基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血基因突变

目的:采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血。方法:首先提取正常人血液基因组DNA,根据已知β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS2-654区域序列,分别设计突变序列扩增引物,利用低保真酶进行引物延伸反应,将其PCR产物克隆到pMD19-T载体,得到β地中海贫血常见的两个突变位点的基因突变克隆:CD41-42、IVS2-654,然后以这两个突变位点为检测靶点,分别设计3′末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物,硫化磷酸修饰3′末端并偶联高保真DNA聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应,并通过凝胶成像系统对其进行分析。结果:当引物与模板完全配对时,引物被延伸,有PCR产物;当引物与模板不完全配对时,引物不被延伸,无PCR产物。结论:高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关能准确、快速筛查β地中海贫血CD41-42、IVS2-654突变,提示其在单基因遗传病的诊断中具有广阔的应用前景。     

突变敏感性分子开关检测线粒体DNA A1555G位点的条件优化

目的对高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术检测线粒体DNA(mt DNA)A1555G位点条件进行优化。方法利用3'硫代磷酸化修饰的突变型引物和野生型引物作为下游引物,在其上游设计一条公共引物分别构成突变引物对和野生引物对,以构建好的包含mt DNA A1555G位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,对PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度等条件优化,通过凝胶成像系统对其PCR结果进行分析确定最佳反应条件。结果分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳PCR条件:退火温度为61.0℃,引物浓度为0.6μmol/L,检测模板浓度为103~106copies/μL。结论确定了分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳反应条件,为该技术在线粒体DNA的突变筛查中的应用提供依据。     

子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台的构建及初步应用

目的 构建子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台,为临床分析PTEN基因968delA突变与子宫内膜癌的相关性提供技术支持。方法 设计PTEN基因968delA位点的特异性硫化修饰引物,以本实验室前期构建的包含PTEN基因968delA位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,采用正交设计进行PCR条件优化,再将其优化后采用突变敏感性分子开关技术检测从南华大学附属第一医院收集的62例临床患者子宫内膜组织样本PTEN基因968delA位点突变。结果 突变敏感性分子开关技术检测PTEN基因968delA位点最佳PCR反应条件为：30个循环、模板DNA(10 ng/μL)0.3μL、引物(10μmol/L)0.5μL、退火温度61℃,灵敏度达10^-3 ng/μL。62例子宫内膜癌组织与21例正常子宫内膜组织标本均未发现PTEN基因968delA突变。结论 成功构建了子宫内膜癌PTEN基因968delA突变检测技术平台,为该技术在PTEN基因968delA的突变筛查中的应用提供了依据。     

双重PCR检测急性髓系白血病FLT3-ITD和NPM1基因突变

本研究旨在建立一种同时筛查FLT3-ITD突变和NPM1突变的检测方法.设计2对引物,分别扩增NPM1基因的外显子12和FLT33基因的外显子14、内含子14、外显子15,以覆盖几乎所有已知突变位点.对双重PCR体系的反应程序和引物浓度比例进行优化,将双重PCR产物通过毛细管电泳分离,根据野生型产物和突变型产物的大小差...     

EGFR外显子19、21突变等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的 建立一种人表皮生成因子受体(EGFR)外显子19、21突变等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)检测方法.方法 根据EGFR外显子19、21野生型和突变型设计特异性引物,提取健康人和非小细胞肺癌患者血中有核细胞的基因组DNA作为模板,采用等位基因特异性聚合酶链式反应扩增EGFR外显子19、21突变基因.结果 特异性引物可以扩增EGFR外显子19缺失突变的2种类型和外显子21的错义突变.结论 等位基因特异性PCR法可以用于检测人EGFR外显子19、21突变.     

应用高分辨熔解曲线分析技术检测β-地中海贫血基因突变

目的探讨高分辨熔解曲线(HRM)分析技术检测β-地中海贫血基因突变的可行性。方法应用HRM法检测广东省常见的5种β-地中海贫血突变(-28、CD17、CD41-42、CD71-72及IVS-2-654),对60例可疑β-地中海贫血患者样本进行HRM分析,通过DNA测序对HRM结果进行验证。结果 60例可疑β-地中海贫血患者中,共检出杂合突变型基因12例,包括2例-28、2例CD17、4例CD41-42、2例CD71-72及2例IVS-2-654基因突变类型;检出纯合突变型基因2例,包括1例-28及1例CD41-42(均为羊水标本)。HRM法检测结果与测序结果一致。结论 HRM法能准确检测广东省5种常见的β-地中海贫血突变,具有简便、快速、灵敏度高等优点,有望成为临床筛查β-地中海贫血突变的新方法。     

