细胞外α-突触核蛋白对MES23.5多巴胺能神经细胞的促增殖作用

目的研究细胞外α-突触核蛋白(-αsynuclein,-αSyn)对MES23.5多巴胺能神经细胞增殖的影响。方法细胞外施加重组人-αsyn,Western blot分析和免疫细胞化学染色观察-αSyn向细胞内的进入和分布,MTT测试神经细胞的增殖。结果Western blot和免疫细胞化学染色结果均显示,细胞外-αSyn可以进入MES23.5多巴胺神经细胞并促进其增殖,这种促进作用随剂量增加而增强。-αSyn单抗明显抑制-αSyn向细胞内转移,并阻断-αSyn促细胞增殖作用。结论细胞外-αSyn对多巴胺能神经细胞的增殖具有促进作用。     

α-突触核蛋白促进MES23.5细胞突起生长

目的研究人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)对MES23.5多巴胺能神经细胞突起生长的作用。方法 MES23.5细胞外添加α-syn蛋白,测定不同时间细胞突起的长度;免疫荧光双重标记法观察α-syn与β-微管蛋白之间的相互关系;ELISA方法检测细胞内β-微管蛋白含量。结果α-Syn处理组神经元突起的平均长度及β-微管蛋白的含量在培养1、4和24 h时均明显大于对照组;α-Syn的这一作用可被微管蛋白抑制剂秋水仙碱阻断;α-Syn与β-微管蛋白在细胞内共存。结论α-Syn具有促进MES23.5多巴胺能神经细胞突起生长的作用,该作用很可能通过影响微管蛋白的合成及微管的组装来完成。     

α-突触核蛋白对N-甲基-D-天门冬氨酸所致细胞毒性作用的影响

目的研究α-突触核蛋白(α-Syn)对N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)引起的多巴胺能神经细胞毒性作用的影响。方法在MES23.5多巴胺能神经细胞建立NMDA细胞毒模型,MTS法检测细胞活力,AO/PI荧光标记以及免疫印记测定caspase-3表达检测细胞凋亡,细胞外添加α-Syn蛋白,观察α-Syn对NMDA所致细胞毒性作用的影响。结果 NMDA(5mmol/L)引起明显的细胞内Ca2+升高以及细胞毒性作用,表现为细胞活力下降、凋亡细胞增加以及caspase-3表达升高。NMDA的细胞毒性作用可被NMDA受体特异性阻断剂MK801阻断。预先用α-Syn(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)处理细胞明显抑制NMDA引起的细胞内Ca2+升高以及细胞毒性作用,其作用随α-Syn浓度增高而增强。结论α-Syn对NMDA所致多巴胺能神经元的细胞毒性作用具有抑制作用,其机制可能与其抑制与NMDA引起的Ca2+内流以及caspase-3激活有关。     

α-突触核蛋白促进多巴胺能神经细胞表面NMDA受体的内在化

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)对多巴胺能神经细胞表面N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体的影响及其机制。方法免疫荧光标记法和Western blotting分析法测定NMDA受体(NMDAR)和Rab5b含量。低钾休克抑制内吞,Rab5b反义寡核苷酸抑制Rab5b基因表达。以MES23.5多巴胺能神经细胞为模型,观察细胞外添加α-Syn蛋白对细胞膜NMDAR含量的影响以及内吞和Rab5b的作用。结果α-Syn(10μmol/L)明显上调Rab5b表达,下调细胞表面NMDAR;低钾休克及抑制Rab5b表达可消除α-Syn的这一作用。结论α-Syn通过上调Rab5b的表达促进NMDAR的内在化。     

抑制葡糖脑苷脂酶对多巴胺神经细胞内α-突触核蛋白寡聚体形成及细胞自噬功能的影响

目的 研究抑制葡糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GBA）活性对多巴胺神经细胞内α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成及自噬功能的影响.方法 在培养MES23.5细胞外添加不同浓度的GBA活性抑制剂（conduritol-β-epoxide,CβE）,观察GBA活性的变化,同时在细胞外添加α-Syn单体使其进入细胞内并孵育48 h.使用双抗体夹心ELISA方法测定细胞内α-Syn寡聚体含量,观察细胞自噬活性、氧化应激和凋亡.结果 随着CβE质量浓度的增加,GBA活性呈质量浓度依赖性的下降,而细胞内α-Syn寡聚体的含量则呈质量浓度依赖性的增加;在CβE处理细胞,随着细胞外添加的α-Syn单体的质量浓度加大,自噬活性和氧化应激液增强,同时细胞凋亡数量增加.结论 抑制GBA活性导致细胞内α-Syn寡聚体增多以及依赖于α-Syn浓度的自噬活性和氧化应激增强和细胞凋亡增加.     

