兔膀胱粘膜抗菌蛋白研究

作者以1％乙酸冲洗雌性新西兰白兔膀胱粘膜获得其酸溶性提取物。经AU-PAGE分析表明,膀胱粘膜酸溶性提取物有十余条主蛋白带,不含已知的内源性抗菌多肽溶菌酶和防御素。琼脂糖弥散法杀菌试验显示,膀胱粘膜酸溶性提取物对致病性大肠杆菌ML-35P耐药株具杀菌活性。电泳凝胶琼脂糖弥散法杀菌试验进一步分析表明,杀菌活性与两条主蛋白带相关,命名为Rab BP-1和Rab BP-2。它们分别占膀胱粘膜提取物蛋白质总量的2.5％和1.2％。本实验的研究结果首次提示,兔膀胱粘膜存在抗菌性蛋白,这可能是膀胱粘膜杀菌这一重要防御机理的分子基础。     

大鼠子宫内膜抗菌成分的初步分析

作者以１％乙酸冲洗ＳＤ大鼠子宫内膜，获得子宫内膜酸溶性提取物。利用琼脂糖弥散法和电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验发现，子宫内膜提取物有三条主蛋白带对致病性大肠杆菌ＭＬ－３５Ｐ耐药株有强抗菌活性，这三条抗菌蛋白带命名为ＲａｔＵＰ－１，ＲａｔＵＰ－２和ＲａｔＵＰ－３，分别占子宫内膜提取物总蛋白量的４．５％，５．７％和６．６％。虽然提取物存在溶菌的活性，但其含量甚微，在ＡＵ一ＰＡＧＥ图谱上亦未能显现溶菌酶条带。本实验的结果提示子宫内膜合成一类抗菌多肽，可能在子宫抗菌机制中发挥重要作用。     

大鼠子宫内膜抗菌成分的初步分析

作者以１％乙酸冲洗ＳＤ大鼠子宫内膜，获得子宫内膜酸溶性提取物，利用琼脂糖弥散法和电泳凝胶琼脂糠弥散法抗菌试验发现，子宫内膜提取物有三条主蛋白带对致病性大肠杆菌ＭＬ３５Ｐ耐药株有强抗菌活性。本实验的结果提示子宫内膜合成一类抗菌多肽，可能在子宫抗菌机制中发挥重要作用。     

人子宫颈粘液抗菌多肽的分离

用５％乙酸提取人子宫颈粘液可溶物，经电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验发现，子宫颈粘液酸溶性提取物有两条主带对致病性大肠杆菌２５９２２株和金葡球菌２５９２３株有强抗菌活性，并分别命名为Ｈｃｐ－１和Ｈｃｐ－２。经Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，Ｈｃｐ－１分子量为６．７ｋｄ、１０ｋｄ和１５．４ｋｄ，Ｈｃｐ－２分子量为４．４ｋｄ、６．７ｋｄ、９ｋｄ和１５．４ｋｄ，均为多肽混合物。实验结果提示子宫颈粘膜能合成一类抗菌多肽，在子宫颈抗菌机理中发挥重要作用。     

子宫内膜黏液抗菌肽的分离纯化及鉴定

目的从人子宫内膜黏液酸溶性提取物纯化及鉴定抗菌多肽,探讨子宫内膜的抗菌机制。方法采用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖弥散法分析人子宫内膜黏液酸溶性提取物的抗菌活性,切下相应的抗菌条带进行洗脱电泳,并用反相高效液相色谱进一步分离纯化。用琼脂糖弥散法检测纯化分子抗菌活性;Trieine-SDS-PAGE电泳检测其相对分子质量。根据N端氨基酸序列和质谱分析的测序结果推导纯化分子的氨基酸序列,并进行生物信息学分析。结果从人子宫内膜酸溶性提取物中纯化出一种相对分子质量为6777的抗菌肽HUP-39,经鉴定为人血红蛋白α链N端第33-95的氨基酸残基片段。该片段富含碱性氨基酸,包含3个完整的α螺旋跨膜结构域,对大肠埃希菌氨苄西林耐药株ML-35p、标准株ATCC25922和临床分离株54080有较强的抑菌活性。结论本研究从人子宫内膜黏液酸溶性提取物中分离纯化出的抗革兰阴性菌多肽,为人血红蛋白α链片段。子宫内膜黏液中的抗菌分子不仅来源于上皮细胞和白细胞,也可来源于红细胞。     