应用限制性内切酶分析PCR产物快速诊断Hb CS基因突变

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）选择性扩增包括ＨｂＣＳ突变（ＴＡＡ→ＣＡＡ）位点在内的ａ２珠蛋白基因片段，利用与该点突变密切相关的天然Ｔｒｕ９１位点和由ＰＣＲ引物介导出和人工ＨｉｎｆＩ位点的变化可识别ＨｂＣＳ突变等位基因和野生型等位基因。ＰＣＲ产物直接经Ｔｒｕ９１或ＨｉｎｆＩ消化及电泳分析后即可对样品ＤＮＡ中是否存在ＨｂＣＳ空变及其基因型作出诊断。此法简便、省时，可用于基因筛查和产前诊断。     

用PCR-RFLP检测血红蛋白E基因CD26突变

目的建立PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)法检测血红蛋白E(HbE)基因CD26突变。方法对HbE复合β地中海贫血(β地贫)家系的患者基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶MnlⅠ消化,通过分析酶切产物PAGE图谱确定是否携带CD26突变。结果筛选出2个家系中4例CD26突变携带者。结论CD26突变在四川人群中有一定的频率,PCR-RFLP方法能快速、准确、特异地检测CD26突变。     

云南省德宏地区154例地中海贫血的基因型研究

目的鉴定云南德宏地区地中海贫血病例中的基因突变类型和基因型,从而深入阐明该病的临床表型异质性和分子病理机制。方法采用多重缺口PCR技术检测常见的α珠蛋白基因缺失型突变,采用DNA序列测定检测β珠蛋白基因(HBB)中的基因突变和核苷酸变异,对154例云南省德宏地区的地中海贫血进行基因突变检测和基因型分析。结果 154例中有82例呈现α地中海贫血表型,其中71例(86.59%)检测出--SEA、-α3.7和-α4.2三种常见α地中海贫血基因突变,构成5种基因型,-α3.7突变等位基因所占比例最高。有72例为β地中海贫血表型,其中68例(94.44%)检测出-28、CD17、CD26(HbE)、CD41-42、CD71-72、IVS-1-5、IVS-II-654共7种β地中海贫血基因突变,在患者中构成9种β突变基因型;HbE突变等位基因最为多见并与其他β地中海贫血突变形成HbE/β0地中海贫血基因型。在20例β地中海贫血患者中检测到α地中海贫血基因突变,构成10种αβ地中海贫血基因型。在β地中海贫血中还检测到rs713040、rs10768683和rs1609812共3个HBB基因内的SNP位点。结论云南德宏地区的地中海贫血具有明显的遗传异质性,不同基因突变类型的共存和相互作用可能是影响临床表现的主要因素,高的-α3.7和HbE突变等位基因频率是该地区地中海贫血基因型分布的显著特点。     

三种常见CD36基因突变体标准质粒的构建

目的构建3种常见的CD36基因突变质粒,为建立高分辨率熔解曲线方法提供突变标准品。方法选取广州人群常见的CD36基因突变位点A1237C、C268T及329-330delAC作为研究位点,采用重叠延伸PCR方法及TA克隆技术构建含有上述突变位点的野生型和突变型质粒,并且对其进行测序验证。结果 DNA测序结果证实构建的3种重组质粒分别含有CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变。结论成功构建CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变体标准质粒,为后续建立高分辨率熔解曲线方法筛查CD36基因多态性奠定物质基础。     

单细胞二重巢式PCR诊断β地中海贫血

【目的】探讨单细胞水平诊断β地中海贫血(β-thalassemia)的可靠性,为开展β地中海贫血的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)打下基础。【方法】采用二重巢式PCR并结合扩增特异的突变系统检测技术(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)扩增含有CD41-42突变位点的β地中海贫血患者的单淋巴细胞及正常人单淋巴细胞和单卵裂球的β-珠蛋白基因的5个常见突变位点(CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、CD71-72和nt.-28位点),扩增产物经过2%的琼脂糖凝胶电泳检测。【结果】患者的88个单淋巴细胞的扩增成功率为95.5%,等位基因脱扣的发生率为4.8%,诊断准确率为95.2%;正常人的41个单淋巴细胞的扩增成功率均为95.1%,假阳性率为0;正常人的34个单卵裂球细胞的PCR扩增成功率为88.2%;35管细胞洗脱液空白对照组假阳性扩增率为0。【结论】单细胞二重巢式PCR并结合ARMS技术诊断β地中海贫血是稳定的、可靠的,适用于β地中海贫血的PGD。     

