大鼠生长期触须毛囊干细胞中FGF-13的表达研究

目的探讨大鼠生长期触须毛囊中以及体外培养的毛囊隆突部细胞即毛囊干细胞中FGF-13的表达分布及其意义.方法分别采用免疫组织化学方法和免疫细胞化学方法检测FGF-13的表达.结果体外和在体两种情况下,毛囊隆突部细胞都有FGF-13的表达,在体情况下毛囊Bulge区以下毛球部以上的外根鞘细胞中亦有干细胞标记和FGF-13的表达.结论提示FGF-13参与生长期触须毛囊隆突部细胞沿毛囊外根鞘向下迁移这一过程.     

毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及其向雪旺细胞诱导分化的实验研究

目的 培养并鉴定Wistar小鼠毛囊神经嵴干细胞,并使其诱导分化成为雪旺细胞（Schwann cell,SCs）.方法 采用Wistar小鼠毛囊隆突贴块培养法培养小鼠毛囊神经嵴干细胞,并对培养的细胞进行并行免疫荧光细胞化学双重染色鉴定,诱导染色阳性的细胞初步分化后进行S-100染色,鉴定其分化产物为雪旺细胞.结果 采用Wistar小鼠毛囊隆突贴块培养法培养的毛囊神经嵴干细胞,免疫细胞化学染色呈现nestin及P75双阳性;对培养贴壁出的细胞胰酶消化后传代培养,诱导分化后进行S-100免疫细胞化学染色显示S-100阳性细胞突起的末端呈扁平状膨大.结论 利用Wistar小鼠毛囊可以体外培养出毛囊神经嵴干细胞,对其进行初步的诱导分化可以得到S-100阳性的细胞.     

差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞

目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠骨髓问充质干细胞（BMSCs）。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、9．4h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、9．4h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。     

大鼠脊髓神经元的分离、培养与鉴定

目的通过对新生大鼠脊髓神经元分离、培养过程中细节的探讨,建立一种高效、稳定的大鼠脊髓神经元培养方法,为研究脊髓损伤相关的病理生理及其治疗提供种子细胞。方法取新生SD大鼠的脊髓组织,通过木瓜酶消化制成单细胞悬液,经差速贴壁后种于12孔细胞培养板内,用无血清培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫细胞化学对神经元β-ⅢTubulin行特异性荧光素染色,结合DAPI核染色鉴定神经细胞及其含量。结果该方法培养的脊髓神经元生长状态良好、密度适中,纯度较高,约83%。结论采用木瓜酶消化、差速贴壁及无血清培养的新生大鼠脊髓神经元符合体外实验的要求,为进一步进行相关实验提供目的细胞。     

Isolation, culture and identification of spinal cord neurons from neonatal rats

目的 通过对新生大鼠脊髓神经元分离、培养过程中细节的探讨,建立一种高效、稳定的大鼠脊髓神经元培养方法,为研究脊髓损伤相关的病理生理及其治疗提供种子细胞.方法 取新生SD大鼠的脊髓组织,通过木瓜酶消化制成单细胞悬液,经差速贴壁后种于12孔细胞培养板内,用无血清培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫细胞化学对神经元β-ⅢTubulin行特异性荧光素染色,结合DAPI核染色鉴定神经细胞及其含量.结果 该方法培养的脊髓神经元生长状态良好、密度适中,纯度较高,约83％.结论 采用木瓜酶消化、差速贴壁及无血清培养的新生大鼠脊髓神经元符合体外实验的要求,为进一步进行相关实验提供目的细胞.     

β-catenin和cox-2在大鼠毛囊隆突区细胞中的表达及意义

目的通过观察Β-CATENIN和COX-2在体外培养的毛囊隆突区细胞中的表达,探讨其对隆突区细胞增殖的作用及相互关系。方法在体外分离培养毛囊隆突区细胞的基础上,采用免疫细胞化学方法分别检测不同时相Β-CATENIN和COX-2在毛囊隆突区细胞中的表达。结果Β-CATENIN和COX-2在毛囊隆突区细胞呈强表达,并表现出与培养时间的相关性;同时Β-CATENIN可见于细胞质与细胞核中,而COX-2仅见于细胞核。结论Β-CATENIN和COX-2对毛囊隆突区细胞具有促增殖作用,COX-2可能是Β-CATENIN途径发挥作用的核内靶基因。     

大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法:于无菌条件下取新生1~2 d的SD大鼠脊髓组织,采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液,通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞,进行培养。用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态,传至第3代细胞纯度达95%以上。结论:成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法,为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。     

PPARγ2表达促毛囊bulge细胞向皮脂腺定向分化的研究

目的探讨毛囊bulge细胞向皮脂腺细胞分化的机制。方法构建携带过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(peroxisomeproliferatoractivationreceptorγ2,PPARγ2)基因的绿色荧光蛋白(GFAP)质粒,通过质脂体转染到体外分离培养毛囊bulge细胞中,以转染空质粒的毛囊bulge细胞为对照,观察细胞的分化情况,运用免疫细胞化学检测细胞PPARγ和上皮膜抗原(epithelialmembraneantigen,EMA)的表达,油红O染色观察细胞脂滴合成情况。结果荧光显微镜下观察到已转染质粒的细胞呈现绿色荧光,能稳定表达PPARγ2mRNA,该细胞分化3周左右,部分细胞胞浆内出现脂滴,PPARγ、EMA及油红O染色阳性,而对照组为阴性,细胞内未见脂滴。结论毛囊bulge细胞可以分化为皮脂腺细胞,PPARγ2基因在其中起着重要作用。     

黄芪诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.方法通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养.中药黄芪定向诱导MSC分化为类神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.结果大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪诱导90 min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性.结论大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞.     

去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损

目的利用去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损。方法体外分离和培养人毛囊干细胞,取经慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-GFP-Lentiviru）标记后第4代毛囊干细胞接种于去细胞羊膜上;负载后第7天,HE染色光学显微镜观察细胞黏附生长情况。于18只C57BL/6裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面,并根据不同的处理方式分为实验组（将负载毛囊干细胞的去细胞羊膜植入裸鼠全层皮肤缺损创面）、去细胞羊膜移植＋干细胞注射组（将去细胞羊膜覆盖创面后羊膜下注射5×106毛囊干细胞）和去细胞羊膜移植组（去细胞羊膜单独移植）,每组6只。分别于移植后第7、14、21、28天,测量各组创面面积并计算创面收缩率。移植后第28天,荧光显微镜观察创面组织绿色荧光蛋白（GFP）表达,HE染色光学显微镜观察新生皮肤结构特征。结果去细胞羊膜负载毛囊干细胞后第7天,HE染色光学显微镜观察发现,细胞连接成片状覆盖于去细胞羊膜表面。实验组和去细胞羊膜移植＋干细胞注射组移植后各时点的创面收缩率均显著小于去细胞羊膜移植组（P〈0.05）。移植后第28天,荧光显微镜观察显示实验组创面表皮层GFP表达阳性;HE染色光学显微镜观察发现实验组创面组织表皮层明显增厚,有类似毛囊样结构生成。结论去细胞羊膜负载毛囊干细胞可用于修复裸鼠全层皮肤缺损。