人α2(Ⅰ)型胶原基因启动子活性研究

目的探索器官纤维化形成中调控Ⅰ型胶原基因高水平转录的启动片段及TGF-β、PDGF-BB、IGF-1等细胞因子对其活性的影响. 方法从人α2(Ⅰ)胶原基因转录起始点上游-2.4kb至+58bp的片段中,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞,测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性,同时加入细胞因子,以测定其对Ⅰ型胶原启动序列的影响. 结果除 -129～+58bp序列外,其余4个重组体CAT表达水平均较高,其中-2292～+58bp、-1476～+58bp序列具较强启动CAT表达活性,-339～+58bp、-616～+58bp片段次之.TGF-β、IGF-1均能在一定程度上调人α2(Ⅰ)胶原基因启动活性. 结论人α2(Ⅰ)胶原基因片段-2292～+58bp、-1476～ +58bp、-339～+58bp有高启动活性,是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列.TGF-β、IGF-1促进胶原表达,与其上调胶原基因启动活性有关.     

抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响①

目的研究TGF-β及中药抗纤复方对小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因上游启动子活性的影响。方法以含小鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游0.4、0.8、2.0 kb启动片段为研究靶序列，以氯霉素乙酰基转移酶（CAT)作报告基因，应用基因转染技术研究小鼠胶原启动子活性。结果TGF-β可促进小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因启动序列的启动活性，而中药抗纤复方可明显抑制其启动活性。结论TGF-β和中药抗纤复方都可作用于胶原α2(Ⅰ)基因调控片段，进而促进或抑制胶原合成。     

多种细胞因子对转化生长因子β1转录的调控作用

目的探讨细胞因子TNF-α、IFN-γ、IFN-α、PDGF-BB、bFGF对TGF-β1启动活性的影响.方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得含有人TGF-β1基因启动子序列的-1 328～+812 bp片段,与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因构建重组体phTGF2.14, 将其瞬时转染大鼠nFSC细胞,加入细胞因子进行干预,测定CAT活性.结果10 ng/ml TNF-α可以使重组体的CAT活性升高3.24倍;浓度为1 000 U/ml的IFN-γ、IFN-α使phTGF2.14的CAT活性分别降低至对照的(42±12)%、(58±6)%;浓度为10 ng/ml的PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的活性没有影响;IFN-γ、IFN-α和TNF-α联合应用TGF-β1基因启动子的活性分别为对照的1.32和1.46倍.结论TNF-α可促进TGF-β1基因启动子的活性;IFN-γ、IFN-α则对TGF-β1基因启动子的启动活性有抑制作用;IFN-γ、IFN-α可以阻断TNF-α对TGF-β1基因启动子的促进作用;PDGF-BB、bFGF对TGF-β1基因启动子的启动活性无影响,此研究为进一步研究细胞因子在纤维化疾病的相互作用机制提供了依据.     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响

目的：研究ＴＧＦ－β及中药抗纤复方对小鼠前胶原α２（Ｉ）基因上游启动子活性的影响。方法：以含小鼠胶原α２（Ｉ）上游０．４、０．８、２．０ｋｂ启动片段为研究靶序列,以氯毒素乙酰枯转移酶（ＣＡＴ）作报告基因,应用基因技术研究小鼠胶原启动子活性。结果：ＴＧＦ－β可促进小鼠前胶原α２（Ｉ）基因妄动序列的启动活性,而中药抗纤复方可抑制其启动活性。结论：ＴＧＦ－β和中药抗纤复方都可作用于胶原α２（Ｉ）基因调控     

人B细胞活化因子基因启动子活性研究

为探索与自身免疫病发病密切相关的B细胞活化因子(BAFF)基因高水平转录的启动序列及IFN-γ等炎性细胞因子对其活性的影响,以人BAFF基因转录起始点上游-1 349 bp至-329 bp的片段为靶序列,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,脂质体转染法转染上述重组体至人骨髓白血病细胞株:HL-60,CAT-ELISA测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性;同时加入细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、重组人BAFF蛋白(rBAFF),以测定其对BAFF启动序列的影响。结果表明,-1 349~-329 bp、-1 349~-743 bp序列具有强启动调控活性,而-1 349~-1 099 bp片段启动活性最低。细胞因子IFN-γ、IL-10和rBAFF均能在一定程度上调人BAFF基因的启动活性,IL-4则一定程度地抑制BAFF基因的启动活性。研究提示,人BAFF基因-1349~-743 bp片段是进一步研究BAFF基因转录相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、rBAFF可以一定程度的在转录水平影响BAFF合成和分泌。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响1

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原(COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响.方法构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～+42bp(0.27kb)与-2483～+42bp(2.5kb)片段.将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性.结果13nmol/LIGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍.2.5μmol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍.TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性.结论IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-α、IFNγ、IFNα能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用.     