一种罕见的同义突变导致的β-地中海贫血的基因诊断和表型分析

目的:对血常规和血红蛋白电泳筛查结果提示疑为β-地中海贫血携带者的孕妇及其丈夫进行β-地中海贫血基因诊断,鉴定其表型并对胎儿进行产前基因诊断。方法:采用聚合酶链式反应-反向点杂交(PCR-RDB)方法及DNA测序方法分析并鉴定孕妇及其丈夫的外周血和孕妇的羊水样本的β-珠蛋白基因突变。结果:检测到孕妇本人为常见的β-珠蛋白基因IVS-Ⅱ-654(C>T)位点杂合突变,其丈夫携带一种罕见β-珠蛋白基因CD29(c.90C>T)位点杂合突变,产前基因诊断出胎儿基因型为βIVS-Ⅱ-654/βCD29。结论:本研究在中国人群中确切基因鉴定出β-珠蛋白基因CD29(c.90 C>T)突变,此突变类型虽为同义突变但其携带者表现为β+-地中海贫血表型。考虑遗传风险应对此类同义突变给予重视,尤其对指导遗传咨询和产前基因诊断有重要意义。     

反义核酸抑制PCR荧光检测乙型肝炎病毒S基因145位密码子变异株及其临床应用

目的 建立一种反义核酸抑制PCR荧光检测方法,对临床标本乙型肝炎病毒(HBV)S基因G145R/A变异株进行检测.方法 依据HBV S基因587和588位核苷酸变异设计PCR DNA扩增引物,并增加一条反义野生型引物.使其遇到野生型(不含G145R/A基因变异)核苷酸序列时不能扩增,PCR扩增被抑制,而遇到突变型核苷酸序列时能扩增,并以荧光显示G145R/A突变.结果 使用突变型DNA引物进行PCR DNA扩增,对质粒DNA和HBV临床标本进行检测,检出G145R/A突变标本12份,对此12份标本采用ELISA法检测HBsAg和HBsAb,结果均为阳性.结论 该方法简便、准确,可用于临床筛查G145R/A变异株检测.     

罕见β地中海贫血基因-86(C＞G)突变家系的分子诊断

β-地中海贫血(简称β-地贫)是世界上最常见的单基因遗传病之一,全球约有1.8亿人携带此类基因[1-3],在我国南方广西和广东地区人群中携带率高达6.43％和2.54％[4-5].β-地贫是由于β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白链合成减少或缺如所引起的溶血性贫血,是一种严重致死致残性疾病,通过人群筛查和遗传咨询,对高风险胎儿进行产前基因诊断以防止重型患儿的出生,是当前国际上公认的首选措施[6-7].迄今世界上已发现200余种β珠蛋白基因突变,我国南方人群中,CD41/42、IVS-Ⅱ-654、TATAbox-28、CD71/72、CD17、CD26(βE)、CD31、CD27/28、IVS-Ⅰ-1、CD43、TATAbox-32、TATAbox-29、TATAbox-30、CD14-15、Cap+ 40/43、Int起始密码子突变(ATG-AGG)和IVS-Ⅰ-5这17种突变约占β-地贫突变构成比的99％[3],但仍有1％左右的罕见或未知突变,须作进一步分析以明确突变性质.本研究发现1种中国人群中罕见β-地贫-86 (C＞G)beta+基因突变.     

遂宁地区珠蛋白生成障碍性贫血基因检测结果分析

目的了解遂宁地区珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血)的基因类型及其构成比例。方法选取遂宁市中心医院2014年1月1日至2015年7月31日门诊就诊的小细胞贫血患者、孕产妇、婚检人群及住院患者中疑似地中海贫血患者或基因携带者417例,采集静脉血3mL,注入含乙二胺四乙酸二钾真空抗凝管内,采用跨越断裂点聚合酶链反应(PCR)检测α-地中海贫血-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα3种常见α珠蛋白基因缺失型。采用PCR结合反向斑点杂交法检测β-地中海贫血基因17个常见突变位点。结果 417例中87例(20.86%)地中海贫血基因阳性,其中α-地中海贫血32例,β-地中海贫血55例,α复合β-地中海贫血8例,阳性率分别为7.67%(32/417)、13.19%(55/417)、1.92%(8/417)。α-地中海贫血32例中,-α3.7/αα型缺失11例,-α4.2/αα型缺失1例,--SEA/αα型缺失20例,构成比分别为34.38%(11/32)、3.12%(1/32)、62.50%(20/32)。β-地中海贫血55例中发现有8种基因突变型,分别为CD41-42位点突变20例,CD17位点突变18例,IVS-II-654位点突变8例,BE位点突变3例,CD71-72位点突变3例,CD43位点突变1例,-28位点突变1例,CD27/28位点突变1例,构成比分别为36.36%(20/55)、32.73%(18/55)、14.55%(8/55)、5.45%(3/55)、5.45%(3/55)、1.82%(1/55)、1.82%(1/55)、1.82%(1/55)。结论四川遂宁地区是地中海贫血患者中α-地中海贫血基因以SEA缺失最为常见,β-地中海贫血基因以CD41-42位点突变最为常见,CD17位点突变仅次之。遂宁地区是地中海贫血高发区域之一,孕前夫妇及孕妇进行地中海贫血基因检测,对预防中、重型地中海贫血儿出生及提高人口素质具有重要作用。     

