磷脂酰乙醇胺结合蛋白与阿片依赖关系的研究

目的：磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）是海马胆碱能神经刺激肽（HCNP）的前体蛋白，参与多种信号转导过程。本课题组前期蛋白质组研究发现PEBP在吗啡依赖大鼠不同脑区具有差异表达。因此，本研究目的为观察该蛋白是否在阿片依赖过程中发挥作用并探讨其可能机制。方法；采用蛋白免疫印迹实验验证PEBP蛋白在吗啡依赖大鼠不同脑区的差异表达。建立大鼠吗啡依赖与自然戒断模型，     

CCK-8及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠额叶皮质、尾壳核、海马μ阿片受体的影响

目的通过观察CCK-8及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠额叶皮质、尾壳核、海马μ阿片受体的影响,初步探讨CCK-8对吗啡戒断症状的影响及其受体机制。方法建立大鼠吗啡慢性依赖及纳络酮催促戒断模型,观察CCK-8及CCK1受体拮抗剂L-364,718、CCK2受体拮抗剂LY-288,513慢性干预对戒断症状的影响,并采用放射配基结合法测定额叶皮质、尾壳核、海马μ阿片受体的结合活性,即受体数量(Bmax)及结合力(Kd)。结果①给予吗啡前腹腔注射CCK-8及CCK受体拮抗剂慢性干预均可减轻吗啡戒断症状;②慢性吗啡作用后,额叶皮质和海马μ阿片受体数量及结合力下降,而尾壳核μ阿片受体数量无变化,仅结合力降低;戒断后,额叶皮质、尾壳核μ阿片受体数量及结合力升高,而海马μ阿片受体数量无变化,仅结合力升高;③CCK-8及其受体拮抗剂慢性干预后,使吗啡戒断大鼠尾壳核μ阿片受体结合力降低、海马μ阿片受体数量增加,但是对额叶皮质μ阿片受体的结合活性无影响。结论 CCK-8及其受体拮抗剂可通过调节μ阿片受体减轻吗啡戒断症状,并具有脑区特异性。     

吗啡诱导的大鼠条件性位置偏爱模型中关键脑区PEBP及ERK活性的变化

目的研究大鼠阿片精神依赖状态下,相关脑区磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)及ERK活性的变化。方法建立条件性位置偏爱(CPP)模型模拟吗啡精神依赖的不同阶段,观察依赖相关重要脑区在大鼠CPP形成、熄灭及重建时PEBP表达和ERK活性的变化。结果海马、前额叶皮层、纹状体、伏隔核等4个脑区,CPP各阶段均未见PEBP表达水平有明显变化;但在CPP形成时,前额叶皮层的ERK活性明显升高,而CPP重建后,海马的ERK活性明显降低。结论吗啡成瘾不同阶段,药效-环境关联性记忆的形成和唤起涉及不同神经通路,ERK活性在其中十分关键,但PEBP可能并未参与ERK活性调节。     

β-arrestin在阿片受体内吞和阿片受体介导的核信号传递中的作用

阿片受体的信号传导受到多种细胞内外因素的严格调控。β-arrestin作为一类重要的细胞浆信号负调节蛋白和支架蛋白在阿片类药物诱导的阿片受体内吞中起关键作用。我们的研究发现阿片受体存在受体磷酸化依赖和不依赖的两种受体内吞机制。β-arrestin2为受体磷酸化依赖的内吞所必需,而β-arrestin1主要参与磷酸化非依赖的阿片受体内吞过程。近期的研究发现,β-arrestin作为一类重要的脚手架蛋白,不仅可以通过其不同的亚型对阿片受体的内吞进行精确调控,还可以与特定的基因启动子结合,通过招募乙酰化酶增加局部组蛋白乙酰化水平、上调基因转录,从而通过表观遗传学修饰机制将阿片受体信号从细胞膜直接传递至细胞核。本文主要介绍这一方面研究的初步进展。     

δ阿片受体激动剂DPDPE和TIPP不同的通过转激活表皮生长因子受体激活ERK的机制研究

G蛋白偶联受体(GPCR)可通过多种信号途径激活ERK。其中通过转激活酪氨酸受体是GPCR激活ERK的重要途径之一。我们以前的研究发现阿片受体激动剂DPDPE,TIPP和吗啡能够通过不同的信号途径激活ERK。本研究探讨这些阿片受体激动剂不同的激活ERK是否与它们不同的转激活受体酪氨酸激酶有关及其转激活相关的机制。本研究发现DPDPE,TIPP和吗啡对δ阿片受体转移激活表皮生长因子受体(EGFR)的作用上存在不同的调节效应,发现TIPP和吗啡激动δ阿片受体可引起对EGFR的转移激活,而DPDPE则不能;TIPP和吗啡激动δ阿片受体引起对EGFR的转移激活过程中有PKCδ的参与;GRK磷酸化δ阿片受体的位点丝氨酸363突变可以使原本不引起转移激活的激动剂DPDPE,引起转移激活作用;并且,RNA干扰β-arrestin可以影响EGF刺激EGFR引起的磷酸化ERK信号,故β-arres-tin可能参与转移激活作用。本课题的研究对于深入探索δ阿片受体信号转导的机制有重要的意义。     