新生隐球菌荚膜相关基因CAP10启动序列的活性研究

目的 筛选具启动活性的新生隐球菌荚膜相关基因CAP10编码区上游5’侧翼序列（启动子序列），为进一步研究其调控机制打下基础。方法 利用氯霉素乙酰基转移酶（CAT）的编码基因为报告基因，构建了含不同长度的新生隐球菌荚膜相关基因CAP10编码区上游5’侧翼序列和报告基因的重组体，转化酵母，ELISA方法检测各转化子的CAT表达活性，并通过比较找到CAP10启动序列。结果 发现含CAP10编码区上游-303 bp、-390bp、-500bp、-951bp的转化子具有明显的CAT表达活性，而含-202bp、-102bp的转化子无明显的CAT表达活性。结论 CAP10上游5’侧翼端-303bp-0bp是具完整启动活性的最小单位。CAP10上游5’侧翼端-202bp--303bp内含CAP10启动所必需的序列。     

普伐他汀对人I型胶原α1(I)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人I型胶原α1(I)链启动子活性的调控 ,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响。方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养。构建含人α1(I)前胶原基因5'侧翼序列 -2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)的重组体 phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞 ,CAT -ELISA测定普伐他汀对重组体的作用。结果设对照组的CAT值为1 ,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04 ,普伐他汀能明显抑制I型胶原α1(I)启动子的活性。结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(I)前胶原基因表达。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人a1（I）前胶原启动子活性的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子1（IGF-1）和胰岛素对人a1(I)前胶原（COL1A1）基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子a(TNFa）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素a(INFa）对这一作用的影响。方法：构建含 COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～ 42bp(0.27kb)与-2483～ 42bp(2.5kb)片段。将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFa或IFNγ或IFNa,测定CAT活性。结果：13nmol/L IGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍。2.5umol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍。TNFa、IFNγ、IFNa能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性。结论：IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-a、INFγ、IFNa能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用。     

细胞因子对小鼠α2（Ⅰ）型前胶原基因启动子活性影响的研究

目的;探讨细胞因子对小鼠α２（Ⅰ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。方法：以小鼠α２（Ⅰ）型前胶原基因启动子（－２ｋｂ～＋５４ｂｐ）为靶序列,将它与氯霉素乙酰基转移（ＣＡＴ）报告基因组成的重组体ｐＡＺ１００９用脂质体法转染至胶原产生细胞ＮＩＨ／３Ｔ３细胞,讨论ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＦＮα对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。结果：ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强抑制作用,     

人TAK1基因启动子活性的研究

目的鉴定人TAK1启动子片段结构,探索调控TAK1基因高水平转录的启动片段。方法利用生物信息学软件分析TAK1基因启动子结构,构建TAK1启动子序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体,脂质体法转染滑膜成纤维样细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性。结果人TAK1基因-260~+25 bp片段具有高转录活性,明显高于其他片段,而-88~+25 bp启动子片段活性最低。结论人TAK1基因-260~-170 bp是主要的转录调控区,是进一步研究DNA结合蛋白的调控靶序列。     

细胞因子对小鼠α2(I)型前胶原基因启动子活性影响的研究

目的：探讨细胞因子对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。方法：以小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因启动子（－２ｋｂ～＋５４ｂｐ）为靶序列,将它与氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因组成的重组体ｐＡＺ１００９用脂质体法转染至胶原产生细胞ＮＩＨ／３Ｔ３细胞,讨论ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。结果：ＴＮＦα抑制小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因启动子活性,ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强这种抑制作用。结论：ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强抑制作用,这可能与ＩＦＮγ、ＩＦＮα诱导ＴＮＦα受体表达,从而加强ＴＮＦα抑制作用有关,而ＩＦＮγ抑制胶原蛋白合成作用与该序列无直接相关。     

垂体生长激素的调节激素对人B淋巴母细胞系IM-9中生长激素基因启动子活性的影响

目的：通过观察生长激素释放激素（GHRH）、山德定、生长激素（GH）和胰岛素样生长因子I（IGF－I）对IM－9细胞中GH基因启动子活性的影响，以了解这些激素对B淋巴细胞中GH表达的调节作用。方法：把人外周血淋巴细胞GH基因上游－484～ 2bp调控序列克隆到荧光素酶报告基因质粒中，然后把克隆得到的质粒转染到IM－9细胞内，通过测量荧光素酶泊活性观察垂体GH的各种调节激素对GH基因启动子活性的影响。结果：0．001nmol/L的人GHRH能够显著抑制荧光素酶在IM－9细胞中的表达（P＜0．002），但0．1nmol/L和10nmol/L的GHRH对荧光素酶的抑制作用反而减弱。人IGF－I（1、10和100nmol/L可增强荧光素酶的表达（均P＜0．05）。GH（1．0ng/ml）可显著增加荧光素酶的表达，但作用的强度不大。不同浓度的生长抑素类似物山德定对IM－9细胞中荧光素酶的表达均无显著影响。结论：GHRH、IGF－I和GH对IM－9细胞中GH启动子的活性有一定的调节作用,说明调节垂体GH分泌的GHRH、IGF－I和GH等能够调节G淋巴细胞内irGH的表达。     

