同种异体骨髓间充质干细胞移植急性心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA的表达

背景:细胞移植可以修复受损的心肌组织,但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电-机械偶联,并引起移植后细胞缝隙连接蛋白重构及心律失常等尚缺乏系统观察.目前只有少数研究发现心肌梗死后缝隙连接蛋白45表达上谓,而对于骨髓间充质干细胞移植后缺血区缝隙连接蛋白45的表达尚无报道.目的:课题组假设通过改变缝隙连接蛋白水平、干预异常的GJ通道,来尝试治疗心肌梗死后心律失常,为此探讨同种异体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-01/2009-05在广西医科大学实验中心完成.材料:健康Wistar大鼠180只,随机分为正常对照组、假手术组、心肌梗死组、细胞移植组,45只,组.各组按干预后4,8,12周又分为3个亚组,15只/亚组.另取1月龄健康雄性Wistar大鼠20只,用于分离培养骨髓间充质干细胞.方法:取传至第3代的大鼠骨髓间充质干细胞,加入10 μmol/L 5-氮胞昔进行诱导,4周后用于移植,在移植前2 h行DAPI标记.心肌梗死组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉.造模后7 d,细胞移植组将2×10~(10) L~(-1)骨髓间充质干细胞悬液分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,心肌梗死组、正常对照组、假手术组均注射等量生理盐水.主要观察指标:荧光定量PCR法检测缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA的表达.结果:①干预后4,8,12周,各组正常区缝隙连接蛋白43、缝隙连接蛋白45 mRNA表达基本相似.②与正常区比较,心肌梗死组、细胞移植组缺血区的缝隙连接蛋白43 mRNA表达均显著减少(P＜0.01),缝隙连接蛋白45 mRNA表达均显著增加(P＜0.01).③同一时间点与心肌梗死组比较,细胞移植组缺血区缝隙连接蛋白43mRNA表达显著增高(P＜0.01),缝隙连接蛋白45 mRNA表达显著减少(P＜0.01).结论:课题创新性证实急性心肌梗死导致心肌缝隙连接蛋白43 mRNA水平下降,缝隙连接蛋白45 mRNA水平升高.5-氮胞苷诱导的同种异体骨髓间充质干细胞移植后,能上调梗死边缘区缝隙连接蛋白43 mRNA的表达.并下调边缘区缝隙连接蛋白45mRNA的表达.     

BMSCs移植后脊髓损伤大鼠VEGF表达的变化

目的观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响。方法以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质千细胞。压迫法制作大鼠脊髓压迫损伤模型。假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓。模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射。结果假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达。骨髓间充质干细胞组在细胞移植后1,3,5 d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM(P0.05),移植后7,14 d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P0.01)。结论骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间。     

糖尿病与正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的比较

背景：目前国内外在干细胞移植治疗心肌梗死的研究中,大多采用正常或者年轻的骨髓间充质干细胞作为移植细胞来源。目的：比较糖尿病和正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效差别。方法：无菌条件下获取正常大鼠及糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞,建立大鼠心肌梗死模型并随机分为3组,分别于心肌梗死病灶区注射100μL 含有105-106个 F2代正常大鼠或糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞的细胞混悬液,空白对照组注射100μL 含体积分数20%胎牛血清的 DMEM。移植后1个月行苏木精-伊红染色检测各组梗死区域心肌组织形态的变化;通过免疫组化方法检测 Bcl-2的表达。结果与结论：通过对细胞形态观察及流式细胞术鉴定,大鼠股骨骨髓贴壁培养可获取纯度较高的骨髓间充质干细胞,绘制细胞生长曲线结果显示正常大鼠骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长快。移植后1个月,正常大鼠干细胞移植组梗死区域心肌组织形态较糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组明显改善,梗死区域心肌组织 Bcl-2的表达也高于其他2组。证实正常大鼠来源骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长明显加快,且糖尿病使骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的疗效降低。     

