不同方式重组表达鼠疫caf1M蛋白的研究

目的对比不同方式克隆表达鼠疫耶尔森氏菌caf1M蛋白的存在状态及免疫学活性。方法分别选择3种不同载体pET32a(+)、pGEX4t-1、pGBTNH,克隆表达鼠疫caf1M蛋白;并以鼠疫菌免疫血清分别检测其免疫学活性。结果成功构建了4个重组质粒,分别是含去除信号肽编码序列caf1M基因的3个质粒载体,及1个含有完整caf1M基因的pGEX4t-1表达质粒;4个质粒经诱导均在大肠杆菌中得到高效表达;存在状态分析表明,含有去除信号肽编码序列caf1M基因的pGEX4t-1表达的重组蛋白以可溶方式存在,其余3种以包涵体形式存在;重组蛋白与鼠疫菌免疫血清的Western blot分析表明,除pGBTNH表达的蛋白存在非特异反应外,其余3种重组蛋白都发生特异性反应。结论成功克隆表达了4种鼠疫菌caf1M蛋白,其中3种具有良好的特异性免疫反应性;信号肽序列及载体都对重组caf1M蛋白的表达有影响。     

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA伴侣蛋白Hfq的表达与纯化

目的构建重组原核表达质粒,对类鼻疽伯克霍尔德菌分子伴侣Hfq蛋白进行高效表达和纯化。方法 PCR扩增类鼻疽伯克霍尔德菌hfq基因并克隆至pMD19-T克隆载体中,测序验证后,用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pM D19T-hfq与pET30a(+),将目的基因片段插入含His标签序列的原核表达载体PET30a(+)中,构建重组表达质粒pET30a(+)-hfq,并转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导目的基因表达,采用SDS-PAGE与Western blot对表达蛋白进行鉴定,通过Ni 2+螯合柱对目的蛋白进行纯化。结果 PCR扩增出正确的hfq基因片段,大小为237bp,与预期值相符。亚克隆质粒与原核表达质粒载体连接后进行双酶切鉴定,重组质粒pET30a(+)-hfq构建正确。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导5h,从细菌裂解液中检测到Hfq融合蛋白,分子质量单位(Mr)约为9.4×103。通过Ni 2+螯合柱纯化,获得单一SDS-PAGE条带的目的蛋白。结论 hfq基因原核表达质粒构建成功,Hfq在大肠埃希菌中成功表达,得到Ni 2+柱层析获得的高纯度的sRNA伴侣蛋白Hfq,为进一步筛选与该蛋白有相互作用的sRNA及sRNA功能研究奠定了基础。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

蓝氏贾第鞭毛虫α8-贾第素基因克隆、表达与免疫反应性的鉴定

目的对蓝氏贾第鞭毛虫的α8-贾第素(α8-giardin)基因进行克隆和表达,并检测其免疫反应性。方法利用PCR方法获得α8-贾第素基因开放阅读框(ORF)片段,经双酶切将其连入原核表达载体p ET-30a(+),构建重组表达载体p ET30a(+)-α8-giardin。经PCR和酶切鉴定后,将该载体转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),筛选出阳性菌落并诱导其表达。经亲和层析柱纯化后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)检测重组蛋白。结果自蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA扩增得到约930 bp的α8-贾第素基因片段。经PCR和酶切鉴定表明,重组表达载体p ET30a(+)-α8-giardin构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析结果显示,α8-贾第素重组蛋白以非可溶性形式存在于包涵体中,相对分子质量(Mr)约为36 000,可被抗His标签抗体和兔抗贾第虫血清识别。结论克隆蓝氏贾第鞭毛虫α8-贾第素基因,纯化的重组α8-贾第素蛋白具有免疫反应性。     

阴道毛滴虫TPI基因克隆及原核表达

目的构建阴道毛滴虫TPI基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法根据阴道毛滴虫TPI基因开放阅读框设计并合成特异性引物,以阴道毛滴虫总cDNA为模板PCR扩增目的片段,与pMD-18-T连接构建克隆载体pMD-TPI,经双酶切回收目的片段,与表达载体pGEX-T连接,构建原核表达载体pGEX-TPI,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE及Western blot鉴定表达产物。结果成功构建了阴道毛滴虫TPI基因原核表达载体pGEX-TPI;SDS-PAGE电泳显示,在IPTG诱导下重组质粒转化菌高效表达分子质量单位为27.5ku的蛋白质;Western blot显示表达产物可被抗阴道毛滴虫的多克隆血清识别。结论成功构建了TPI基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,为进一步研究阴道毛滴虫TPI基因功能奠定了基础。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH的构建及鉴定

目的构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的fimH基因真核表达载体,为尿路致病性大肠埃希菌的核酸疫苗研制奠定基础。方法通过PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌临床分离株的fimH全基因序列,克隆至pMD19-T载体,PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒,并进行PCR和酶切鉴定。结果 PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌fimH基因片段为910 bp;构建的pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,产生1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH。     