普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性调控的研究

目的：研究普伐他汀对人Ⅰ期胶原α1（Ⅰ）链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ期胶原合成的影响。方法：大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代,传代培养,构建含人α1（Ⅰ）前原基因5'侧翼序列－2．5kb与报告基因氯霉素乙酰基转酶（CAT）的重组体phCOL2.5,用FuENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT－ELISA测定普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1（Ⅰ）启动子和活性。结论：普伐他汀可以在转不水平上调节α1（Ⅰ）前胶原基因表达。     

肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的；研究肿瘤坏死因子α（TNFα），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ)对内皮细胞组织因子（TF）表达的影响，并探讨TF基因5‘上游序列在TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法：应用细胞原位杂交技术检测TF mRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光毒酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，检测及分析报告基因活性。结果：TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TF mRNA的表达增强。在TF基因上游序列－244／＋121bp存在时，TNFα，AngⅡ均可使转梁内皮细胞荧光素酶表达量明显增加，而在－111／＋121bp存在时TNFα，AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异，而且较－244／＋121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论：TF基因上游－244／－112bp序列的存在对TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

载脂蛋白AⅠ基因启动子和内含子1中的单核苷酸多态性对其表达的影响

目的构建含ApoAⅠ基因调控区和荧光素酶报告基因的真核表达载体，探讨ApoAⅠ基因启动子区域-75bp G→A置换及第1内含子＋83bp C→T置换对ApoAⅠ表达的影响。方法采用PCR方法扩增人染色体中含ApoAⅠ基因-145～＋289bp的DNA片段，筛选出含ApoAⅠAA／CC基因型（-75bp变异，＋83bp无变异）、GG／TT基因型（-75bp无变异，＋83bp变异）及GG／CC（-75bp和＋83bp均无变异）的DNA片段，构建含以上3个基因片段的pUC重组载体，经SacⅠ和BglⅡ酶切后，再将不同的DNA片段连接到含荧光素酶报告基因的pGL2载体中，获得多个重组克隆。采用阳离子脂质体转染法将携带萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒和携带海肾荧光素酶报告基因的对照质粒共转染HepG2细胞，经48h培养，用化学发光法测定细胞裂解液中荧光素酶的活性，以反映ApoAⅠ的表达水平。结果质粒重组获得3个pGL2-ApoAⅠ-L（-2500～＋289bp）长片段质粒和3个pGL2-ApoAⅠ-S（-145～＋289bp）短片段质粒，分别含AA／CC、GG／TT及GG／CC3种基因型。荧光素酶报告基因活性显示：ApoAⅠAA／CC或GG／TT基因型携带者引起荧光素酶相对活性明显低于GG／CC基因型者。结论基因启动子ApoAⅠ-75bp G→A置换和＋83bp C→T置换对ApoAⅠ转录活性起抑制作用，这可能是-75A和＋83T等位基因携带者高密度脂蛋白血浆水平降低的原因。     

重组人TGF-β1对TGF-β1基因启动活性的影响

目的：探讨TGF-β1对人TGF-β1基因自身启动子活性的影响。方法：以人全血基因组DNA为模板，PER扩增获得TGF-β1基因转录起始位点上游5′端-1328～ 812bp和 227～ 812bp的片段，以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因而不含启动子的pCAT-enhancer质粒构建成重组质粒，并将其转染至大鼠星状细胞株nFSC中，细胞在DMEM培养基中进行培养，用不同浓度的TGF-β1进行干涉，测定并比较细胞的CAT表达水平。结果：不同浓度的TGF-β1对大鼠的肝脏星状细胞的增殖具有抑制作用，而且这种抑制作用在实验用的浓度范围内具有剂量依赖关系；浓度为2．5ng/ml TGF-β1可以使转染phTGF0．585、phTGF1．120、phTGF1．423、phTGF1．680、phTGF2．140质粒的大鼠肝星状细胞的CAT活性分别增加2～5倍。结论：TGF-β1在大鼠nFSC细胞中对TGF-β1启动子活性具有自身促进作用，为进一步研究TGF-β1的调节机制提供了依据。     

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建。以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD2基因启动子不同长度的4段序列,利用特定的限制性内切酶位点,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这4个序列片段进行酶切并插入表达载体pEGFP-N3中,用Vsp I和Pst I双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000介导转染HTK293T细胞,转染24 h后加入TNF-α持续刺激细胞24 h或不加TNF-α刺激,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因绿色荧光蛋白(green fluores-cent proteins,GFP)。结果:pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEG-FP-N3-NOD2(1 387 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的4段重组质粒pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)转染的HTK293T均能表达绿色荧光,其中构建pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)重组质粒经TNF-α持续刺后激绿色荧光表达最强。4段不同长度的人NOD2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体成功构建,这为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。     

普伐他汀对人Ⅰ型胶原α 1(Ⅰ)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响.方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养.构建含人α 1(Ⅰ)前胶原基因5'侧翼序列-2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT-ELISA测定普伐他汀对重组体的作用.结果设对照组的CAT值为1,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04,普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)启动子的活性.结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(Ⅰ)前胶原基因表达.