NO-cGMP信号转导系统的上调参与阿片类药物耐受和戒断的生化机制

目的　观察阿片激动剂长时程作用对NO-cGMP信号转导系统的影响。方法　选用iNOS cDNA稳定表达的NG-LNCXiNOS细胞,采用NOS活性和cGMP放免测定,Western杂交和NADPH黄递酶组化染色技术。结果阿片类药物长时程作用剂量依赖性增高胞浆相iNOS活性和胞内cGMP含量,药物作用强弱顺序是DPDPE> DADLE>吗啡,EC₅₀都在nmol.L^-1数量级。用纳洛酮急性戒断阿片耐受细胞,造成酶活性和cGMP水平增加更显著。DPDPE长时程作用还引起iNOS基因表达增强和NADPH黄递酶染色阳性细胞增多。结论　提示NO-cGMP信号转导系统上调可能是阿片耐受和成瘾的重要生化改变。     

μ阿片受体功能调节

μ阿片受体识别选择性配基的区域还有争论 ,受体的TM内氨基酸的空间取向影响选择性配基的亲和性。阿片受体活性的调节可能并没有涉及到它们将GTP和G蛋白相联系的能力 ,以及相继的异源三聚体的解离能力。激动剂诱导的 μ受体的磷酸化与受体的脱敏是否相关尚无定论。μ受体细胞内过程需要形成多蛋白复合物 ,形成受体信号复合物的细胞蛋白募集很重要。通用转录因子之间的相互作用决定受体基因的转录是很明确的。     

阿片受体与丝裂原活化蛋白激酶信号交联及其对阿片耐受与依赖的影响

中枢神经系统主要存在 μ、δ、κ阿片受体以及新发现的阿片受体样 - 1(ORL - 1)受体。阿片受体急性激活时激活Gi o蛋白 ,三磷酸鸟苷 (GTP)置换Gα结合的三磷酸鸟苷 (GDP)后 ,Gα与 βγ亚单位解离 ,它们分别作用于下游多个效应分子 ,可调节腺苷酸环化酶和磷酯酶C(PLC)的活性 ,激活K +通道 ,抑制Ca2 + 通道并增加胞内Ca2 + 浓度。阿片长期作用于机体后可产生严重的耐受和依赖 ,伴随有神经系统细胞和分子水平的功能以及基因表达的改变[1] 。1996年LiLY等报道了激活阿片受体可将丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen -activatedproteinkinase…     

阿片受体C-末端的功能及与其相互作用蛋白的研究进展

阿片受体C-末端氨基酸在激动剂作用后受体的磷酸化、脱敏及内吞过程中发挥了重要作用,C-末端部分缺失或不同氨基酸位点的突变对受体功能有明显影响,如μ阿片受体C-末端的Thr394、Thr383、Thr357、Ser355,δ受体C末端的Ser363和κ受体C末端的Ser369等。除了公认的参与阿片受体C-末端磷酸化的激酶,近年来,人们寻找到其他一些与C-末端相互作用的蛋白,这些相互作用蛋白对阿片受体功能有不同的影响,如PPL、FilaminA、PLD2、PKCI、GASP和EBP50/NHERF等,但不能很好的解释阿片类物质的依赖、耐受与成瘾。因此,寻找特异性与C-末端相互作用的蛋白,成为阿片成瘾机制研究的一个方向。     

阿片受体泛素化机制及其对受体功能的影响

阿片受体是一类重要的G蛋白偶联受体(GPCR),是内源性阿片肽及阿片类药物结合的靶点,阿片受体激活后对神经系统、免疫及内分泌系统具有调节作用。但阿片受体在反复激活后,容易出现耐受,导致阿片成瘾。受体的内吞和再循环对受体复敏具有重要意义。近年来研究发现,受体的泛素化修饰参与了GPCR的转运过程,并且多数配体作用于阿片受体后,受体的泛素化水平明显升高。将阿片受体的泛素化位点突变后,对不同阿片受体亚型的内吞和降解过程产生了不同的影响,进而影响了阿片受体的信号转导过程。本文着重对阿片受体3种亚型的泛素化修饰特点及泛素化对受体转运的调节作用进行综述。     

