血小板第4因子对脐血CD_(34)~+细胞黏附功能的影响

目的　研究血小板第 4因子 (PF4 )对新鲜脐血CD34+ 细胞及扩增后脐血CD34+ 细胞黏附功能的影响 ;PF4对脐血CD34+ 细胞上的黏附分子CD4 9d及基质细胞趋化因子 (SDF 1)受体CXCR4的作用。方法　采用免疫磁珠法 (MACS)分选CD34+ 细胞 ,结晶紫染色测定细胞总黏附性 ,免疫荧光标记流式细胞仪测定CD4 9d及CXCR4的表达。结果　①PF4可使新鲜脐血CD34 + 细胞总黏附性提高 ,且与剂量相关。②SDF 110 0ng ml可使脐血CD34+ 细胞总黏附性提高。③脐血CD34+ 细胞扩增 10d后未加PF4刺激的自发以及经SDF 1诱导的黏附功能开始下降 ,在扩增脐血CD34+ 细胞不同时间段加入 10 0ng mlPF4 ,脐血CD34 + 细胞对基质层的黏附能力始终保持较高水平 ,以 0天时脐血CD34 + 细胞黏附性为10 0 % ,扩增 14d时脐血CD34+ 细胞黏附性PF4组为 (2 6 2 .0 4± 6 4 .81) % ,同期对照组为 (6 4 .35±8 2 9) % ,经SDF 1诱导下扩增 14d的CD34+ 细胞的总黏附性PF4组为 (138.31± 32 .39) % ,同期对照组为 (6 7.6 6± 12 .4 4 ) %。④PF4 10 0ng ml作用于CD34 + 细胞时 ,CD4 9d 表达增长 13.0 2 % ,CXCR4表达增长17 33%。结论　PF4可使新鲜及扩增后的脐血CD34+ 细胞黏附功能增强 ,并促进CD4 9d及CXCR4的表达 ,提示PF4可能有助于脐血干细胞的归巢。     

血小板第4因子对脐血CD34+细胞黏附功能的影响

目的研究血小板第4因子(PF4)对新鲜脐血CD34+细胞及扩增后脐血CD34+细胞黏附功能的影响;PF4对脐血CD34+细胞上的黏附分子CD49d及基质细胞趋化因子(SDF-1)受体CXCR4的作用.方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34+细胞,结晶紫染色测定细胞总黏附性,免疫荧光标记流式细胞仪测定CD49d及CXCR4的表达.结果①PF4 可使新鲜脐血CD34+细胞总黏附性提高,且与剂量相关.②SDF-1 100 ng/ml可使脐血CD34+细胞总黏附性提高.③脐血CD34+细胞扩增10 d后未加PF4刺激的自发以及经SDF-1诱导的黏附功能开始下降,在扩增脐血CD34+细胞不同时间段加入100ng/ml PF4,脐血CD34+细胞对基质层的黏附能力始终保持较高水平,以0天时脐血CD34+细胞黏附性为100%,扩增14 d时脐血CD34+细胞黏附性PF4组为(262.04±64.81)%,同期对照组为(64.35±8.29)%,经SDF-1诱导下扩增14 d的CD34+细胞的总黏附性PF4组为(138.31±32.39)%,同期对照组为(67.66±12.44)%.④PF4 100 ng/ml作用于CD34+细胞时,CD49d表达增长13.02%,CXCR4表达增长17.33%.结论 PF4可使新鲜及扩增后的脐血CD34+细胞黏附功能增强,并促进CD49d及CXCR4的表达,提示PF4可能有助于脐血干细胞的归巢.     

