稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株的构建及鉴定

目的 构建及鉴定稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株.方法 利用RNA干扰技术提取pEGFP-TGF-β1质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒转染到大鼠心肌细胞H9c2细胞株,利用G418筛选转染的H9c2细胞,通过RT-PCR和Western blot技术对转染后的H9c2细胞进行鉴定,本实验将转染了pEGFP-TGF-β1质粒和pEGFP对照质粒的细胞株分为pEGFP-TGF-β1质粒组和pEGFP对照质粒组.结果 pEGFP-TGF-β1质粒测序结果包含TGF-β1序列,筛选后的pEGFP-TGF-β1质粒组和pEGFP对照质粒组细胞转染效率分别为85%和93%.RT-PCR结果显示,pEGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1 mRNA相对表达量为(2.563±0.198),与对照组(1.037±0.022)比较差异具有统计学意义(t=3.056,P=0.028);Western blot结果显示,pEGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1蛋白相对表达量为(3.275±0.234),显著高于对照组的(1.011±0.015),差异具有统计学意义(t=4.372,P=0.015).结论 本研究所构建的大鼠心肌细胞H9c2细胞株能稳定高表达TGF-β1,可用于后续TGF-β1在大鼠心肌细胞的生物学作用及相关信号通路的研究.     

靶向核仁素RNA干扰载体的构建与筛选

目的:设计靶向大鼠核仁素的RNAi序列,构建6个RNAi真核表达载体,采用转染工具细胞筛选有效靶点.方法:根据GenBank中的核仁素序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至pGCsilencerTMU6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,将重组质粒用脂质体转染技术导入H9C2细胞,荧光显微镜检测GFP表达以判断转染效率,Western-blot检测靶细胞中核仁素蛋白水平的表达,筛选有效干扰序列.结果:经测序鉴定,克隆的RNAi打靶序列完全正确,无碱基突变.转染H9C2细胞36 h后,荧光显微镜下可检测到GFP标记的核仁素蛋白的表达,转染效率达75%以上.Western-blot结果显示3号核仁素干扰质粒(Ncl-3)能明显下调H9C2细胞的核仁素表达.结论:成功构建靶向核仁素RNA干扰载体,并筛选出效能最优序列,为进一步相关研究奠定基础.     

WDR5真核表达载体的构建及其在LNCaP细胞中的稳定表达

目的 构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体, 建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法PCR扩增WDR5基因, 将WDR5插入pCI-neo载体中, 酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞, Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的m RNA表达水平.结果 经酶切及测序证实真核表达载体pCI-neo-WDR5构建正确.重组质粒转染到LNCaP细胞后, 用G418筛选获得稳定表达的细胞株, Real Time-PCR方法检测到WDR5基因在转录水平的表达.结论 PCI-neo-WDR5成功转染LNCaP细胞株中并稳定表达, 为下一步WDR5的深入研究及应用奠定了基础.     

TMEFF2基因对SH-SY5Y细胞增殖的影响

目的探讨TMEFF2基因过表达对体外培养SH-SY5Y细胞增殖的影响。方法克隆全长的TMEFF2基因,连接入pEGFP-N2载体。以脂质体包裹重组质粒转染SH-SY5Y细胞。在细胞中可表达生成TMEFF2-EGFP融合蛋白。经G418筛选,建立TMEFF2过表达细胞株,同时筛选作为对照的pEGFP-N2稳定转染细胞株。MTT法测定TMEFF2过表达细胞株和pEGFP-N2稳定转染细胞株以及SH-SY5Y细胞增殖。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-TMEFF2,并筛选得到稳定表达细胞株。在细胞接种密度较高时,TMEFF2过表达细胞株的增殖较pEGFP-N2稳定转染细胞株以及SH-SY5Y细胞株均明显降低。结论TMEFF2基因可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖,且抑制作用具有明显密度依赖性。     

mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达

目的:构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法:利用PCR方法扩增mGITRL基因,克隆至pIRES2-eGFP载体,选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞,通过G418筛选,获得稳定表达细胞株。结果:构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外转染Lewis细胞,经G418筛选,体外传代30代以上,RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL。结论:成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,并在小鼠Lewis细胞中稳定表达,为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。     

细胞膜上稳定表达融合蛋白CRT/vGPCR A549细胞株的建立

目的 将人钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因与病毒G蛋白偶联受体(virus G-protein couple receptor,vGPCR)基因进行基因重组,用此重组基因建立细胞膜上稳定高表达CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549细胞株.方法 从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vGPCR基因片段并与CRT全长编码序列的3′端连接形成融合基因,然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.用此质粒转染人A549肺癌细胞,通过G418筛选建立稳定转染的A549细胞株,用RT-PCR检测重组融合基因的表达,用细胞免疫荧光分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位.结果 成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR,经DNA序列测定证实融合基因两阅读框(ORF)对接无误.将上述质粒转染A549细胞后,建立了稳定转染CRT/vGPCR的A549细胞株,融合基因在A549细胞中表达并定位到细胞膜上.结论 通过与CRT基因融合重组,具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上.     