双向阿片功能调节剂：胍丁胺

近年研究表明某些药物尽管不能与阿片受体发生相互作用，但能对阿片药理作用产生重要的调节．特别是有些药物能对阿片功能产生双向调节作用，即增强阿片镇痛，对抗阿片耐受和躯体依赖．我们将这些不与阿片受体发生作用，但具有双向调节阿片功能的药物称之为双向阿片功能调节剂(biphasic opioid function modulator，BOFM)．基于我们的研究工作，可以认定胍丁胺就是一个典型的双向阿片功能调节剂．胍丁胺本身有弱的镇痛作用，它能增强吗啡镇痛，对抗吗啡耐受和依赖：胍丁胺产生上述作用的主要机制与抑制阿片长期作用下在阿片受体信号转导系统产生的代偿性适应过程相关．     

抗阿片成瘾药物研究历史与现状

阿片成瘾是一种慢性复发性脑疾病,临床症状包括躯体依赖、稽延症状、精神依赖和复吸, 治疗的关键是防复吸。防复吸药物的研究包括以阿片受体和非阿片受体为靶标的药物。代表性药物分别为阿片受体激动剂美沙酮和受体阻断剂纳屈酮,新型阿片受体配体噻吩诺啡能够完全阻断吗啡等阿片类药物引起的躯体和精神依赖,防止阿片复吸。研究表明,参与调节阿片精神依赖和复吸的非阿片受体作用系统包括多巴胺受体、兴奋性氨基酸受体、γ-氨基丁酸受体、乙酰胆碱受体、5-HT受体、CB1受体和神经营养因子受体等。多巴胺D3受体阻断剂Y-QA14自身无致成瘾性,同时具有抗可卡因和海洛因成瘾及防复吸的作用。咪唑啉Ⅰ型受体激动剂胍丁胺具有抗阿片躯体和精神依赖、缓解稽延症状和防复吸的作用,机制与激活咪唑啉Ⅰ型受体后减轻阿片受体、多巴胺系统和谷氨酸系统的代偿性适应用关。本文将就阿片、阿片成瘾生物学基础、防阿片复吸药物研发展、作用机制、历史、现状和发展趋势加以综述。     

胍丁胺调节阿片功能的分子和神经生物学机制

胍丁胺是一种内源性生物活性物质,由左旋精氨酸在左旋精氨酸脱羧酶作用下脱羧生成。我们的前期研究发现不管是内源性还是外源性胍丁胺都具有明确的阿片功能调节作用,表现为镇痛、增强吗啡镇痛、抑制吗啡耐受,躯体依赖和精神依赖。近年来,在这些工作的基础上,我们研究了胍丁胺调节阿片功能的分子和神经生物学机制。提出了胍丁胺调节阿片功能可能和激活咪唑啉受体有关这一假说。为了证明这一假说的客观性,本实验室首次建立了IRAS-Cho细胞稳定表达系统,通过观察IRAS的亚细胞定位、配体结合特性、生物学功能和信号转等证明了由美国科学家克隆的IRAS就是野生型I1咪唑啉受体。在此细胞模型上,我们首次证明胍丁胺调节阿片功能与激活I1咪唑啉受体相关。为了在神经元上,特别是在整体行为学实验模型上证明上述发现的存在,本实验室用RNA干涉技术在大鼠原代培养海马神经元和大鼠摇体实验模型上进一步证明胍丁胺调节阿片功能与激活I1咪唑啉受体相关。     

吗啡对μ阿片受体介导的ERK磷酸化的影响

目的：利用表达μ阿片受体的中国仓鼠卵巢细胞,研究吗啡急慢性处理下对细胞外信号调节激酶（ ERK）磷酸化的影响。方法免疫印迹检测磷酸化ERK水平,获取1 h急性处理的ERK磷酸化变化时程和36 h慢性处理以及纳洛酮催促下的ERK磷酸化变化。结果1μmol·L-1吗啡可以快速诱导ERK磷酸化水平短暂升高,5 min时达峰（ P〈0.01）,吗啡诱导的ERK磷酸化水平升高具有显著的浓度依赖性。10μmol·L-1吗啡慢性处理36 h后ERK磷酸化水平与对照组比较,差异无统计学意义,但纳洛酮急性催促5或10 min均导致ERK磷酸化显著下降（与对照比较,P〈0.01）。结论吗啡急慢性刺激下以及纳洛酮催促下ERK磷酸化表现出不同的变化形式,提示μ阿片受体介导下ERK相关的信号通路发生了代偿。     