间充质干细胞对脐血CD34^＋细胞扩增及其细胞特性变化的影响

本研究探讨脐带间充质干细胞（MSC）对CD34^＋细胞（HSPC）体外扩增的支持作用及对CD34^＋细胞表面标志、归巢黏附分子、集落形成能力等干细胞特征变化的影响。用免疫磁珠法从新鲜分离的脐血单个核细胞分离CD34^＋造血干祖细胞（HSPC）；用MSC饲养层（feeder）制备经^137Cs照射的间充质干细胞饲养细胞（MSC feeder cells）。将CD34^＋细胞接种在不同的培养体系中，实验分为3组：HSPC＋CK组为培养液中加入细胞因子组合（SCF、FL和TPO），HSPC＋MSC组为CD34^＋细胞接种在MSC feeder上，HSPC＋MSC＋CK组同时加入细胞因子组合及MSC饲养细胞。培养后4、7、10、14天计数有核细胞总数（MNC），计算细胞扩增情况；用流式细胞术检测不同处理组间CD34^＋细胞及亚群免疫表型、归巢黏附分子和集落形成能力。结果表明：在2周的培养时间里，3组MNC和CD34^＋细胞均明显增加，MNC扩增数依次HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组〉HSPC＋MSC组。体外扩增10天内HSPC＋MSC＋CK组MNC得到大量的扩增，同时CD34^＋细胞的扩增亦较高。培养4天3组细胞CD34^＋比例较0天有明显下降（P〈0．01）；扩增后CD34^＋细胞比例：HSPC＋MSC组〉HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组（P〈0．01）；各组CD34^＋细胞亚型细胞比例有所不同，HSPC＋CK组4天时CD34^＋CD38^-细胞有一过性升高（62．71％），之后迅速降低，7天时为0．05％；HSPC＋MSC组7天时CD34^＋CD38^-细胞比例为18．92％，与HSPC＋CK组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。从集落形成分析结果看出：MSC、细胞因子混合组扩增后细胞集落形成能力在不同时间点均维持在较高水平。结论：脐血CD34^＋细胞在体外短期培养（〈7天）下，MSC和细胞因子联合应用能同时使CD34^＋细胞得到明显的扩增并维持造血干祖细胞的生物学特征。     

脐血CD34+细胞迁移能力在体外扩增过程中的变化

目的　比较扩增前、后脐血 (CB)CD34 细胞在体外的迁移能力及细胞表面趋化因子CXCR4的表达情况。方法　将从新鲜CB标本中纯化的CD34 细胞接种于已建立的扩增体系 ,分别于培养 7,10和 14d从扩增产物中再纯化CD34 细胞 ,检测培养不同时间CD34 细胞的自发迁移率和SDF 1诱导迁移率以及CD34 细胞表面CXCR4的表达。结果　①原代和扩增不同时间CD34 细胞的SDF 1诱导迁移率均高于自发迁移率 ;②扩增 7d时CD34 细胞的自发迁移率和SDF 1诱导迁移率与原代CD34 细胞相当 ,但在第 2周的培养中 ,CD34 细胞的两种迁移率均明显下降 (P值均 <0 .0 5 ) ;③扩增后CD34 CXCR4 细胞的数量明显增加 ,但CXCR4在CD34 细胞上的表达呈下降趋势 ,14d时显著低于原代细胞的表达水平 (P <0 .0 5 )。结论　CB造血干 祖细胞 (HSPC)在已建立的短期培养体系中扩增 1周可保持原有的迁移功能 ,但持续扩增则可能对HSPC的归巢潜能产生不利影响。     

脐血干/祖细胞短期体外扩增后归巢相关粘附特性的研究

探讨体外扩增对脐血（UCB)造血干／祖细胞(HSPC)原有粘附功能的影响。将从新鲜UCB标本中纯化的CD34^ 细胞接种于无血清、无基质的悬浮扩增体系，分别于培养第7天、第10天和第14天从扩增产物中再次纯化CD34^ 细胞，比较扩增前后CD34^ 细胞表面VLA—4(CD49d)、VLA—5(CD49e)、LFA—l(CDlla)、L-selecin(CD62L)、PECAM—l(CD3l)、ICAM—l(CD54)和HCAM(CD44)等归巢相关粘附分子(SAMs)的表达情况，并检测CD34^ 细胞与纤连蛋白(FN)间的自发粘附率和基质细胞来源因子—l(SDF—1)诱导粘附率。①在第14天的培养扩增中，表达上述CAMs的各CD34^ 细胞亚群均有不同程度(15～72倍)的扩增；②扩增后CD34^ 细胞表面粘附分子CD44、CD11a、CD49e和CD49d的表达与原代CD34^ 细胞持平或高于培养开时水平，而CD62L、CD54和CD31的表达则有不同程度下调；③在前10d的扩增中，CD34^ 细胞与FN间的自发粘附率和SDF—l诱导粘附率均呈上升趋势。所建立的短期培养体系不仅可以支持表达重要CAMs的UCB CD34^ 细胞亚群的有效扩增，而且扩增后的HSPC总体上保持原有的粘附功能。     