嵌合KGDS基序的蜱抗凝血肽突变体基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 设计含赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸基序（KGDS）的蜱抗凝血肽（TAP）突变体基因序列,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中与硫氧还蛋白（Trx）融合表达,以获得Trx-TAP-KGDS融合蛋白。方法 人工合成目的基因,定向克隆于含Trx基因的高效原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-TAP-KGDS,并转化BL21感受态菌,以PCR及双酶切鉴定阳性克隆;含正确重组质粒的工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果 重组质粒经PCR及双酶切鉴定,均获得约209 bp的基因片段,与预期大小一致;SDS-PAGE分析显示,含重组质粒的工程菌在IPTG的诱导下高效表达分子质量单位约为24 ku的蛋白质,该蛋白以水溶性形式为主。结论 构建了含KGDS基序的TAP突变基因的原核表达载体pET32a（＋）-TAP-KGDS,并成功进行了融合表达,为进一步研究其抗凝血活性打下了基础。     

结核分枝杆菌毒力分泌系统Rv3871基因的分子克隆及蛋白表达研究

目的为探索参与结核分枝杆菌(MTB)毒力分泌系统相关基因的分子功能,对MTB H37Rv株编码Rv3871蛋白基因进行克隆、表达及鉴定分析。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,用PCR扩增Rv3871基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DE3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测分析。结果阳性重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到1 776和5 900 bp两条片段,与预期大小一致。重组质粒测序,与NCBI上Rv3871编码序列比对完全一致,且输入片段读码框与表达载体读码框相吻合。SDS-PAGE检测表达蛋白分子质量单位为84 ku;Western blot检测出特异性阳性信号。结论本研究成功构建了结核杆菌毒力分泌系统重要相关基因Rv3871的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达Rv3871蛋白,为进一步探讨该基因在MTB毒力分泌中的功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒性蛋白基因的克隆及其原核表达

目的从苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bti）以色列亚种中获得cry4B、cry11A和cyt1A3种主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行克隆和原核表达。方法根据GenBank上3种基因的已知序列设计合成引物,应用PCR技术扩增目的基因,克隆入pUC19质粒,阳性克隆质粒经酶切和测序鉴定。将测序鉴定的3种蛋白基因克隆入原核表达载体（pET32c）进行原核表达。结果PCR扩增获得特异性的基因片段,重组质粒经酶切后获得预计大小的基因片段,并测序鉴定。序列结果与已知序列一致。原核表达载体经ITPG诱导,获得预计大小的目的蛋白。结论成功克隆了苏云金芽孢杆菌以色列亚种的3个主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行原核表达。     

空肠弯曲菌CadF蛋白的原核表达与产物分析

目的构建空肠弯曲菌cadF基因重组表达质粒pET30a(+)-cadF,分析其在大肠埃希菌中的表达情况及其融合蛋白的抗原性。方法用PCR方法扩增cadF基因,构建重组克隆质粒和表达质粒,经菌落PCR、双酶切和测序鉴定后在E.coli(DE3)原核表达系统中诱导表达,SDS-PAGE和飞行时间质谱鉴定表达蛋白,Western blot分析其抗原性。结果含重组表达载体pET-30a(+)-cadF中的cadF基因序列经测序证实与出发菌株cadF基因序列100%同源,并成功诱导表达CadF蛋白,Westernblot显示该CadF融合蛋白能被抗空肠弯曲菌多克隆兔血清识别。结论成功构建了空肠弯曲菌cadF基因重组表达载体,表达产物具有抗原性。     

甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达及免疫反应性分析

目的构建甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白,并对表达蛋白的免疫反应性进行分析。方法人工合成A/California/05/2009 H1N1流感病毒的HA基因,以合成基因为模板,通过PCR方法扩增出去除信号肽的HA部分基因片段,然后将去除信号肽的HA基因克隆至pET30a(+)原核表达载体中,构建出原核表达质粒,再将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达菌株;重组菌经IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot分析表达产物的免疫反应性。结果获得了HA基因的原核表达重组菌,细菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约67.4 ku大小的目的蛋白表达条带,Western blot结果显示,表达产物与人甲型H1N1流感患者阳性血清具有反应性。结论成功表达出甲型H1N1流感病毒的HA蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为甲型H1N1流感的快速诊断方法的建立提供了生物材料。     

刚地弓形虫抑制蛋白的原核表达与免疫反应性分析

目的克隆并表达刚地弓形虫抑制蛋白(Tg PRF)基因,并分析其免疫反应性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,根据Tg PRF的基因编码序列设计引物,RT-PCR扩增产物双酶切后连接入p ET30a(+)载体,重组质粒转化入大肠埃希菌(E.coli)DH5α,经双酶切、PCR和测序鉴定阳性菌落。p ET30a(+)-Tg PRF转化至E.coli BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。重组蛋白经镍亲和层析法纯化后,以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析r Tg PRF蛋白的免疫反应性。结果 Tg PRF基因RT-PCR扩增产物约为492 bp。经双酶切、PCR和测序结果显示,重组质粒p ET30a(+)-Tg PRF构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约35 000的可溶性重组蛋白。Western blotting结果显示,r Tg PRF蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论本研究克隆的Tg PRF基因序列能在原核表达系统中表达,且具有免疫反应性。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