不同种类自体骨髓干细胞移植对梗死心肌左室重构的效果比较

背景:骨髓干细胞移植可改善心功能、预防心室重构,目前用于移植的成体骨髓干细胞有骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞等,不同种类的骨髓干细胞移植后的效果及具体机制尚不清楚。目的:比较自体骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞冠状动脉移植对急性心肌梗死后心室重构的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-03/2006-12在河北省人民医院临床研究中心、河北医科大学电镜室及大连宝生物进行。(basic fibroblast growth factor,bFGF)材料:36只冀中白猪随机分为4组:假手术组6只、模型组10只、骨髓单个核细胞组10只、骨髓间充质干细胞组10只。方法:采用梯度密度离心法分离培养猪自体骨髓单个核细胞,以贴壁法分离培养猪自体骨髓间充质干细胞,移植前均行胶体金标记。除假手术组外,其余3组均以球囊导管压迫冠状动脉前降支的方法建立猪急性心肌梗死模型。造模后90min,经导管由冠状动脉腔内骨髓单个核细胞组移植自体骨髓单个核细胞(6.0±1.3)×107个,骨髓间充质干细胞组移植自体骨髓间充质干细胞(4.5±2.1)×107个,培养28d。主要观察指标:光镜及电镜观察心肌组织病理学改变;超声检查心功能变化;免疫组织化学检测心肌血管数、心肌细胞凋亡、心肌组织核因子κB及肌钙蛋白I阳性表达情况,及其与心功能的关系;RT-PCR法检测心肌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)mRNA的表达,及其与心功能的关系。结果:①骨髓间充质干细胞组在梗死区、梗死边缘区均可见大量血管增生,冠脉血管周围可见异常细胞团生长,骨髓单个核细胞组有较多的毛细血管"芽生"现象。②细胞移植前各组心功能指标基本相似(F=1.550,P>0.05)。移植后28d与模型组比较,其余3组左心室射血分数均明显降低(F=5.30,P<0.05)。③与模型组比较,骨髓单个核细胞组梗死区及梗死边缘区的血管数明显增加(F=29.56～34.87,P<0.01),骨髓间充质干细胞组无变化;移植细胞两组的梗死区、梗死边缘区心肌细胞凋亡率均显著降低(F=14.31～35.34,P<0.01),肌钙蛋白I阳性率均明显升高(F=19.05,P<0.01);梗死边缘区核因子кB阳性率均明显降低(F=19.05,P<0.01)。④骨髓单个核细胞组梗死边缘区VEGF基因的表达显著高于模型组、骨髓间充质干细胞组(F=49.41,P<0.01)。骨髓间充质干细胞组梗死边缘区bFGF基因的表达显著高于模型组、骨髓单个核细胞组(F=4.71,P<0.01)。⑤左室射血分数与心肌细胞凋亡率、心肌核因子κB呈负相关(r=-0.4411,P<0.05;r=-0.5796,P<0.01);与血管数、VEGF及bFGF表达呈正相关(r=0.775,P<0.01;r=0.5651,P<0.05;r=0.5735,P<0.05)。结论:经冠脉自体骨髓单个核细胞或骨髓间充质干细胞移植均可减轻心肌梗死后左心室重构,心功能的改善与干细胞移植后增加心肌血管数量及心肌VEGF,bFGF表达、减少心肌细胞凋亡及核因子κB水平有关。骨髓单个核细胞移植促心肌血管增生及VEGF的表达均优于骨髓间充质干细胞,而后者促bFGF基因表达的作用优于前者。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的影响

背景:骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但目前尚不能清楚阐述骨髓间充质干细胞移植促进神经功能恢复的相关机制.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-04在中国医科大学神经生物学实验室完成.材料:健康Wistar大鼠75只,3只用于骨髓间充质干细胞的分离培养,72只随机分为3组:假手术组(n=18)、DMEM组(n=27)、骨髓间充质干细胞组(n=27).方法:以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.参照Nystrom's压迫方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓.模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射.主要观察指标:应用RT-PCR法和应用免疫组织化学技术检测损伤脊髓组织内血管内皮生长因子的表达和分布变化.结果:假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达.骨髓间充质干细胞组在细胞移植后l,3,5d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM组(P<0.05),移植后7,14d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P<0.01).结论:骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间.     

