miR-20a-5p调控成骨细胞分化相关靶基因的筛选及靶向关系验证

目的:筛选miR-20a-5p调控成骨分化的靶基因,深入研究miR-20a-5p调控成骨分化的分子机制。方法:通过靶基因预测软件预测miR-20a-5p的靶基因,将靶基因的3′UTR及点突变序列插入荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）报告载体中,并与miR-20a-5p的模拟物或阴性对照共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶实验和GFP抑制实验检测荧光素酶活性及GFP阳性细胞比例,确定miR-20a-5p与靶基因的靶向关系。结果:通过生物信息学预测到Smad7是miR-20a-5p的靶基因,miR-20a-5p在不同物种的Smad7基因3′UTR区都有保守的结合种子序列;荧光素酶、GFP报告基因及点突变载体经PCR及测序鉴定均正确;双荧光素酶活性检测结果显示:miR-20a-5p显著降低Smad7 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性;GFP抑制实验及流式细胞仪检测结果显示:miR-20a-5p可以显著降低GFP阳性细胞的比例。结论:miR-20a-5p可以直接靶作用于Smad7 3′UTR的种子序列,提示其可能通过直接靶向Smad7基因来发挥促进成骨分化的调控作用。     

miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控人骨髓间充质干细胞成骨分化且促进骨质疏松

目的:探讨miRNA-338-3p在骨质疏松症进展中的作用及其对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响.方法:选择60例骨质疏松症患者为研究对象,另选同期60名非骨质疏松者作为对照组.检测两组血清miR-338-3p表达水平.采用RT-qPCR检测miR-338-3p、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)水平.Western blot检测miR-338-3p对RUNX2蛋白表达的影响;采用碱性磷酸酶(ALP)测定法和茜素红染色评估miR-338-3p和RUNX2对成骨分化和矿化能力的影响;采用生物信息学和荧光素酶报告基因检测验证miR-338-3p和RUNX2之间的关系.结果:骨质疏松患者血清miR-338-3p水平相比对照组表达量明显上升(P<0.05),且其表达随着成骨诱导时间的延长而逐渐降低(P<0.05).与对照组比较,miR-338-3p表达情况影响OCN、OPN和Collagen Ⅰ mRNA的水平(P<0.05).与对照组相比,miR-338-3p过表达削弱了hBMSCs矿化能力和ALP活性(P<0.05).双荧光素酶报告基因检测证实,RUNX2是miR-338-3p的直接靶点,miR-338-3p过表达降低了RUNX2蛋白及其mRNA的表达水平(P<0.05).RUNX2过表达可逆转miR-338-3p对hBMSCs成骨分化的抑制作用.结论:miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控hBMSCs的成骨分化,从而促进骨质疏松的进展.     

lncRNA HOTAIR/miR-17-5p/Smad7通路调控激素性股骨头坏死的机制研究

目的 研究lncRNA HOTAIR对激素性股骨头坏死(steroidinduced necrosis of femoral head,SONFH)的影响。方法收集激素性股骨头坏死患者骨髓组织25例,正常对照组为25例股骨颈骨折患者。培养人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),用地塞米松(DEX)培养,CCK-8测定细胞增殖。用HOTAIR过表达载体或miR-17-5p模拟物转染细胞。hBMSCs分为hBMSCs组、hBMSCs+成骨诱导组、hBMSCs+成骨诱导+空载组、hBMSCs+成骨诱导+过表达HOTAIR组、hBMSCs+成脂诱导组、hBMSCs+成脂诱导+空载组和hBMSCs+成脂诱导+过表达HOTAIR组。RT-qPCR测HOTAIR、miR-17-5p、Smad7、RUNX2、RRAR-γ的mRNA 表达。Western blot法检测 Smad7蛋白的表达。双荧光素酶报告基因测法确认HOTAIR和miR-17-5p间的结合。碱性磷酸酶(ALP)活力检测试剂盒与茜素红染色评估细胞的成骨分化;油红O染色评估细胞的成脂分化。结果 HOTAIR和 Smad7在激素性股骨头坏死组织中表达上调,而miR-17-5p表达下调(P均＜0.05)。双荧光素酶报告实验证实hBMSCs中HOTAIR的直接结合靶点是miR-17-5p,而 Smad7是miR-17-5p的靶基因。HOTAIR的过表达诱导了hBMSCs的成脂分化和RRAR-γ表达,并抑制了成骨分化和RUNX2表达(P均＜0.05)。结论 过表达lncRNA HOTAIR直接靶向miR-17-5p并抑制hBMSCs的成骨分化,还能够促进成脂分化和 Smad7的表达。     

