoresis and allele-specific amplification by PCR (AS-PCR) is not easily scaled to accommodate a large number of samples. Alternative electrophoretic formats, such as capillary electrophoresis (CE) and microchip electrophoresis, may provide powerful platforms for simple, fast, automated, and high-throughput mutation detection after allele-specific amplification. METHODS: DNA samples heterozygous for four mutations (185delAG, 5382insC, 3867G-->T, and 6174delT) in BRCA1 and BRCA2, and homozygous for one mutation (5382insC) in BRCA1 and two mutations (16delAA and 822delG) in PTEN were chosen as the model system to evaluate the capillary and microchip electrophoresis methods. To detect each mutation, three primers, of which one was labeled with the fluorescent dye 6-carboxyfluorescein and one was the allele-specific primer (mutation-specific primer), were used to amplify the DNA fragments in the range of 130-320 bp. AS-PCR was combined with heteroduplex (HD) analysis, where the DNA fragments obtained by AS-PCR were analyzed with the conditions developed for CE-based HD analysis (using a fluorocarbon-coated capillary and hydroxyethylcellulose). The CE conditions were transferred into the microchip electrophoresis format. RESULTS: Three genotypes, homozygous wild type, homozygous mutant, and heterozygous mutant, could be identified by CE-based AS-PCR-HD analysis after 10-25 min of analysis time. Using the conditions optimized with CE, we translated the AS-PCR-HD analysis mutation detection method to the microchip electrophoresis format. The detection of three heterozygous mutations (insertion, deletion, and substitution) in BRCA1 could be accomplished in 180 s or less. CONCLUSIONS: It is possible to develop a CE-based method that exploits both AS-PCR and HD analysis for detecting specific mutations. Fast separation and the capacity for automated operation create the potential for developing a powerful electrophoresis-based mutation detection system. Fabrication of multichannel microchip platforms may enable mutation detection with high throughput.     

A high-performance microfluidic detection platform to conduct a novel multiple-biomarker panel for ovarian cancer screening

Ovarian cancer is an important leading cause of cancer-related deaths among females, and a single biomarker does not have the sensitivity and specificity required for an effective ovarian cancer screening. Herein, we investigate a high-performance microfluidic detection platform to conduct a novel panel of multiple biomarkers for the early detection of ovarian carcinoma, which include CA125, HE4, OPN, MSLN, Hsp70, CA153, AFP, IL-6, and IL-8 using a microfluidic chip. High-throughput microfluidic chips and graphene oxide-assembled substrate are used to microprint repeatable capture antibody arrays and conduct multiple biomarkers in microscale volume samples. The proposed microfluidic platform achieves an ultralow detection limit of ∼1 pg mL⁻¹ and 0.01 U mL⁻¹ with excellent detection selectivity and a short detection time of 30 min. The analysis of serum biomarkers in 18 ovarian cancer patients and 4 healthy persons indicates a clear subgroup sorting between the high-grade serous ovarian carcinoma, borderline, and benign tumor patients, and healthy persons. The proposed detection platform and the biomarker panel are promising to conduct an early detection of ovarian cancer.

A high-performance microfluidic detection platform is developed to conduct a novel panel of multiple biomarkers for the early detection of ovarian carcinoma, which is promising for the early detection of ovarian cancer.     

先天性肾上腺皮质增生症基因突变位点诊断方法的建立

目的 利用PCR产物直接测序、SNP位点分析和T-A克隆技术,建立先天性肾上腺皮质增生症的基因突变位点诊断方法.方法 收集临床诊断为21-羟化酶缺乏症(21-OHD)患者33例和17α-羟化酶缺乏症(17-OHD)患者2例及所有患者父母的外周血标本,以及105名健康对照者外周血标本.抽提外周血基因组DNA.根据CYP21A2基因与其假基因间的基因序列差异设计高特异性的PCR引物,扩增CYP21A2基因全长,通过PCR产物直接测序、SNP位点分析以及PCR产物T-A克隆分析检测CYP21A2基因突变.采用PCR扩增结合直接测序的方法进行CYP17A1基因突变的检测.结果 应用本研究建立的方法,可以对所有患者的基因突变进行诊断.33例21-OHD患者中,共发现13种不同形式的CYP21A2基因突变,其中IVS2-13A/C>G、p. I172N和融合基因分别占32%(21/66)、27%(18/66)和15%(10/66).91% CYP21A2基因突变源自于相应的假基因.2例17-OHD患者分别为CYP17A1基因IVS4-6A>G纯合突变及CYP17A1基因p.487_489del纯合突变.所有患者基因突变均来自父母.健康对照者均未检测出基因突变.结论 本研究建立了先天性肾上腺皮质增生症基因突变位点的诊断方法,为临床提供了可靠的确诊依据.     