转染AKT1基因的自体骨髓间充质干细胞移植治疗猪缺血性心肌病

背景:干细胞移植早期出现的大量细胞缺失可明显影响移植效果,目前已证实AKT1基因的过表达能明显抑制细胞凋亡.目的:探讨过表达AKT1基因的猪自体骨髓间充质干细胞移植能否在体内缺氧状态下抑制干细胞凋亡,及其修复受损心肌的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-08/2007-02在苏州大学完成.材料:健康雄性梅山猪24只,由苏州大学动物实验中心提供.方法:扩增AKT1 cDNA基因,并构建表达载体.扩增后,使用慢病毒转染系统进行基因重组,以其为载体转染建立稳定过表达AKT1基因的猪自体骨髓间充质干细胞,并行BrdU标记.24只猪均应用明胶海绵栓塞冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,造模后4周,随机均分为4组:模型对照组不做任何治疗性处理;DMEM组行冠脉内注射DMEM液5 mL;单纯细胞移植组行冠咏内注射骨髓间充质干细胞悬液5 mL(1×10~7个细胞):AKT转染细胞移植组同法注射等量转染AKT1基因的骨髓间充质干细胞悬液.主要观察指标:载体酶切鉴定和测序验证结果,心脏磁共振检查评估心功能,免疫组化染色观察心肌组织学变化,ELISA法测定血清中血管内皮生长因子及转化生长因子β1的水平.结果:①双酶切鉴定和测序结果均表明所获取的cDNA为AKT1的CDS功能区基因;转染入293T细胞和骨髓间充质干细胞24,48 h后,均可检测到强荧光出现;其蛋白表达产物的分子量与已知分子量相符,实时荧光定量检测结果表明转染2周后的骨髓间充质干细胞能稳定转录AKT1,其AKT1-mRNA的转录水平是原代细胞的120倍.②细胞移植前,梗死心脏的左室舒张末径增加,每搏量明显下降.与移植前比较,移植后单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组心功能明显改善,梗死区的收缩功能和血流灌注均有所改善,左室腔缩小,梗死区的毛细血管密度明显增加,且AKT转染细胞移植组上述各指标改善更为显著(P<0.05).③苏木精-伊红染色结果显示,模型对照组、DMEM组梗死区纤维化明显:单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组梗死区均可见岛样心肌组织,且后者含有较丰富的小血管样结构.免疫组化染色结果显示,移值4周后单纯细胞移植组、AKT转染细胞移植组心肌切片中均发现有VWF及Cx-43阳性表达,且后组Brdu和Cx-43双阳性细胞占所有Brdu阳性细胞的比例明显高于前组(P<0.05).④细胞移植后,血管内皮生长因子水平呈逐渐升高的趋势,1周后达峰值,后逐渐下降,至4周后接近正常水平;而转化生长因子β1水平呈逐渐下降的趋势,至4周后明显低于同期模型对照组、DMEM组(P<0.05),且明显低于移植前水平(P<0.05).结论:使用携带目的基因AKT1的慢病毒系统转染猪骨髓间充质干细胞可使其长期稳定过表达AKT1,移植体内后可能通过防止梗死区变薄、抑制收缩功能异常而改善左室功能,同时AKT1的过表达可显著改善梗死后心脏功能.     

同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死后心电生理异常和左室重构的影响

背景:目前干细胞移植修复梗死心肌及改善心脏功能这一作用已被接受,但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电一机械藕联,是否易形成一个有收缩功能的相对电独立体系,并产生移植后严重的恶性室性心律失常等尚缺乏系统观察.目的:观察心肌梗死大鼠行同种异体骨髓间充质干细胞移植后,其心电生理异常及左室重构情况.设计、时间及地点;随机对照动物实验,于2005-12/2008-10在广西医科大学实验中心完成.材料:健康Wistar大鼠120只,随机分为正常对照组、假手术组、盐水对照组、细胞移植组,30只/组.另取1月龄健康Wistar大鼠数只用于抽取骨髓.方法:取体外培养的第3代大鼠骨髓间充质干细胞,加入诱导剂5一氮胞苷使之转化为心肌样细胞,在移植前2 h行DAPI标记.盐水对照组、细胞移植组大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉.结扎后7 d,细胞移植组将2×10L<'-1>骨髓间充质干细胞分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,其余3组注射等量生理盐水.主要观察指标:体表ECG及心电生理检测,UCG检测左室功能,左室病理检查测定梗死面积,荧光显微镜下观察DAPI标记的供体细胞迁移、分布情况.结果:骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为自发搏动的心肌样细胞,表达心肌特异性肌钙蛋白T,并形成肌丝结构.细胞移植后4,8,12周与盐水对照组比较,细胞移植组PR间期、QRS时限和心室有效不应期缩短,而室颤阈值增加(P<0.05);左室收缩末期内径减小,左室射血分数、左室短轴缩短率均显著增加(P<0.05);移植后8,12周心肌梗死面积明显缩小(P<0.05).移植后4周,在荧光显微镜下梗死区可见DAPI标记带蓝色荧光的移植骨髓间充质干细胞细胞核,至12周仍然存在,但随移植时间延长荧光强度逐渐减弱.结论:骨髓间充质干细胞具有分化为心肌样细胞的可塑性,同种异体骨髓间充质干细胞移植可有效改善心肌梗死后的心电生理异常和左室重构.     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死后心功能及bcl-2和caspase-3 mRNA表达水平的影响

