非小细胞肺癌人群中c-MET基因的扩增检测

目的：c-MET基因扩增是非小细胞肺癌对EGFR TKIs（吉非替尼或厄罗替尼）产生耐药的主要机制之一。本研究探讨没有接受TKIs治疗与TKIs治疗后耐药的NSCLC中c-MET基因的扩增是否存在差异。方法:获得55例术后非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤组织（基线组）以及23例对TKIs耐药的肿瘤组织（耐药组）后,通过激光显微切割筛选癌细胞后提取基因组DNA,实时荧光定量PCR TaqMan探针法检测所有标本的c-MET基因的拷贝数。 结果:1.基线组和耐药组的临床病理特征均与c-MET基因的扩增无关。2.基线组中c-MET基因扩增阳性率为5.5% (3/55);耐药组的c-MET基因扩增阳性率为21.7% (5/23)。两组之间有统计学差异（Fisher精确概率法,P=0.045）。3.在7例获得TKI治疗前后肿瘤组织的NSCLC中,TKI治疗前没有出现c-MET的基因扩增,TKI治疗后有2例患者出现了c-MET的基因扩增（2/7）。TKI治疗前后的c-MET基因扩增差异无统计学意义。结论:NSCLC的临床病理特征不能预测c-MET基因扩增;在没有接受EGFR TKIs治疗的NSCLC中,c-MET基因扩增仅为少见事件。但经过吉非替尼或厄罗替尼治疗后出现耐药情况NSCLC中,部分患者的c-MET基因出现扩增。     

HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.     

XAGE-1b基因在非小细胞肺癌中的表达及与临床特点的相关性研究

目的 探讨XAGE-1b基因在非小细胞肺癌中的表达水平及与临床特点的相关性.方法 非小细胞肺癌患者30例,通过手术获得肺癌组织和癌旁正常肺组织,分别提取组织总RNA,RT-PCR反应扩增XAGE-1b基因全长,通过电泳和基因测序鉴定RT-PCR产物,确定基因表达阳性标本,分析基因表达阳性率及与临床特征相关性.结果 30例肺癌组织中,XAGE-1b基因表达阳性率为40%(12/30),30例癌旁正常肺组织不表达该基因;基因表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度无相关性,与病理类型有相关性,腺癌中基因表达阳性率明显高于其他病理类型(61.1%vs 8.3%,p=0.015);随着TNM分期的升高,基因表达阳性率略有增加,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 XAGE-1b基因在肺腺癌中高表达,可优先选择该基因作为肺腺癌免疫治疗靶点.     

非小细胞肺癌PTEN基因突变的临床特征

  目的  了解非小细胞肺癌中PTEN基因突变的分布状况及其临床特征。  方法  选取2003年9月至2009年12月间182例在广东省人民医院收治的非小细胞肺癌患者的手术或穿刺标本,抽提RNA后,逆转录成cDNA,再进行PCR扩增PTEN 1~9外显子及EGFR 18~21外显子,用直接测序法检测基因突变。  结果  182例标本中,PTEN基因的突变率为9.9%（18/182）,PTEN基因的突变率女性为6.5%,男性为11.0%（P=0.549）;吸烟者为13.0%,非吸烟者为6.7%（P=0.15）;腺癌为7.8%,鳞癌为9.9%（P=0.628）,差别均无统计学意义。常见的突变类型有点突变、插入突变及缺失突变,共11例,主要分布在第8外显子,也可见于第4、5、9外显子;其中10例为男性吸烟者,1例为男性非吸烟者;8例为鳞癌,1例腺癌,2例大细胞癌;此外,发现7例大片段缺失突变,缺失片段位于第1~7外显子,约250~539 bp碱基丢失,突变率为3.8%（7/182）,除了1例为大细胞癌外,其余6例均为腺癌;PTEN基因突变率与性别、吸烟状态分布无统计学相关性;其中4例大片段缺失伴随EGFR基因敏感突变。  结论  具有不同PTEN基因突变类型的NSCLC可能是两种不同的疾病类型,不同突变类型的PTEN基因在NSCLC中的作用机制不同。PTEN基因的大片段缺失可能是突变型EGFR对TKI原发耐药的原因之一      

抑制性消减杂交技术检测反式二羟环氧苯并芘转化细胞与正常细胞基因表达差异

目的　筛选 7,8 二羟 9,10 环氧苯并芘 (BPDE)转化细胞与正常细胞的基因表达差异。方法　以BPDE转化支气管上皮细胞 (16HBE)细胞为检测子 (tester) ,正常 16HBE细胞为驱动子 (driver) ,应用抑制性消减杂交方法构建cDNA消减文库 ,经 2次消减杂交和 2次PCR后 ,将巢式PCR产物插入TA载体克隆 ,随机挑选克隆进行鉴定和测序 ,并用斑点杂交法验证其同源性 ,将所得序列进行GenBank的BLAST分析。结果　发现了 7个在BPDE转化细胞中高表达的基因 ,为翻译延长因子 1α1、线粒体基因、溶解物载体家族 2 5、EphA2、酪氨酸 3 加单氧酶 色氨酸 - 5 -加单氧酶活化蛋白、乳酸脱氢酶A、TRIM2 8等 ,尚有一条在GenBank的已知基因中找不到对应序列 ,在EST序列中找到全长对应序列。结论　发现的高表达基因可能在BPDE的致癌机制中起作用 ,另外 ,可能有未知基因与BPDE的恶性转化作用有关。     