miR-129-5p调控MC3T3-E1细胞成骨分化的体外研究

背景 微小RNA(microRNA,miR)是一种非编码的小分子化合物,在成骨分化等生命过程中发挥重要调控作用.目的 探讨miR-129-5p对小鼠成骨前体细胞(preosteoblast cell line,MC3T3-E1)成骨分化功能的影响及相关作用机制.方法 体外培养MC3T3-E1细胞后,分别转染慢病毒载体(miR-control、miR-129-5p mimic和miR-129-5p inhibitor),以过表达或敲低细胞miR-129-5p水平.成骨诱导分化培养细胞后,使用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色试剂盒检测碱性磷酸酶的活性,茜素红(alizarin red staining,ARS)染色观察钙结节形成情况,以检测细胞成骨分化水平.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法和Western blot法检测成骨分化基因Runx2和OCN的mRNA及蛋白表达水平.生物信息学方法预测miR-129-5p靶基因,并用双荧光素酶基因报告实验验证.结果 转染慢病毒载体的MC3T3-E1细胞进行成骨诱导分化后,与miR-control组相比,转染miR-129-5p mimic的MC3T3-E1细胞7 d后碱性磷酸酶染色增强,成骨早期标志物Runx2表达增加,14 d后成骨晚期标志物OCN表达升高,21 d后茜素红染色显示钙化结节较大且量多(P<0.05).而转染miR-129-5p inhibitor慢病毒的MC3T3-E1细胞与miR-control组相比,碱性磷酸酶活性低,钙结节较小且少,成骨标志物Runx2和OCN表达下降(P<0.05).通过Targetscan网站(生物信息分析)预测miR-129-5p的靶基因为BMP通路负向调控蛋白Smad6;双荧光素酶报告实验验证Smad6为靶基因,过表达miR-129-5p后Smad6蛋白表达水平下调.结论 miR-129-5p通过靶向抑制Smad6的表达对MC3T3-E1细胞成骨分化产生促进作用.     

miR-106b靶向调控胰岛素分泌细胞诱导分化过程中Ngn3基因的表达

目的实现骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,bMSCs）向胰岛素分泌细胞（insulin—producingcells,IPCs）的诱导分化并验证分化过程中miR-106b靶向调控Ngn3基因表达。方法首先,分离培养bMSCs,应用活化素A（activinA）和B细胞素（betacellulin）将其诱导分化为IPCs。然后,采用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-106b和Ngn3基因的靶向匹配关系进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定。qRT—PCR检测诱导分化过程中miR-106b和Ngn3的表达。结果诱导分化后的细胞双硫腙染色呈猩红色,免疫荧光化学显示有胰岛素表达。生物信息学方法预测发现miR-106b和Ngn3基因二者匹配良好,通过双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-106b能结合到Ngn3mRNA的3’UTR并有效抑制其表达。qRT—PCR检测结果表明,miR-106b的表达水平与Ngn3表达呈负相关。结论miR-106b能调控IPCs诱导分化过程中Ngn3的表达。     

miR-34b促进关节软骨细胞基质退变的分子机制研究

目的探讨微小RNA-34b（miR-34b）促进关节软骨细胞基质退变的分子机制。方法提取10例骨关节炎（OA）患者和7例创伤性截肢者的膝关节软骨组织,实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测组织标本中miR-34b表达水平。利用Targetscan基因信息软件预测得到miR-34b靶基因为Smad3,构建Smad3野生型及突变型3′非编码区（3′-UTR）-荧光素酶报告载体,利用荧光素酶报告基因实验检测miR-34b对Smad3基因野生型及突变型3′-UTR荧光素酶活性的影响。体外培养SW1353细胞,分为A、B、C和D组,分别加入等量脂质体、无义序列、miR-34b模拟物（miR-34bmimic）和miR-34b抑制物（miR-34binhibitor）。RT-qPCR法检测miR-34b、Smad3、Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的表达水平。结果OA软骨组织中miR-34b表达水平较正常膝关节软骨组织明显上调（P＜0.05）。SW1353细胞转染后,与A组比较,C组miR-34b表达水平明显升高（P＜0.05）,D组明显降低（P＜0.05）;A组与B组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。TargetsCan软件预测miR-34b的潜在靶基因为Smad3,荧光素酶报告基因实验证实miR-34b直接靶向抑制靶基因Smad3;转染miR-34bmimic和miR-34inhibitor后,与A组比较,C组Smad3mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,D组明显升高（P＜0.05）;A组与B组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后,与A组比较,C组Ⅱ型胶原mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,D组明显升高（P＜0.05）;C组MMP-13mRNA明显升高（P＜0.05）,D组明显降低（P＜0.05）。结论miR-34b可能通过抑制其靶基因Smad3的表达进而诱导人关节软骨细胞基质退变,从而促进OA的发生、发展。     