目的观察急性心肌梗死大鼠应用骨髓间充质干细胞(MSCs)移植前后心功能及凋亡相关蛋白bcl-2和caspase-3mRNA的变化,以期了解骨髓间充质干细胞移植治疗心梗的机制。方法 40只SD大鼠,雌雄各半,随机分为对照组、假手术组、心梗组、移植组,每组各10只。心梗组和移植组大鼠分别结扎前降支造成心梗模型。取大鼠骨髓,体外分离扩增培养MSCs。术前4组大鼠进行超声心动图检测心功能,结扎后移植组立即予MSCs多点注射到大鼠心肌梗死区周边,而梗死组和假手术组注射同剂量培养液,对照组不注射。饲养8周后,分别予超声心动图心功能检测。取梗死周边区心肌行RT-PCR检测bcl-2和caspase-3 mRNA的表达。结果术前4组大鼠心功能指数无显著差异(P>0.05);而MSCs移植后,梗死组大鼠心肌LVESD、LVEDD较其它3组明显增高,差异具有显著性(P<0.05);而移植组又较对照组和假手术组明显增高(P<0.05);而对照组和假手术组在上述指标中无显著差异(P>0.05);梗死组大鼠EF较其它3组明显降低(P<0.05);而移植组又较对照组、假手术组明显降低(P<0.05);而对照组与假手术组之间无显著差异(P>0.05)。bcl-2mRNA在对照组和假手术组表达较少,而在梗死组表达增加,差异有显著性(P<0.05);在移植组表达更多,与梗死组相比有显著性(P<0.05);caspase-3在对照组和假手术组表达较少,在梗死组表达增加,有显著差异(P<0.05);在移植组表达又较梗死组表达减少,有显著差异(P<0.05);但与对照组和假手术组相比,表达增加(P<0.05)。结论急性心肌梗死移植MSCs后,心功能得到改善,心肌凋亡得到抑制。     

法舒地尔联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死:有协同治疗作用吗?

背景:RhoA激酶抑制剂法舒地尔能有效抑制心肌梗死后的心肌肥大.目的:观察法舒地尔联合骨髓问充质干细胞移植对急性心肌梗死模型鼠心功能的影响,探讨两者是否具有协同治疗作用.方法:体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞,另选取42只雌性SD大鼠结扎前降支,建立急性心肌梗死模型,随机分成3组.干细胞组,干细胞+法舒地尔组梗死心肌中移植骨髓间充质千细胞,干细胞+法舒地尔组同时给予法舒地尔治疗,梗死组不干预.4周后.以二维超声心动图分析心功能变化,SRY-PCR检测大鼠Y染色体上特有的基因SRY,Western-Blot 检测RhoA蛋白表达,并进行病理观察.结果与结论:与梗死组比较,于细胞组和联合组左室舒张末内径及左室收缩末内径均显著减小(P<0.01),射血分数均显著升高(P<0.01).其中干细胞+法舒地尔组变化幅度优于细胞移植组(P<0.05).干细胞组和联合组基因有SRY表达,梗死组未榆测到基因SRY.干细胞+法舒地尔组RhoA蛋白表达水平较梗死组、干细胞组显著降低(P<0.05).病理观察干细胞组和联合组心肌修复优于梗死组,干细胞+法舒地尔组较干细胞组明显.结果表明单纯骨髓问充质干细胞移植以及法舒地尔联合骨髓间充质干细胞移植均可改善心肌梗死大鼠心功能,减少心室扩张程度,两者联合情况下效果最佳,对心肌梗死具有协同治疗作用.     