人子宫颈粘液抗菌活性多肽的分离纯化

目的　从人子宫颈粘液分离纯化新的抗菌多肽。方法　用 5 %乙酸提取人子宫颈粘液可溶物 ,经电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验发现 ,子宫颈粘液酸溶性提取物有一条主带对大肠杆菌耐氨苄株 ML - 35 P有强抗菌活性 ,命名为 HCP。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及洗脱电泳技术得到构成该主带的混合物 ,最后应用反相高效液相色谱技术分离纯化多肽。经 Tricine- SDS- PAGE鉴定其相对分子质量 ,并运用琼脂糖弥散法鉴定其抗菌活性。结果　从子宫颈粘液酸溶性提取物中纯化出一多肽 ,相对分子质量约为 14× 10 3,命名为 HCP- 1,具有抗耐药性大肠杆菌和绿脓杆菌的活性。结论　 HCP- 1可能是宫颈粘液天然免疫机制中的新的效应分子     

人大颗粒淋巴细胞抗生素肽的部分纯化

为探讨人大颗粒淋巴细胞抗菌分子的抗菌活性，采用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳对人大颗粒淋巴细胞胞浆颗粒酸溶性提取物的抗菌组分ＨＬＰ１、ＨＬＰ２、ＨＬＰ３进行分离纯化。结果：ＴｒｉｃｉｎｅＳＤＳＰＡＧＥ分析显示，ＨＬＰ１、ＨＬＰ２均为多肽混合物，其分子量范围分别是５６～１３ｋｄ和５６～８８ｋｄ；ＨＬＰ３为一７ｋｄ的单一多肽。琼脂糖弥散法和电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验显示，ＨＬＰ１、ＨＬＰ２、ＨＬＰ３对致病性大肠杆菌ＭＬ３５Ｐ氨苄青霉素耐药株、金葡球菌ＡＴＣＣ２５９２３株、绿脓杆菌ＡＴＣＣ２７８５３株均有很强的杀菌作用。提示人大颗粒淋巴细胞存在的小分子抗菌多肽可能在人天然免疫的抗感染防御机制中发挥了重要作用     

人大颗粒淋巴细胞抗生素肽的部分纯化

为探讨人大颗粒淋巴细胞抗菌分子的抗菌活性，采用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳对人大颗粒淋巴细胞浆颗粒酸溶性提取物的抗菌组分ＨＬＰ－１，ＨＬＰ－２，ＨＬＰ－３进行分离纯化。结果：Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，ＨＬＰ－２，ＨＬＰ－２均多肽混合物，其分子量范围分别是５．６－１３ｋｄ和５．６－８．８ＫＤ；ｈｌｐ－３Ｏ －７ｋｄ的单一多肽。     

Bcl—2和P16在膀胱癌的表达与预后的关系

目的 探讨ｂｃｌ－２和Ｐ１６基因蛋白膀胱癌的表达及其临床,病理意义与预后的关系,方法 采用免疫组化技术ＳＡＢ法对５１例膀胱癌组织和５例正常膀胱粘膜行原癌基因ｂｃｌ－２和抑癌基因Ｐ１６表达的检测。结果：ｂｃｌ－２在膀胱癌的阳性表达率为８２．４％（４２／５１）,在预后中生存组和死亡组之间比较有显著性差异（Ｐ〈０．０５）,Ｐ１６在膀胱癌的阳性表达率为５１．０％（２６／５１）,５例正常膀胱粘膜均阳性,两者     

人脑髓鞘碱性蛋白基因cDNA在大肠杆菌中表达的初步研究

将ＢａｍＨⅠ酶切的人脑髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）基因ｃＤＮＡ克隆片段和表达载体ｐＧＥＸ－５Ｔ重组后转化大肠杆菌，再筛选、增殖和ＩＰＴＧ诱导。结果显示：阳性克隆１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ有２条特异区带（４９ｋｄ和３５ｋｄ）；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交证实该区带具ＭＢＰ抗原特异性；蛋白质含量测定、免疫斑点杂交和ＥＬＩＳＡ分析，该膜蛋白表达量占菌体裂解液蛋白质总量６％（５０ｍｇ／Ｌ菌液）。     