α-突触核蛋白促进过氧化氢诱导的多巴胺能神经细胞凋亡

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的多巴胺能神经细胞凋亡中的作用。方法通过瞬时转染重组质粒pEGFP-α-syn和pcDNA-α-syn到MES23.5多巴胺能神经细胞建立过表达α-syn细胞模型。细胞外添加H2O2(200μmol/L)处理细胞。Hoechst 33258荧光标记细胞核及AO/PI(吖啶橙/碘化丙啶)双染检测细胞凋亡。Mitotracker线粒体探针标记线粒体。结果 H2O2可增加α-syn向线粒体和细胞核的转运;H2O2可单独引起细胞凋亡,但过表达α-syn细胞的凋亡率显著高于空载质粒转染细胞(P<0.05)。结论α-Syn增强了H2O2诱导的多巴胺能神经细胞凋亡。     

人Ndfip1基因在转染MES23.5细胞中的表达

目的应用携带人Ndfip1(Nedd4family interacting protein 1)基因的质粒pCMV6-XL5-Ndfip1转染MES 23.5多巴胺能神经细胞,检测其在细胞中的表达。方法应用Lipofectamine法转染MES 23.5细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MES 23.5细胞中Ndfip1mRNA的表达。结果该表达载体转染MES23.5细胞后,细胞内Ndfip1mRNA的表达水平明显增加(t=-8.295,P0.01)。结论 Ndfip1基因可在MES23.5细胞内表达,从而为进一步研究Ndfip1在神经元保护中的作用奠定了基础。     

α-突触核蛋白在大鼠脊髓的表达

目的研究α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)在正常大鼠脊髓中的表达。方法利用2种抗α-Syn单抗3D5和2E3进行免疫组化染色,观察α-Syn在脊髓的表达和分布;用免疫荧光双标方法观察α-Syn与神经肽Y(NPY)共存的情况。用Luxol fast blue染色鉴别有髓与无髓神经纤维。结果α-Syn主要存在于脊髓灰质神经元核及灰质无髓神经纤维中。富含α-Syn的神经纤维主要分布在脊髓灰质的第Ⅰ、Ⅱ层,而α-Syn核阳性神经元主要分布在第Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ层;后根第Ⅰ、Ⅱ层一小部分α-Syn阳性纤维与NPY共存;前角细胞核呈α-Syn阳性神经元胞质中存在NPY,而其他部位的α-Syn核阳性神经元胞质中无NPY。结论α-Syn存在于大鼠脊髓灰质的神经元核及无髓神经纤维中,部分阳性神经纤维和神经元胞体呈NPY免疫阳性反应。     

α-突触核蛋白通过Rab5B下调海马神经元膜表面NMDA受体含量及其介导的Ca~(2+)内流和内向电流

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)对原代海马神经元膜表面N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体含量和功能的影响及其机制。方法细胞外添加基因重组α-Syn,使其进入原代培养神经元细胞内,观察敲减Rab5B基因前后神经元膜表面NMDA受体(NMDAR)和Rab5B表达的变化;NMDA激活NMDAR,活细胞工作站测定神经元Ca~(2+)内流变化,全细胞膜片钳记录内向跨膜电流变化。结果α-Syn增加神经元Rab5B的表达,减少膜表面NMDAR含量,并因而抑制NMDA引起的Ca~(2+)内流及内向跨膜电流;敲减Rab5B可逆转α-Syn对NMDAR的下膜作用及功能的影响。结论α-Syn通过上调Rab5B而下调海马神经元膜表面NMDAR含量及其介导的Ca~(2+)内流及内向电流。     

过氧化氢和帕金森病患者血清促进α-突触核蛋白向线粒体与细胞核转运

目的研究氧化应激和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者血清对α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)向线粒体以及细胞核转运的影响。方法将MES23.5多巴胺能神经细胞在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养,然后分别用过氧化氢(H2O2)以及PD和正常人血清处理,免疫荧光标记法观察不同处理对α-Syn向线粒体以及细胞核的转运以及对线粒体及细胞核的影响。比色法测定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、脂质氧化(malondialdehyde,MDA)和总抗氧化能力(totalanti-oxidation competence,T-AOC),观察血清的氧化应激水平。结果 H2O2和PD血清促进α-Syn向线粒体转运与细胞核转运,并造成线粒体皱缩、崩解,PD血清处理同时引起类似凋亡的核碎裂现象。PD血清的SOD、MDA和T-AOC高于对照血清。结论氧化应激和PD血清均可促进α-Syn向线粒体与细胞核转运,PD血清促进α-Syn向线粒体与细胞核转运可能与其氧化应激水平增高有关。     