骨髓间充质干细胞与丹酚酸B预处理内皮祖细胞共移植对急性心肌梗死大鼠心功能及分化基因表达的影响

背景:由于心肌细胞自身增殖能力有限,急性心肌梗死后细胞移植是目前流行的再生心肌方法.骨髓间充质干细胞的存活受心肌微环境的影响,而内皮祖细胞参与血管新生,可为骨髓间充质干细胞提供微环境. 目的:探讨骨髓间充质干细胞联合中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植后,对急性心肌梗死大鼠心功能改善及骨髓间充质干细胞分化早期基因表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-03在天津中医药大学完成.材料:清洁级雄性Wistar大鼠45只,由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供.丹酚酸B为天津天士力现代中药资源有限公司产品,批号 20060601.方法:分别取2只和1只大鼠,采用密度梯度离心法+贴壁筛选法分离培养纯化内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞.剩余42只大鼠随机分为4组:假手术组9只、模型组11只、骨髓间充质干细胞组12只、共移植组10只.假手术组只开胸穿线,不结扎左冠状动脉;其余3组结扎左冠状动脉建立心肌梗死模型.结扎冠状动脉15 min后再次开胸,共移植组吸取骨髓间充质干细胞悬液250 μL(浓度1×1010L-1)+8mg/L丹酚酸B预处理的内皮祖细胞悬液250 μL(浓度1×108L-1),于结扎区附近心肌组织分5点注射:骨髓间充质干细胞组同法注射单纯骨髓间充质干细胞悬液500μL,模型组注射等量细胞培养液.主要观察指标:采用超声心动仪测定左室功能,Real-time PCR检测心肌分化基因Nkx2.5,GATA-4的表达.结果:细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组左室结构有改善趋势,但差异无显著性意义(P>0.05);共移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度均明显改善(P＜0.05),心室收缩功能指标射血分数、心输出量均明显改善(P<0.05).细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组、共移植组Nkx2.5及GATA-4 mRNA表达均明显增加,且共移植组Nkx2.5 mRNA增加幅度明显大于骨髓间充质干细胞组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞联合丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植方式,可上调骨髓间充质干细胞向心肌分化过程中Nkx2.5,GATA-4基因的表达,改善急性心肌梗死大鼠心室结构,增强心功能.     

超极化激活环化核苷酸门控通道基因转染猪骨髓间充质干细胞

背景:研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用.目的:观察HCN2基因重组腺病毒转染后猪骨髓间充质干细胞目的基因的表达及电生理特征.设计、时间及地点:细胞一基因学体外观察,于2007-07/2008-03在解放军第二军医大学胸心外科实验室完成.材料:Yorkshire猪由解放军第二军医大学动物所提供,HCN2质粒由意大利Dario DiFrancesco教授惠赠,重组腺病毒Ad.HCN2由本实验室采用Ad5系统构建并保存.方法:Percoll密度梯度离心+贴壁法体外分离纯化猪骨髓间充质干细胞,以感染复数=50进行Ad.HCN2转染,同时设立未转染组和转染Ad.Null组.主要观察指标:通过RT-PCR、免疫荧光染色检测各组细胞HCN2 mRNA和蛋白的表达,用全细胞膜片钳检测各组细胞电生理学变化.结果:未转染组和转染Ad.Null组均未见扩增片段,而Ad.HCN2扩增后在250-500 bp可见扩增片段,与携带HCN2基因的质粒扩增出的片段位置相同.转染后细胞核染色强度明显弱于胞膜和胞浆,与HCN2蛋白的分布相符合,未转染组及转染Ad.Null组无HCN2蛋白阳性表达.全细胞膜片钳可记录到起搏电流,其激活电位约为-60 mV,完全激活电位-140 mV,呈电压依赖性,当给予4 mmol/L CsCI后,内向的起搏电流即被明显抑制:未转染组及转染Ad.Null组细胞均无起搏电流.结论:通过起搏基因HCN2重组腺病毒载体可成功转染猪骨髓间充质干细胞,使其能够表达HCN2通道蛋白,全细胞膜片钳可检测到起搏电流.     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.     