人子宫颈黏液抗菌多肽的分离和鉴定

目的　从人的子宫颈黏液分离和鉴定新抗菌多肽,探讨子宫颈黏液抗菌机制。方法　用5%乙酸提取人子宫颈黏液可溶物,应用电泳凝胶抗菌蛋白分析法分析其抗菌蛋白,制备酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳及反相高效液相色谱分离纯化抗菌多肽。凝胶琼脂糖弥散法抗菌检测抗菌活性。纯化的抗菌多肽进行氮端氨基酸序列测定,根据其序列设计简并引物,利用简并聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA。通过BLAST硷基比对程序分析比较与已知蛋白的同源性。进一步应用常规基因重组技术构建其原核表达质和制备重组多肽。采用最小抑菌浓度和最小杀菌浓度检测重组多肽的抗菌效能。结果　从子宫颈黏液中分离纯化到一个具抗菌活性的多肽,通过蛋白测序、简并PCR及BLAST等方法鉴定该蛋白为HMGN2高游动性蛋白。制备获得重组HMGN2多肽,重组HMGN2抗大肠杆菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度分别为10 .42μg/ml±3. 13μg/ml和27. 78μg/ml±8 .33μg/ml,与人中性粒细胞防御素相当;最小杀菌浓度分别为20 .83μg/ml±6 .25μg/ml和55 .56μg/ml±16 .67μg/ml。结论　除已知的抗菌肽外,HMGN2亦可能是宫颈黏液含有的抗感染效应分子之一。     

人子宫颈粘液抗菌多肽的分离

The acid-soluble extract of human cervical mucus was obtained by solving mucus with 5% acetic acid in the presence of protease inhibitor. The antibacterial activity of the acid-soluble extract was analyzed by gel overlay technique. The result showed that two protein bands which were designated human cervical protein-1 (Hcp-1), human cervical protein-2(Hcp-2) were potently antibacterial against E. coli 25922 and S. aureus 25923. Tricine-SDS-PAGE analysis indicated that Hcp-1, Hcp-2 actually contained three and four protein bands respectively. The molecular weights of Hcp-1 were 6.7 kd, 10 kd, 15.4 kd; these of Hcp-2 were 4.4 kd, 6.7 kd, 9 kd, 15.4 kd. Our studies suggested that human cervical mucosa might secrete some currently-unknown antibacterial polypeptides which play an important role in the cervical defense against infection.     

DEFENSE MECHANISMS OF URINARY BLADDER:STUDIES ON ANTIMICROBIAL POLYPEPTIDES FROM BLADDER MUCOSA

The acid-soluble extract of the bladder mucosal surface was obtained by washing out the bladder with dilute acetic acid in the presence of protease inhLbitors. The wash-out materials from rats, rabbits, pigs,and humans manifested strong bactericidal activity agaLnst E. co/i in vitro. The uhrafLltrate of the human material, which comtained two major peptides with apparent molecular masses of 6. 7 kD and 8. 5 kD, respectively, showed potent bacteticidal activity against E. colt, Psetzdomonas aeruginosa, Staphylococcus aureua, and Streptococcus sanguis. Three antibacterial polypeptides (PiBPs) were purified from the porcine material. The molecular masses of PiBP 5. PiBP 11 and PLBP-25 were 5773.3 Da, 11127.8 Da and 25073 Da, respectively. PLBP-5 was unusually rich in glycine, serine and threonine residues(20. 0, 16. 3 and 10. 4 mol%, respectively), and N-terminal amino acid sequencLng revealed that PiBP-5 was homologous (83. 3% identity in an 18 residue overlay) to the “tail“ of human cytokeratin-7. Although the amino acid compositions of PiBP-11 and PiBP-25 were established, both had blocked N termini and primary sequence data were not obtained. These results provided evidence indicating that the presence of peptides !n the bladder mucosa could enable it to kill adherent bacteria.     

GST-颗粒溶解素融合蛋白的纯化及其抗菌活性分析

目的: 纯化大肠埃希菌表达的GST-颗粒溶解素融合蛋白,并分析其体外抗菌活性。方法: 将IPTG诱导处理后的细菌破碎,分离含有可溶性GST-颗粒溶解素融合蛋白的细菌裂解液,并通过GSH-琼脂糖珠亲和层析柱纯化。同时采用MTT法分析该纯化蛋白的抗菌活性。结果: GST-颗粒溶解素融合蛋白能以可溶性形式在大肠埃希菌中表达,采用亲和层析法可获得分子量为44kDa的单一蛋白条带。经抗菌活性分析,表明纯化产物对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌具有显著抑制作用,而对伤寒沙门菌和大肠埃希菌BL21的抗菌活性不明显。结论: 成功纯化GST-颗粒溶解素融合蛋白,该蛋白对革兰阳性菌具有高效抗菌活性。