组蛋白脱乙酰化酶在α-突触核蛋白抑制酪氨酸羟化酶表达中的作用

目的探讨组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)参与α-突触核蛋白(-αsynuclein,-αSyn)的过表达抑制酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的可能机制。方法利用HDAC活性检测试剂盒检测MES 23.5多巴胺能神经细胞系和稳定转染-αSyn的细胞中HDAC的活性差异,应用Western-blot及RT-PCR检测转染-αSyn细胞系中HDAC抑制剂———曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对TH表达的影响。结果在转染-αSyn的细胞系中HDAC的活性显著高于未转染组;TSA增加了转染细胞内TH蛋白和mRNA的表达(P<0.05)。结论HDAC参与了多巴胺能神经元中-αSyn抑制TH表达的机制。     

α-突触核蛋白促进原代神经元及转基因小鼠神经细胞表面NMDA受体的内在化

目的在原代培养神经元及转基因动物水平上,研究α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）对神经细胞表面N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体的影响及其机制。方法免疫荧光标记法和Western blotting测定NMDA受体（NMDA receptor,NMDAR）和Rab5B质量分数。Rab5B反义寡核苷酸抑制Rab5B基因表达。以原代培养神经细胞及转基因小鼠为模型,观察α-Syn蛋白增多对细胞膜NMDAR质量分数的影响以及Rab5B的作用。结果在细胞及动物水平,α-Syn明显上调Rab5B表达,促进NMDAR的内在化。而抑制Rab5B表达可消除α-Syn致NMDAR的内在化。结论α-Syn通过上调Rab5B的表达促进NMDAR的内在化。     

佛波醇酯对MES 23.5细胞铁调节蛋白1表达的影响

目的探讨蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波醇酯(PMA)对MES 23.5细胞中铁调节蛋白1(IRP1)的激活作用。方法采用MTT法观察细胞的存活率,Western Blot法检测IRP1和铁转出蛋白(Fpn1)的表达变化。结果 0.01~2.00μmol/L的PMA作用MES 23.5细胞24 h后,细胞存活率无明显变化(F=3.050,P>0.05)。0.20μmol/L的PMA作用MES 23.5细胞24 h后,IRP1表达明显上调(t=4.501,P<0.01),Fpn1表达明显下调(t=5.174,P<0.01)。结论 PMA在多巴胺能神经细胞系MES 23.5细胞中能明显激活IRP1。     

多巴胺对鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集的促进作用

目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,流式细胞术检测双氢罗丹明123荧光强度;Western印迹法检测胞质内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集体。并采用多巴胺耗竭剂——利血平预处理3h,观察上述指标。结果:鱼藤酮处理24h后,PC12细胞内过氧化物水平显著升高,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,细胞内过氧化物水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显著升高,胞质内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集体形成;采用利血平预处理后,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集体面积减小。结论:在鱼藤酮作用过程中,多巴胺可促进α-突触核蛋白表达上调及其聚集体的形成。     

茶多酚及其提取物EGCG抑制MPTP致α-突触核蛋白聚集

目的 研究茶多酚及其提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)对帕金森病神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)引起的α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)聚集的影响。方法 健康雌性食蟹猴(10~12岁),采用数字表法随机分为正常对照组、茶多酚对照组(TP组)、帕金森病模型组(MPTP组)和茶多酚治疗组(MPTP + TP组),每组4只。正常对照组不进行任何处理;茶多酚对照组灌胃给予茶多酚80 d;帕金森病(Parkinson's disease, PD)模型组静脉给予MPTP诱导PD模型;茶多酚治疗组在PD模型建立后给予茶多酚治疗80 d。实验动物经安乐死后,分离脑组织,ELISA法检测不同脑区寡聚化α-syn含量。体外培养MES23.5多巴胺能神经细胞,细胞外添加α-syn单体或寡聚体后,再经MPP⁺和/或EGCG处理,ELISA法检测细胞内α-syn寡聚体的量,MTT法检测各组多巴胺能神经细胞损伤情况。结果 MPTP增加猴脑组织寡聚化α-syn含量,治疗性给予茶多酚减少MPTP引起的α-syn聚集。体外研究表明,MPP⁺可明显增加对照组、α-syn单体和寡聚体处理组细胞的细胞内α-syn寡聚体的量,而茶多酚提取物EGCG可以抑制MPP⁺引起的细胞内α-syn聚集,并缓解MPP⁺所致细胞损伤。结果 茶多酚及其提取物EGCG可以抑制PD神经毒素MPTP引起α-syn聚集和多巴胺能神经元损伤。     