miR-133a调控RUNX2/BMP2信号通路参与激素性股骨头坏死的机制

目的 探讨微RNA (miR)-133a调控生长相关转录因子2 (RUNX2)/骨形态蛋白2 (BMP2)信号通路参与激素性股骨头坏死（SONFH）的机制。方法 收集本院接受髋关节置换SONFH患者（SONFH组）骨髓及股骨颈骨折不愈合患者（对照组）骨髓，提取骨髓间充质干细胞（BMSCs），经表型鉴定、成骨、成脂分化鉴定后检测BMSCs miR-133a、RUNX2 mRNA和蛋白表达水平，双荧光素酶鉴定miR-133a与RUNX2的靶向关系。实验分组包括对照组、SONFH组、抑制剂对照组（inhibitor con组）、miR-133a抑制剂组（miR-133a inhibitor组）、miR-133a inhibitor+si-RUNX2组。实时定量PCR (RT-qPCR)检测细胞中miR-133a、RUNX2 mRNA水平；Western blotting检测BMSCs中RUNX2、BMP2、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）蛋白水平；CCK-8检测细胞增殖情况；茜素红染色鉴定细胞矿化能力。结果 BMSCs细胞表型鉴定结果显示，细胞表面CD71、CD44表达，CD34...     

miR-125a/TRAF6调控通路在破骨细胞分化中的作用研究

目的研究miR-125a在破骨细胞分化过程中的作用及其作用机制,方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)+PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)⁺PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)+PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6),TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信号转导通路的转录因子,过表达miR-125a降低了TRAF6的蛋白表达水平,而TRAF6的mRNA水平无明显改变。结论 miR-125a通过作用于新的FRAF6/NFATC1/miR-125a负反馈调控环路在破骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用,调控miR-125a的表达可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。     

miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对MC3T3-E1细胞成骨分化及增殖的影响

目的研究miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化与增殖的影响。方法收集脆性骨折患者外周血,采用荧光定量PCR检测患者miR-363、矮小相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、连环蛋白β1(CTNNB1)和骨髓细胞瘤癌基因(MYC)表达。采用茜素红S染色与噻唑蓝检测过表达miR-363对细胞成骨分化及增殖的影响。采用双荧光素酶报告基因与Western blotting检测miR-363对Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的调控作用。结果miR-363在脆性骨折患者外周血中的表达水平低于正常健康者,而术后1周、2周及4周外周血中的表达水平高于术前并呈上调趋势(P＜0.05)；模拟物组MC3T3-E1细胞中miR-363表达水平高于阴性对照组(P＜0.05)；模拟物组MC3T3-E1细胞矿化程度、RUNX2及OCN mRNA表达水平及1天、2天、3天光密度(OD)值高于阴性对照组(P＜0.05)；DKK1是miR-363的靶基因,模拟物组MC3T3-E1细胞中DKK1蛋白表达水平低于阴性对照组,而CCND1、CTNNB1及MYC mRNA表达水平高于阴性对照组(P＜0.05)。结论miR-363可能通过调控靶基因DKK1与Wnt/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化与增殖。     

miR-25/TWIST1调控通路在成骨细胞矿化中的作用研究

目的探究miR-25在成骨细胞分化过程中的作用及其作用机制。方法β-甘油磷酸(β-glycerophosphate,β-GP)和抗坏血酸(aseorbic acid)诱导成骨细胞矿化,茜素红(Alizarin Red S)染色实验观察成骨细胞的矿化情况。生物信息学运算预测miR-25的靶基因。实时定量PCR法检测miR-25以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制实验用于研究miR-25在成骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-25与其靶基因之间的结合。结果 miR-25的表达随成骨分化过程而逐渐升高。过表达miR125通过转录后调控其靶基因TWIST1的表达来促进成骨分化。作为调控成骨细胞分化的的转录因子,扭曲基础螺旋—环—螺旋蛋白1(TWIST1)是miR-25的靶基因。结论 miR-125通过作用于靶基因TWIST1在成骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用,表明调控miR-25的表达,可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。     