多重聚合酶链反应-微流芯片检测人血小板抗原系统基因型方法的建立与应用

目的建立人血小板抗原（HPA）-2、4、5系统基因型的检测方法。方法用多重聚合酶链反应和微流芯片检测方法，通过设计9条特异性引物、优化反应体系和反应条件，在一个体系中同时扩增HPA-2、4、5系统特异性的目的基因片段，利用微流芯片快速检测HPA-2、4、5系统基因型；并把分型结果与采用聚合酶链反应．序列特异性引物（PCR-SSP）获得的结果进行比较。结果对35名健康单采血小板者进行HPA-2、4、5系统分型的结果为：33名为2a／2a型，2名为2a／2b型；34名为4a／4a型，1名为4a／4b型；29名为5a／5a型，6名为5a／5b型。未发现2b／2b、4b／4b及5b／5b纯合子个体。该结果与PCR．SSP方法获得的结果完全一致。结论该方法可快速、准确地用于血小板血型抗原基因分型，尤其适合于大样本检测。     

HBsAg ELISA-/NAT+的HBV血清学模式和病毒变异分析

目的结合乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的检测结果,分析血清标本血清学模拟及DNA序列,了解HBV DNA以及HBsAg血型模式之间的关系。方法选自该院54例血液标本作为本研究对象;对标本行HBV DNA提取、PCR扩增处理、PCR产物纯化、DNA测序、HBV基因分型和序列分析,并运用生物信息学软件对测序结果进行分析处理,对比分析基因突变情况。结果 PCR扩增结果,54例标本中40例表现为非常显著的PCR扩增不佳,14例标本PCR产物电泳均能够观察到1 400bp特异性条带;22例为HBsAg ELISA阳性,14例为隐匿性HBV阳性,PCR扩增阳性行基因型检测,B型基因在HBsAg ELISA中占81.82%,C型基因在隐匿性HBV阳性中比例为78.57%,差异具有统计学意义(P0.05);14株隐匿性HBV基因中,6例在S区区域内发生基因序列点突变,其中2例在1个碱基点出现突变,另3例在2个位点的碱基点出现突变;3例HBV基因C型感染者出现基因点突变,2例B基因型感染者出现基因点突变;5例标本在9个位点部位的"a"决定族内碱基点出现突变,A-C的突变较多。结论血液筛查中,检测显示为HBsAg的阴性合格血液,仍可能有隐匿性乙肝感染和窗口期漏检,其病毒株主要为C型,且有变异株,B型病毒株相对较少,但突变株相对较高,可能逃避现有筛查试剂。     

微流体芯片技术在ABO血型基因分型中的应用

本研究建立一种简单、可靠的ABO基因检测结果报告评估方法。利用微流体芯片检测技术代替凝胶电泳,通过对实验条件的优化,进行multiplex—PCR—RFLP的ABO基因分型结果判读,并通过对150份标本进行测试．对该检测方法的稳定性和准确性进行评估。结果显示,全部检测结果与血清学分析结果一致,并且检测出1例因肿瘤引起的B型抗原减弱病例。结论：建立的微流芯片基因检测系统稳定、可靠,实现了ABO基因分型检测结果的客观化、标准化和自动化。     

Rapid detection of specific gene mutations associated with isoniazid or rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using non-fluorescent low-density DNA microarrays

BACKGROUND: A new, fast 'low cost and density' DNA microarray (LCD array), designed for the detection of mutations that confer isoniazid or rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates, has been developed and was evaluated using 46 resistant clinical isolates from Barcelona. METHODS: LCD chips are pre-structured polymer supports using a non-fluorescent detection principle based on the precipitation of a clearly visible dark substrate. One LCD chip consists of eight identical microarrays, designed to detect mutations within the 90 bp rpoB region, codon 315 in the katG gene and the mabA-inhA regulatory region. A total of 22 strains with a katG 315 mutation, 19 strains with alterations in the mabA-inhA regulatory region and 16 strains with mutations in the rpoB region, characterized previously, were studied. RESULTS: The identification of S315T and S315N mutations using the LCD was 100% concordant with the sequencing data. A strain with the S315R mutation, which is not tiled on the LCD array, was detected by the absence of hybridization using the wild-type probe. Of 19 strains with low-level isoniazid resistance related to the mabA-inhA regulatory region, 18 were identified correctly. The detection of mutations in the rpoB region was 93.8% concordant with the sequencing data. One mabA-inhA and rpoB mutated strain showed a cross-hybridization. CONCLUSIONS: The LCD array protocol takes 45 min (15 min 'hands-on' time) after prior PCR amplification. Only minimal laboratory equipment is required. LCD arrays provide a rapid and economical method to characterize mutations in codon 315 of the katG gene, in the mabA-inhA regulatory region and in the rpoB gene.