姜黄素保护帕金森病多巴胺能神经元的机制研究

目的: 观察姜黄素对帕金森病细胞模型中多巴胺能神经元的保护作用并探讨其作用机制。方法: 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞采用1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子（MPTP）处理建立帕金森病细胞模型,进一步设立姜黄素干预、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预以及姜黄素和3-MA同时干预组。各组细胞在药物处理48 h后分别进行酪氨酸羟化酶（TH）免疫荧光染色观察多巴胺能神经元存活数;蛋白质印迹法检测α-突触核蛋白（α-Syn）、转录因子EB（TFEB）、自噬相关蛋白多克隆抗溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A）和微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）的蛋白表达;RT-PCR检测α-Syn的mRNA表达。结果: 与模型对照组比较,姜黄素组多巴胺能神经元存活数增加（P < 0.01）,α-Syn蛋白及mRNA表达减少（均P < 0.01）,TFEB以及自噬蛋白LAMP2A和LC3-Ⅱ表达上调（均P < 0.01）;3-MA和姜黄素同时干预组多巴胺能神经元存活数增加（P < 0.05）,α-Syn蛋白及mRNA表达减少（P < 0.05或P < 0.01）,TFEB、LAMP2A和LC3-Ⅱ蛋白表达上调（均P < 0.01）。与姜黄素组比较,姜黄素和3-MA同时干预组多巴胺能神经元存活数减少,LC3-Ⅱ和LAMP2A蛋白表达减少（均P < 0.05）。结论: 姜黄素可激活细胞自噬功能促进α-Syn自噬性清除,从而减轻MPTP所致的多巴胺能神经元损伤。     

人参皂苷Rg1激活PI3K/Akt信号通路对6-OHDA毒性作用的影响

目的 探讨人参皂苷Rg1对抗6-羟基多巴胺(6-OHDA)毒性作用的信号通路.方法 MES23.5细胞常规培养,免疫印迹法观察人参皂苷Rg1预处理对6-OHDA诱导的磷酸化蛋白激酶B (Akt) 表达的影响,MTT法观察细胞的存活率.结果 6-OHDA可时间依赖性地降低MES23.5细胞磷酸化Akt的表达(F=24.51,P<0.01),人参皂苷Rg1预处理可明显增强磷酸化Akt的表达(t=471.60,P<0.01);人参皂苷Rg1预处理可明显降低6-OHDA对MES23.5细胞的损伤作用,此作用可以被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002所阻断(F=25.12,P<0.01).结论 人参皂苷Rg1通过激活PI3K/Akt信号通路对抗6-OHDA对MES23.5神经细胞的毒性作用.     

NGF、BDNF和NT-3在背根节卫星细胞的表达

目的：观察神经因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养因子－3（NF－3）及其mRNA在成年猫背根节（L6）卫星细胞的表达情况。方法：成的雄猫5只，随机取一侧的L6背根节（DRG）制作20μm厚冰冻切片，行免疫组化及原位杂交染色。观察NGF、BDNF和NT－3及其mRNA在DRG卫星细胞的分布以及亚细胞定位。结果：在正常DRG，可见NGF、BDNF和NT－3及其mRNA阳性卫星细胞。各因子mRNA的阳性反应物定位于胞质。BDNF－IR定位于胞质，而NGF－IR和NT－3－IR则定位于胞核。结论：背根节部分卫星细胞内有NGF、BDNF和NT－3及其mRNA的分布，BDNF和NGF、NT－3亚细胞定位的不同提示成年猫背根节卫星细胞内不同生长因子发挥作用的机制可能不同。     

西尼罗Ⅰ型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆,为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础.方法 根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物,QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA,长片段RT-PCR技术扩增目的 基因片段.将目的 基因片段与pMD18-T载体进行连接,转化入感受态细胞E.coli DH5α,进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆,将重组质粒进行PCR和测序鉴定.结果 获得的目的 基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体.结论 成功获得西尼罗Ⅰ型病毒功能基因的cDNA亚克隆,可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备.     

西尼罗I型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆，为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础。方法根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物，QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA，长片段RT-PCR技术扩增目的基因片段。将目的基因片段与pMD18-T载体进行连接，转化人感受态细胞E.coli DH5α，进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆。将重组质粒进行PCR和测序鉴定。结果获得的目的基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体。结论成功获得西尼罗I型病毒功能基因的cDNA亚克隆，可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备。