miR-186靶向调控骨桥蛋白基因表达对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨miR-186对骨髓间充质干细胞(bMSCs)成骨向诱导分化过程中骨桥蛋白(OPN)基因的靶向作用及其对bMSCs成骨分化的影响.方法:分离培养bMSCs,应用骨形成蛋白2成骨向诱导分化并采用碱性磷酸酶染色和Von-kossa染色鉴定;运用生物信息学方法对miR-186和OPN基因的靶向配对关系进行预测,采用荧光素酶报告系统鉴定;脂质体2000转染miR-186模拟物以及干扰OPN基因的siRNA后,Real-time PCR检测miR-186和OPN mRNA的表达,Western blot检测OPN蛋白的表达.结果:光镜下可见bMSCs均匀分布,诱导分化后的细胞碱性磷酸酶染色呈蓝色.生物信息学软件TargetScan和miRanda显示miR-186和OPN基因二者靶向配对良好,荧光素酶报告系统进一步验证发现,miR-186能够抑制OPN mRNA表达.Real-time PCR和Western blot检测结果表明过表达miR-186能够降低OPN mRNA和蛋白的表达.结论:miR-186通过下调bMSCs成骨向诱导分化过程中OPN基因表达进而抑制bMSCs的成骨分化.     

miR-144-3p在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达及其靶向调控作用

目的探讨在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,miR-144-3p表达的生理功能和作用机制,并预测其靶基因,为成骨细胞 分化的深入研究提供实验依据。方法采用大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并在体外诱导间充质干细的成骨分化,通过 qRT-PCR 检测成骨分化标志基因（Runx2, OCN）以及miR-144-3p 的表达;通过向BMSCs 株转染miR-144-3p mimic 以及 miR-144-3p inhibitor,检测miR-144-3p 表达对BMSCs分化的影响,并通过Western blot 以及qRT-PCR检测miR-144-3p 靶蛋 白在RNA水平以及蛋白水平的表达变化。结果在体外诱导BMSCs成骨分化过程中,成骨分化标志基因（Runx2, OCN）的 表达量逐渐升髙,而miR-144-3p 的表达量则逐渐降低,到诱导成骨第21 天表达水平最低;检测各组ALP活性发现,相比于 对照组miR-144-3p mimics 转染组ALP活性显著降低（P<0.05）,miR-144-3p inhibitor 转染组ALP活性显著升高（P<0.05）;运 用多种靶基因预测数据库TargetScan、microRNA.org和miRanda对miR-144-3p进行靶基因的预测分析发现,smad4最可能是 miR-144-3p的靶基因;qRT-PCR结果表明,smad4在各组中的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;Western blot结果显示,smad4 在miR-144-3p mimics转染组表达显著下降,在miR-144-3p inhibitor转染组则显著升高,相比于对照组差异均有统计学意义（P< 0.05）。结论miR-144-3p参与调控大鼠BMSCs成骨分化,其抑制成骨分化的功能是通过降低smad4转录后的表达水平来实现。     

miR-199a-3p靶向Smad1促进小鼠心肌纤维化相关基因的表达

目的探讨微小RNA-199a-3p（miR-199a-3p）对心肌纤维化的调控作用及其作用靶基因。方法原代分离并体外培养成体 C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞;脂质体转染法将miR-199a-3p模拟物和Smad1 siRNA瞬时转染至小鼠心肌成纤维细胞;双荧光 素酶报告基因实验检测miR-199a-3p与潜在靶基因Smad1 3’端非翻译区（3’-UTR）的结合作用;实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和 Western blot 法分别检测小鼠心肌成纤维细胞转染miR-199a-3p 后,Smad1 及纤维化相关基因表达。Western blot 检测转染 miR-199a-3p,Smad1 siRNA 后,小鼠心肌成纤维细胞中纤维化相关基因、Smad1 和Smad3 的激活水平。结果RT-qPCR 和 Western blot结果证实在心肌成纤维细胞中过表达miR-199a-3p可以增强纤维化相关基因表达。双荧光素酶报告基因实验显示 miR-199a-3p 与Smad1 3’-UTR有结合作用。RT-qPCR和Western blot 结果证实miR-199a-3p 可在转录水平抑制Smad1 表达。 过表达miR-199a-3p和沉默Smad1均能一致性的通过激活Smad3通路而促进心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达。结论 miR-199a-3p通过靶向Smad1,从而激活Smad3通路来促进纤维化相关基因表达。     

雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）/Smad通路在雷奈酸锶（Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞
过程中的作用。方法体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2 的拮抗剂noggin 及Smad1 小干扰
RNA（SiRNA）。酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runt
相关转录因子-2（Runx2）蛋白的表达。结果应用0.1~10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1 h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增
高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h能抑制Sr对磷酸化
Smad1/5/8表达的上调作用;应用0.1~5 mmol/L Sr处理细胞6 h后,细胞内Runx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到
高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smad1 SiRNA转染细胞后能下调Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表
达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。
     

Wild-type Smad3 Gene Enhances the Osteoblastic Differentiation of Rat Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells in Vitro