产单核细胞李斯特菌plcB基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达产单核细胞李斯特菌plcB基因。方法利用PCR技术从产单核细胞李斯特菌基因组中扩增不含编码信号肽的plcB基因。采用T-A克隆构建pGEM-T-plcB重组质粒,BamHI、XhoI双酶切pGEM-T-plcB获得plcB片段后再插入pGEX-6p-1原核表达载体,获得pGEX-6p-1-plcB重组表达质粒并在表达宿主菌BL21中诱导表达。对表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western-blotting、磷脂酶活性实验分析。结果克隆的plcB基因长834bp,与GenBank上公布的序列完全相同;表达的与GST标签蛋白融合的广谱磷脂酶C蛋白(GST-PC-PLC)具有磷脂酶生物活性和免疫原性。结论成功构建产单核细胞李斯特菌plcB基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,这为进一步研究PC-PLC蛋白的致病与免疫机理奠定了基础。     

鼠疫耶尔森菌纤维蛋白溶解酶原激活因子蛋白及其特异性片段的原核表达

目的 重组表达鼠疫耶尔森菌纤维蛋白溶解酶原激活因子(Plasminogen activator,Pla)蛋白及其特异性片段并检测其免疫反应性.方法 以鼠疫EV76株为模板,PCR扩增pla、pla-c基因,并与质粒原核表达载体(prokaryotic expression vector,pET)32a(+)连接,将pET32a(+)-pla、pET32a(+)-pla-c分别转化E.coli BL21(DE3)诱导表达;产物经镍离子金属螯合亲和层析纯化,免疫印迹(Western blot)法鉴定其免疫反应性.结果 所表达的Pla蛋白相对分子质量(Mr)为52.8×103,以包涵体形式存在;Pla-c蛋白Mr为24.0×103,以可溶形式存在;这两个蛋白质均可与鼠疫免疫血清产生特异结合反应.结论 所表达的鼠疫菌Pla及其特异性片段具有免疫反应性,为辅助诊断鼠疫提供了选择.     

弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及免疫分析

目的 克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析。方法 提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。结果 PCR得到约1 665 bp目的基因片段,单、双酶切及PCR鉴定结果显示成功构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18;经IPTG诱导后,ROP18基因在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,pET28a-ROP18在相对分子质量约60 kD的位置出现目的蛋白条带,pET32a-ROP18在相对分子质量约83 kD的位置出现目的蛋白条带,均与理论值相符;Western-blot结果显示重组蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性。结论 成功克隆和表达了ROP18基因,所表达的重组蛋白具有免疫效应,为其功能研究奠定基础。     

户尘螨Ⅱ类变应原Der p2 T细胞表位融合基因的克隆和原核表达

目的原核表达、纯化户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)主要变应原Der p2的T细胞表位融合肽。方法将已报道的户尘螨Der p2中编码4个T细胞表位(T1~T4)的核苷酸序列以T1-T2-T3-T4的方式连接,人工合成为嵌合基因,命名为Der p2 T。PCR扩增目的基因Der p2 T,将纯化的扩增片段克隆至p ET-28a(+)载体,构建原核重组表达质粒p ET-28a(+)-Der p2 T,并进行双酶切验证。大量诱导表达含p ET-28a(+)-Der p2T的E.coli BL-21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经Ni-NTA亲和层析获得纯化重组蛋白,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析。ELISA法检测重组Der p2 T细胞表位融合肽对户尘螨过敏患者血清Ig E抗体的结合能力。结果双酶切结果表明,构建了原核重组表达质粒p ET-28a(+)-Der p2 T。SDS-PAGE分析结果显示,获得相对分子质量(Mr)为10 000的重组Der p2 T细胞表位融合肽。Western blotting分析结果显示,纯化了Der p2的T细胞表位融合肽。Der p2 T细胞表位融合肽对粉尘螨哮喘患者的血清Ig E结合能力[(37.70±9.89)μg/ml]较Der p2显著降低[(85.89±9.63)μg/ml](P0.01)。结论制备Der p2 T细胞表位融合肽。与Der p2相比,重组Der p2 T细胞表位融合肽对户尘螨过敏患者血清Ig E抗体的结合能力明显降低。     

9ku颗粒溶素活性肽重组减毒沙门菌的构建与表达

目的构建人9ku颗粒溶素(granulysin)的重组减毒沙门菌,并在真核细胞中表达,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR、双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌;重组质粒电转化减毒沙门菌后,将重组菌感染巨噬细胞,以RT-PCR检查颗粒溶素的表达。结果成功扩增出含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9ku颗粒溶素;重组减毒沙门菌感染细胞后,检测到颗粒溶素的表达。结论成功构建含9ku颗粒溶素活性肽基因的重组减毒沙门菌,该菌能成功递呈携带基因在感染细胞内表达。