Functional reclassification of variants of uncertain significance in the HCN4 gene identified in sudden unexpected death

The HCN4 gene encodes a subunit of the hyperpolarization‐activated cyclic nucleotide‐gated channel, type 4 that is essential for the proper generation of pacemaker potentials in the sinoatrial node. The HCN4 gene is often present in targeted genetic testing panels for various cardiac conduction system disorders and there are several reports of HCN4 variants associated with conduction disorders. Here, we report the in vitro functional characterization of four rare variants of uncertain significance (VUS) in HCN4, identified through testing a cohort of 296 sudden unexpected natural deaths. The variants are all missense alterations, leading to single amino acid changes: p.E66Q in the N‐terminus, p.D546N in the C‐linker domain, and both p.S935Y and p.R1044Q in the C‐terminus distal to the CNBD. We also identified a likely benign variant, p. P1063T, which has a high minor allele frequency in the gnomAD, which is utilized here as a negative control. Three of the HCN4 VUS (p.E66Q, p.S935Y, and p.R1044Q) had electrophysiological characteristics similar to the wild‐type channel, suggesting that these variants are benign. In contrast, the p.D546N variant in the C‐linker domain exhibited a larger current density, slower activation, and was unresponsive to cyclic adenosine monophosphate (cAMP) compared to wild‐type. With functional assays, we reclassified three rare HCN4 VUS to likely benign variants, eliminating the necessity for costly and time‐consuming further study. Our studies also provide a new lead to investigate how a VUS located in the C‐linker connecting the pore to the cAMP binding domain may affect the channel open state probability and cAMP response.     

HCN2 channels account for mechanical (but not heat) hyperalgesia during long-standing inflammation

There is emerging evidence that hyperpolarization-activated cation (HCN) channels are involved in the development of pathological pain, including allodynia and hyperalgesia. Mice lacking the HCN isoform 2 display reduced heat but unchanged mechanical pain behavior, as recently shown in preclinical models of acute inflammatory pain. However, the impact of HCN2 to chronic pain conditions is less clear and has not been examined so far. In this report, we study the role of HCN2 in the complete Freund’s adjuvant inflammation model reflecting chronic pain conditions. We used sensory neuron–specific as well as inducible global HCN2 mutants analyzing pain behavior in persistent inflammation and complemented this by region-specific administration of an HCN channel blocker. Our results demonstrate that the absence of HCN2 in primary sensory neurons reduces tactile hypersensitivity in chronic inflammatory conditions but leaves heat hypersensitivity unaffected. This result is in remarkable contrast to the recently described role of HCN2 in acute inflammatory conditions. We show that chronic inflammation results in an increased expression of HCN2 and causes sensitization in peripheral and spinal terminals of the pain transduction pathway. The contribution of HCN2 to peripheral sensitization mechanisms was further supported by single-fiber recordings from isolated skin–nerve preparations and by conduction velocity measurements of saphenous nerve preparations. Global HCN2 mutants revealed that heat hypersensitivity—unaffected in peripheral HCN2 mutants—was diminished by the additional disruption of central HCN2 channels, suggesting that thermal hyperalgesia under chronic inflammatory conditions is mediated by HCN2 channels beyond primary sensory afferents.     

HCN4基因体外转染大鼠MSCs建立起搏离子通道

目的：通过构建HCN4腺病毒载体,以大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）为基因转染的平台,观察HCN4外源基因对MSCs转染效果及其功能表达。方法：携带HCN4腺病毒载体体外转染MSCs,测定转染效率,免疫荧光法测定HCN4蛋白表达,膜片钳全细胞记录If电流。结果：携带HCN4腺病毒载体体外转染MSCs后可检测到HCN4蛋白及If电流表达。结论：携带HCN4腺病毒载体转染大鼠MSCs后可使MSCs表达HCN4蛋白及If电流,可为生物心脏起搏治疗提供合适的靶基因及种子细胞。     