补阳还五汤对曲妥珠单抗干预后的心肌细胞H9C2的调控作用

【目的】观察补阳还五汤对曲妥珠单抗导致的心肌细胞H9C2活性抑制及SHP-1活性的影响,通过转染SHP-1和SHPC/S-1质粒后观察补阳还五汤的干预效果,从而探讨其调控机制。【方法】构建真核表达载体pcDNA3．1（+）-SHP-1和pcDNA3．1（+）-SHPC/S-1,利用脂质体转染法转染大鼠心肌H9C2细胞,经G418筛选阳性克隆,阳性克隆细胞在曲妥株单抗中维持生长。采用定量RT-PCR法检测SHP-1基因及SHPC/S-1基因在大鼠心肌H9C2细胞中的稳定表达情况,采用磷酸酶活性分析补阳还五汤对心肌细胞中SHP-1的调控作用,并通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法进一步观察加入补阳还五汤后细胞的凋亡情况。【结果】测序证明真核表达载体构建成功,并且可以在曲妥珠单抗干预下的心肌细胞H9C2中稳定表达,磷酸酶活性检测证实磷酸酶活性最高的是H9C2-SHP-1细胞组,经补阳还五汤干预后活性显著下降（P<0．05）; MTT法观察进一步证实加入补阳还五汤后的H9C2-SHP-1细胞的凋亡率较未加补阳还五汤组的细胞显著降低(P<0．05)。【结论】补阳还五汤可以改善曲妥珠单抗对心肌细胞的抑制作用,并可影响心肌细胞中SHP-1基因的表达,为以后进一步探讨曲妥珠单抗所致的心脏毒性的治疗打下基础。     

CDK2干扰RNA对人肝癌细胞HepG_2细胞周期和增殖的影响

目的:探讨CDK2 siRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞CDK2 mRNA表达及其对HepG2细胞周期和增殖的影响.方法:利用脂质体转染法将特异性的携带绿色荧光蛋白的CDK2干扰RNA的重组质粒PGenesil-1-CDK2导入HepG2细胞,同时设立阴性对照空载体转染组PGenesil-1-HK.G418筛选稳定表达细胞株扩增培养.并用倒置荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术(FCM),分别检测转染后的HepG2细胞CDK2 mRNA和细胞周期的变化,噻唑蓝(MTT)法检测癌细胞生长增殖率.结果:经1mo的G418筛选得到稳定表达细胞株,与阴性对照组及空白对照组相比,转染组CDK2 mRNA 水平明显下降,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生阻滞.结论:RNA干扰技术可明显抑制CDK2基因的表达,引起 HepG2细胞周期阻滞及肿瘤细胞生长抑制作用,为CDK2介导的肿瘤基因沉默疗法提供实验依据.     

磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基p55PIK表达载体的构建及单克隆株的筛选

目的 构建表达载体pEGFP-N1-p55PIK,在人胚胎肾细胞株HEK293中筛选其稳定表达的细胞株.方法 PCR扩增p55PIK基因全长,经过Xho1和Xma1酶切、T4 DNA连接酶连接、DH5α转化,酶切和测序鉴定以确定构建质粒正确.转染人胚胎肾细胞株HEK293,G418筛选稳定表达p55PIK的单克隆细胞株,应用Western blot方法检测p55PIK蛋白的表达.结果 pEGFP-N1-p55PIK质粒经PCR、酶切、测序鉴定正确,经过G418筛选后获得稳定细胞株,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达,Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-p55PIK的细胞中p55PIK表达水平增高.结论 正确构建表达载体pEGFP-N1-p55PIK,并在HEK293细胞中成功筛选出稳定表达p55PIK的细胞株,为进一步探讨p55PIK的功能提供了良好的工具.     

HO-1siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株.方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系.结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞.结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础.