抗氧化剂拮抗甲基汞诱导的脂质过氧化作用研究

目的 探讨抗氧化剂对甲基汞诱导的脂质过氧化的拮抗作用。方法 运用硫代巴比妥酸比色法,检测了谷胱甘肽（ＧＳＨ）、羧乙基锗倍半氧化物（Ｇｅ－１３２）、维生素Ｃ（ＶｉｔＣ）等对甲基汞在体外诱导的大鼠脂质过氧化物（ＬＰＯ）的影响。结果 与阳性对照组相比,２、４、６ｍｍｏｌ／Ｌ ＧＳＨ组大脑、小脑和肝组织匀浆中ＬＰＯ含量均显著下降（Ｐ〈０．０５）;０．５、１．０、１．５、２．０ｇ／Ｌ Ｇｅ－１３２组以及０．     

层粘连蛋白受体基因表达谱分析

目的 探讨层粘连蛋白受体（67LR1）基因相关的一组基因表达变化，为反式二羟环氧苯并芘致癌机制的研究提供依据。方法 构建67LR1转基因表达载体，转染人支气管上皮细胞（16HBE），获得转基因67LR1的瞬时表达的细胞株。用半定量RT-PCR方法分析转基因表达产物，应用含8064个基因点的微芯公司基因表达谱芯片CSC-GE-80与双荧光标记样品与芯片杂交和扫描、图像数据分析等一系列处理进行表达谱分析。结果 成功构建出瞬时表达67LR1的细胞株。基因表达谱分析，2组相比发生了显著性表达变化的基因有295个，其中表现为上调的基因有145个，下调表达的基因有150个。在发生了显著性表达改变的基因中，比较有明显功能分类特征的包括与信号转导相关的基因，与肿瘤相关的基因，与免疫反应相关的基因以及与蛋白质合成系统相关的基因等。结论 67LR1基因功能涉及到信号转导、肿瘤相关基因等方面，相关基因的表达变化具有复杂性。     

反式二羟环氧苯(a)芘相关新基因brg的全长克隆

背景与目的:在前期研究中发现,16HBE-C细胞表达变化的基因中有未知基因参与,因其与BPDE有关,所以命名为brg(anti-BPDE related gene)基因.本研究应用cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增此未知基因的全长,以进行下一步的基因功能研究.材料与方法:应用cDNA末端快速扩增法(RACE技术),对3'和5'端分别设计了梯度PCR,巢式PCR等优化程序,以获得特异的产物,然后对特异产物直接测序,将测序结果进行生物信息学分析,基因拼接等获得新基因brg全长.结果:3'和5'端均成功获得特异性产物,3'RACE测序为394 bp,有明显的PolyA加尾信号,有编码区的终止密码子;5'RACE测序为1 017bp,有起始密码子ATG,其中197 bp为3'和5'全长共有序列.将3'和5'序列拼接,结果全长1 214 bp,生物信息学分析brg基因阅读框1 032 bp,编码344个氨基酸.结论:所得结果与设计一致,说明所采用的技术路线是简便可行的,brg基因可能在反式二羟环氧苯并(a)芘的致癌机制中起重要作用.     

吉非替尼治疗前后肺腺癌患者血清蛋白质谱的变化

背景与目的 表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治疗晚期NSCLC患者最终都会出现耐药.本研究目的 是检测耐药前后血清蛋白质谱的变化,探索可能用于预测TKI治疗后出现耐药的血清预测因子.方法 收集9例晚期NSCLC患者接受吉非替尼(gefitinib)治疗前后自身配对的血清样本20份,即入组口服吉非替尼前及临床评价为疾病进展前两周所采集的外周血血清.所有的患者对吉非替尼的最佳总疗效评价为疾病稳定或部分缓解.所有样本用弱阳离子微珠进行预分离后.在Bruker AutoflTM基质辅助激光解析离子化-时间飞行质谱仪(MALDI-TOF-MS)上进行血清蛋白质谱检测.以ClinProTools(Version:2.1)软件进行数据采集分析.结果 自身配对分析发现有7个血清蛋白质表达水平在肺癌患者耐药前后的血清中有统计学差异.该7个血清蛋白质谱峰为3 242.09、8 690.36、2 952.64、3 224.04、1 450.51、1 887.8及3 935.73(m/z).有3个血清蛋白(3 242.09、2 952.64及3 224.04)在耐药血清中下调,其余4个血清蛋白(8 690.36、1450.51、1 887.8及3 935.73)则出现上调.结论 特定的血清差异蛋白可能与吉非替尼治疗有效患者在治疗过程中出现耐药相关.这些差异蛋白的特性及其与吉非替尼治疗耐药的分子机制有待进一步研究.     

铅对大鼠脑区POU蛋白Brn-3a的mRNA转录水平的影响

目的探讨铅对大鼠中枢神经系统神经细胞内转录因子Brn-3a基因mRNA转录水平的影响。方法雌性大鼠经围产期饮水染铅(对照组蒸馏水、低铅组0.5g/L、中铅组1.0g/L、高铅组2.0g/L)后,对其21日龄仔鼠不同脑区的Brn-3a mRNA基因转录水平进行了观察,采用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)和组织原位杂交半定量检测Brn-3a的mRNA水平。结果RT-PCR凝胶成像系统结果显示,各染铅剂量组脑组织海马区扩增产物的电泳条带密度与对照组相比差异有显著性(P<0.05),皮层及小脑部位与对照组相比差异无显著性。原位杂交检测Brn-3a的mRNA图像分析结果显示,高铅组与对照组相比,在大脑皮层和海马部位可见平均灰度值升高(P<0.05),表明mRNA的表达量减弱,而小脑部位未见明显变化。在海马部位还可见阳性面积比显著下降(P<0.01)。结论结果表明,仔鼠大脑海马区Brn-3a基因转录水平有所下降,Brn-3a作为转录调节因子参与了铅对学习记忆损害的神经毒性过程。