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠坐骨神经挤压伤

背景:骨髓间充质干细胞体外分离培养方便,细胞免疫原性低,更适合于细胞移植,已有证实其在神经缺损修复方面具有较大的应用潜力.目的:明确体外培养的骨髓间充质干细胞体内移植后,促进大鼠周围神经损伤修复的可行性,并初步探讨其可能的作用机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/2007-03在吉林大学公共卫生学院毒理教研室完成.材料:选取健康雌性Wistar大鼠50只,鼠龄2个月;另选取出生1周的雌性Wistar大鼠6只用于制备骨髓间充质干细胞;实验用兔抗NGF单克隆抗体为Santa Cruz公司产品.方法:①采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,传至第3代,于移植前48 h加入BrdU进行标记.②取50只健康Wistar大鼠,利用钳夹法建立坐骨神经挤压伤模型后随机分为细胞移植组和对照组,每组25只,移植组将BrdU标记的骨髓间充质干细胞移植到神经损伤处,而对照组注入等量的DMEM.主要观察指标:①术后1,2,4,6周取移植组损伤段神经进行抗BrdU染色.②术后1,2,4,6周对两组损伤远端神经进行神经生长因子免疫组化染色,图像分析软件分析阳性表达的积分吸光度.③术后每周进行步态分析测量坐骨神经功能指数,术后6周测量再生神经传导速度、坚牢蓝染色后计数有髓神经纤维数目和内径、测量大鼠实验侧腓肠肌湿重和肌纤维横截面积.结果:全部50只实验大鼠均进入结果分析.①术后1,2,4周在细胞移植组神经损伤处可以检测到BrdU阳性细胞.②术后1和2周细胞移植组神经生长因子蛋白表达积分吸光度值均高于对照组,差异有显著性意义(P<0.01);而术后4,6周差异则无显著性意义(P>0.05).⑨术后3～6周细胞移植组坐各神经功能指数的恢复要优于对照组:术后6周细胞移植组大鼠的神经传导速度、有髓神经纤维计数和直径、腓肠肌湿重和横截面积均高于/大于对照组,差异有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:体外培养的骨髓间充质干细胞可进行体内移植,移植后能在局部损伤微环境中发挥作用,促进周围神经损伤修复,提高早期神经生长因子表达是其机制之一.     

骨髓间充质干细胞体外诱导培养后的电生理特性

背景:骨髓间充质干细胞在宿主心肌中能够生长,并可在心肌环境诱导下分化,改善心脏功能,但目前骨髓干细胞分化过程中生物学特性尚不甚清楚.目的:观察经5-氮胞苷诱导培养后,骨髓间充质干细胞体外缝隙连接蛋白43的表达及电生理特性变化.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2009-02在河北省人民医院心脏中心完成.材料;2月龄雄性冀中自猪24只,购自河北医科大学实验动物中心.方法:无菌条件下抽取猪双侧股骨骨髓,Percoll密度梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞,传至第2代后,加入10μmol/L的5-氮胞苷,24 h后更换为不含诱导剂的DMEM培养基继续培养,分别于诱导后1,2,3周进行指标检测;并设立未经5-氮胞苷诱导的对照组.实验猪抽取骨髓后麻醉,取心室肌,组织块酶消化法分离培养正常心室肌细胞.主要观察指标:ABC法免疫细胞化学染色检测缝隙连接蛋白43的表达,以膜片钳全细胞记录模式测定Ito电流密度及动作电位.结果:5-氮胞苷诱导后1,2周,部分骨髓间充质干细胞表达缝隙连接蛋白43,呈核周散在分布的棕黄色颗粒;诱导后3 周缝隙连接蛋白43阳性率为95%,细胞密度大的区域出现类似正常心肌的闰盘结构.在+80 mV时与正常心室肌细胞比较,未诱导对照组及诱导1,2周的骨髓间充质干细胞k电流密度均明显降低(P<0.05),诱导3周的骨髓间充质干细胞Ito电流密度升高至正常心室肌细胞水平(P>0.05).5-氮胞苷诱导1,2周的骨髓间充质干细胞未能检测到动作电位,诱导3周后可检测到动作电位,与正常心室肌细胞相似.结论:骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷体外诱导3周后,与正常心肌具有相似的缝隙连接蛋白43表达能力及电生理特性.