阿片类药物对诱导型NO合酶稳定表达神经细胞受体介导AC-cAMP系统的影响

目的:利用稳定表达诱导型NO合酶的NG LNCXiNOS细胞,观察阿片类药物对受体介导AC cAMP系统的影响。方法:竞争性蛋白结合法和完整细胞受体结合实验测定cAMP含量和受体结合力。结果:阿片类药物短时程作用抑制AC活性,受阿片受体介导的、百日咳毒素敏感的G蛋白信号通路调节。阿片类药物长时程作用和纳洛酮急性戒断引起受体脱敏,呈时间和剂量依赖性,伴有受体下调。结论:成功地建立阿片耐受和依赖细胞模型,可用于研究AC cAMP系统和NO cGMP系统在阿片耐受和成瘾中的调节。     

u阿片受体功能调节

u阿片受体识别选择性配基的区域还有争论，受体的TM内氨基酸的空间取向影响选择性配基的亲和性。阿片受体活性的调节可能并没有涉及到它们将GTP和G蛋白相联系的能力，以及相继的异源三聚体的解离能力。激动剂诱导的u受体的磷酸化与受体的脱敏是否相关尚无定论。u受体细胞内过程需要形成多蛋白复合物，形成受体信号复合物的细胞蛋白募集很重要。通用转录因子之间的相互作用决定受体基因的转录是很明确的。     

NO/NOS系统与阿片系统相互作用的研究进展

一氧化氮 (NO)是与N 甲基 D 天 (门 )冬氨酸 (NM DA)受体活性相关的一种细胞内信使分子 ,在吗啡耐受和依赖中起作用。一氧化氮合酶 (NOS)抑制剂可以减弱或阻断吗啡的作用。NO/NOS系统也参与吗啡诱导的位置偏爱效应。NO/NOS系统作用与阿片受体的激活相关 ;NO/NOS系统也可能通过影响去甲肾上腺素神经元系统参与吗啡戒断症状表达。深入阐明NO/NOS系统和阿片系统之间的关系对于阿片药物镇痛治疗及阿片成瘾的戒毒治疗均具有积极的意义     

阿片类药物对诱导型NO合酶稳定表达神经细胞受体介导AC-cAMP系统的影响

目的：利用稳定表达诱导型ＮＯ合酶的ＮＧＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞,观察阿片类药物对受体介导ＡＣｃＡＭＰ系统的影响。方法：竞争性蛋白结合法和完整细胞受体结合实验测定ｃＡＭＰ含量和受体结合力。结果：阿片类药物短时程作用抑制ＡＣ活性,受阿片受体介导的、百日咳毒素敏感的Ｇ蛋白信号通路调节。阿片类药物长时程作用和纳洛酮急性戒断引起受体脱敏,呈时间和剂量依赖性,伴有受体下调。结论：成功地建立阿片耐受和依赖细胞模型,可用于研究ＡＣｃＡＭＰ系统和ＮＯｃＧＭＰ系统在阿片耐受和成瘾中的调节。     

阿片类药物对海马神经递质释放调控的分子机制

阿片类药物的滥用,可导致脑内神经元的长时程适应,从而产生严重的身体依赖和心理依赖。越来越多的证据表明,阿片类药物所引起的这种适应性变化会影响突触前神经递质的释放,并改变包括谷氨酸能神经系统在内的神经元的功能。我们的研究表明,在海马这个富含谷氨酸能神经元的脑区,阿片类药物如吗啡的长期使用,会引起胞外谷氨酸水平的持续改变。进一步的研究表明,该脑区的SNARE蛋白复合物发生了适应性的改变。SNARE蛋白家族是重要的调节神经可塑性的调节分子,在神经递质释放过程中起重要作用。在吗啡长期处理过程中,SNAP-25的色氨酸187位点的磷酸化明显下降,SNARE复合物的形成受到抑制。我们的结果揭示了阿片类药物可通过调控突触前直接参与递质释放的分子来影响递质本身释放这一分子机制。     

咪唑啉受体及其对阿片药理作用的调节机制

用稳定转染咪唑啉1型受体(I1R)的细胞(CHO-I1),对I1R信号转导途径进行了初步研究。首次直接证实I1R的信号转导途径与活化PC-PLC继而产生DAG,其后引起丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)酶促级联反应过程有关。采用共同稳定表达μ阿片受体(MOR)和I1R的CHO细胞表达系统(CHO-μ/I1细胞),对I1R在受体后水平抑制吗啡依赖的可能分子机制进行了研究。首次提供了胍丁胺通过作用于I1R而抑制吗啡依赖的直接实验证据,其分子机制可能主要是胍丁胺激活I1R抑制吗啡慢性处理时cAMP通路和Ca2+信号通路代偿性适应而抑制吗啡依赖的形成。