This study examined the effect of wild-type Smad3 gene on the osteoblastic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells （MSCs） were stably transfected with the complexes of PeDNA3.0-Myc-Smad3 or PeDNA3.0- Mye-Smad3△C and Lipofectamine reagent. Immunofluorescence staining was performed to evaluate the c- Myc signal in MSCs. The cell proliferation was detected by MTT method. To clarify the osteoblastic characteristics in stably transfected MSCs, alkaline phosphatase （ALP） mRNA and core binding factor α1 （Cbfal） mRNA were investigated by RT-PCR, and ALP activity and mineralization were examined by p-nitrophenolphosphate method and alizarin red staining respectively. PD98059, a specific inhibitor of the ERK signaling pathway, was used to determine the role of ERK in Smad3MSCs osteoblastic differentiation, c-Myc signal was detected in Smad3-MSCs and Smad3△C- MSCs. The proliferation of Smad3-MSCs was slower than that of Smad3/△C-MSCs or V-MSCs. The relative levels of ALP mRNA and Chfal mRNA in Smad3-MSCs, as well as ALP activity and mineralization, were markedly higher than those in Smad3/△C-MSCs or V-MSCs. Although ALP activity and mineralization were slightly lower in Smad3-MSCs.treated with PD98059 than in those without PD98059 treatment, no significant difference was found between them （P〉0.05）. It is concluded that the wild-type Smad3 gene, which is a crucial component promoting bone formation, can inhibit the proliferation of MSCs and enhance the osteoblastic differentiation of uncommitted MSCs and the maturation of committed MSCs independent of the ERK signaling pathway.     

miR-128a在肝细胞癌中表达上调并通过靶向调控RND3 促进肝癌细胞增殖

目的检测MicroRNA-128a（miR-128a）在肝细胞癌中的表达情况并探讨其在肝癌细胞中的生物学功能及机制。方法收
集19例肝细胞癌及对应癌旁组织,运用qRT-PCR技术检测miR-128a 在肝细胞癌和对应癌旁组织及肝癌细胞株中的表达;应用
miR-128a mimics或inhibitor转染人肝癌细胞,MTT检测转染后细胞增殖活力变化;软件预测miR-128a的潜在靶点RND3,并用
双荧光素酶报告实验证实miR-128a与RND3 3’UTR结合,qRT-PCR和Western blot检测miR-128a潜在靶点RND3的表达变化;
Western blot检测细胞周期蛋白变化。结果在肝细胞癌组织中miR-128a的表达显著高于对应的癌旁组织（P<0.05）;miR-128a
促进肝癌细胞增殖（P<0.05）;在肝癌细胞中miR-128a通过与RND3 3’URT结合下调RND3 mRNA和蛋白的表达（P<0.05）;抑
制miR-128a的表达可以导致cyclin B1、cyclin D1 和CDK4表达下调。结论miR-128a在肝细胞癌中表达上调并通过靶向调控
RND3促进肝癌细胞增殖。
     

miR-181c靶向己糖激酶2抑制癌相关成纤维细胞的糖酵解

目的探讨miR-181c在癌相关成纤维细胞（CAFs）糖酵解中的作用和机制。方法用组织贴壁法分离原代肺腺癌病人肺组
织CAF 及肺正常成纤维细胞（NFs）。用LipofectamineTM 2000 转染miR-181c mimics,miR-181c inhibitor,siRNA-HK2 和
HK2-vecto等;Q-PCR检测miR-181家族表达水平;Western blotting检测己糖激酶2（HK2）蛋白表达;2-NBDG法检测细胞葡萄
糖摄取率;DRY-CHEM FCD3500仪器检测细胞上清中乳酸生成;双荧光素酶报告基因系统检测HK2 mRNA表达。结果在细
胞形态上CAFs与NFs无明显区别。与NFs组相比,CAFs组葡萄糖摄取、乳酸生成和HK2蛋白表达明显增加,而miR-181家族
表达明显减少（P<0.05）。在NFs 转染inhibitor-181c 后,其HK2 蛋白表达、葡萄糖摄取和乳酸生成明显增加（P<0.05）;相反,
CAFs转染了mimics-181c后,其HK2蛋白表达、葡萄糖摄取和乳酸生成明显减少（P<0.05）。并且在敲低HK2细胞的CAFs中,
mimics-181c 不能减少葡萄糖摄取和乳酸生成;而mimics-181c 可以减少过表达HK2 对NFs葡萄糖摄取和乳酸生成的增强作
用。结论mir-181c可以通过抑制HK2的蛋白表达来抑制CAFs的糖酵解。