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在新生儿β-地中海贫血筛查中的应用

目的建立基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术的β-地中海贫血(β-地贫)基因突变检测方法,探讨其在新生儿β-地贫筛查中的临床价值。方法收集新生儿脐血DNA样本515例,针对中国人群中常见的10种β-地贫基因突变类型,分别设计一套PCR引物和延伸反应引物。待测样本经PCR和延伸反应后,所得产物用Sequenom Mass Array飞行时间质谱仪进行检测,根据质谱图中的峰值确定每份样本的基因型,并用反向点杂交进行验证。结果 515份样本10个突变位点的总判读成功率为99.55%,检测结果与反向点杂交结果完全一致;共检出β-地贫14例,均为突变杂合子,阳性检出率为2.72%;其中,基因型CD41-42/N 6例,CD17/N 5例,IVS-Ⅱ-654/N 2例,CD71-72/N 1例。结论 MALDI-TOF MS技术准确性高,检测时间短,通量高,适用于新生儿β-地贫筛查。     

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的：利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。 方法：实验于2005—03／06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA，设计、合成两对引物，将突变位点设计在引物内，突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点，采用聚合酶链式反应定点突变技术，应用高保真TaqDNA聚合酶，通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增，将第13外显子碱基8831A置换为G，对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。 结果：获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体，经酶切鉴定和测序分析，除引入突变点产生预期A8831→G突变外，其余碱基序列无改变。 结论：采用聚合酶链反应体外定点突变技术，成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体，为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。     

连接酶检测反应法检测乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药突变的可行性

目的探讨依据寡核苷酸等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)扩增及连接酶检测反应(LDR)方法检测乙型肝炎病毒(HBV)4种核苷(酸)类似物耐药突变的可行性。方法以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,针对拉米夫啶、替比夫啶、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读。应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,同时采用荧光PCR、焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性。结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBV DNA>106copy/mL患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致;LDR法与荧光PCR法检测结果一致率达83.3%(10/12)。结论血清HBV DNA>106 copy/mL时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗。     

等位基因特异-荧光定量PCR检测胱硫醚-β-合成酶基因T833C/G919A点突变及其与糖尿病肾病的关联性初步观察

目的建立胱硫醚-β-合成酶（CBS）基因T833C、G919A点突变的等位基因特异-荧光定量PCR（TaqMan—ARMS）测定方法，探讨2型糖尿病肾病患者CBS基因T833C、Gg19A点突变率及与糖尿病肾病（DN）的相互关系。方法采用PCR时引物3’端错配扩增阻滞（ARMS）原理，结合荧光定量PCR技术（TaqMan探针），制备野生和突变质粒标准品，建立野生引物和突变引物2个反应体系，根据荧光定量PCR时野生引物循环阈值（Wct）与突变引物循环阈值（Mct）的比值△ct（△ct=Wct／Mct）及扩增有无指数增长期出现，建立点突变等位基因型的判定标准，并对94例DN患者（组1）和140例尿微量白蛋白正常的非糖尿病对照者（组2）的CBS基因T833C、Gg19A点突变进行检测。结果建立的TaqMan-ARMS方法检测T833C野生等位基因型的判定标准为Act〈0．72或Met〉40，杂合突变型为0．9〈Act〈1．10，纯合突变型为1．40〈Act或Wet〉40；G919A野生等位基因型判定标准为Act〈0．74或Mct〉40，杂合突变型为0．92〈Act〈1．03，纯合突变型为1．26〈Act或Wet〉40。T833C点突变TY、TC、CC3种基因型在DN组分布频率分别为98．94％、1．06％和0，组2中分别是99．29％、0．71％和0；两组人群833C等位基因频率分别为0．53％和0．36％，基因型和等位基因频率差异均无统计学意义。各组中未发现G919A等位基因杂合突变和纯合突变型。结论成功建立了测定CBS基因T833C、G919A点突变的TaqMan—ARMS方法，该方法准确、特异，适合高通量点突变的检测。本研究未观察到CBS基因T833C、G919A点突变为DN的遗传危险因素。