体外共培养双份脐血CD34^＋细胞对各自归巢相关分子表达的影响

本研究探讨脐血CD34^＋细胞体外混合培养对彼此归巢相关分子表达的影响。从正常人骨髓中分离扩增间充质干细胞，富集传代，加速器照射（12Gy）后作为滋养层细胞，将免疫磁珠分选纯化的两份脐血CD34^＋细胞混合接种到其表面（其中1份CD34^＋细胞用CFSE标记），观察各自归巢相关分子（黏附分子）表达的变化。结果表明，脐血CD34^＋细胞分选富集的纯度为（98．25±0．93）％，实验组在共培养6天后，两份脐血CD34^＋细胞的比例分别降为（60．4±6．32）％和（60．2±5．12）％，但与对照组比较无统计学差异；实验组各份CD34^＋细胞的CD44，CD62L，CD184以及CD26的阳性率较培养前均无显著变化。而CD162表达显著下降。CD54在培养3天后有所上升，但培养6天后下降至培养前水平，与对照组比较无统计学差异。结论：将两份脐血的CD34^＋细胞体外混合培养对彼此归巢相关分子并无明显影响     

转白血病抑制因子基因人胚肺成纤维细胞对脐血CD34~＋细胞体外扩增的影响

背景：单份脐血的造血细胞数量有限,难以满足成人的需要,如何有效地扩增脐血造血干/祖细胞是目前研究的热点。目的：构建人白血病抑制因子基因修饰的人胚肺成纤维细胞,观察转基因细胞对脐血CD34＋造血干/祖细胞体外扩增的影响。方法：建立转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞,用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐血CD34＋造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34＋造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验检测自发迁移率和基质细胞衍生因子1诱导迁移试验以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力。结果与结论：成功建立转基因饲养层细胞,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,与人白血病抑制因子转基因饲养层细胞共培养7d后CD34＋造血干/祖细胞可大量扩增,同时表面黏附分子的表达量仍较高。体外迁移实验显示与转基因饲养层细胞共培养的造血细胞的诱导迁移率明显高于对照组,可以较好地保持其归巢能力。因此转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34＋造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力。     

rhG-CSF对骨髓采集物中记忆T细胞上黏附分子表达的调节作用

本研究主要探讨人重组粒细胞集落刺激因子（rhG—CSF）对骨髓采集物记忆T细胞上黏附分子表达的调节作用。采用流式细胞仪检测稳态骨髓（SS—BM）和rhG—CSF预激的骨髓（G—BM）中CD4^＋、CD8^＋T细胞百分比及其记忆细胞表面黏附分子CD49d、CD54、CD62L和CD11a的表达。结果显示：rhG—CSF应用后骨髓采集物中CD4^＋、CD8^＋T细胞在淋巴细胞中的比例明显降低（P〈0．001）,记忆T细胞的比例没有明显变化;CD49d在CD4^＋和CD8^＋T细胞的表达百分比显著下降（p〈0．05）,但在记忆T细胞的表达百分比没有明显的变化;CD54在CD4^＋及其记忆T淋巴细胞和CD8^＋T淋巴细胞的表达百分比明显降低（P〈0．05）,而在CD8^＋记忆T细胞的表达百分比没有明显变化;CD62L在CD4^＋、CD8^＋及其记忆T细胞的表达百分比显著下降（P〈0．01）;CD11a在CD4^＋及其记忆T细胞的表达百分比明显降低（p〈0．05）,而在CD8^＋及其记忆T细胞的表达百分比没有明显变化。结论：rhG—CSF部分下调骨髓中CD4^＋、CD8^＋以及相应的记忆T细胞上黏附分子表达。     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

rhG-CSF体内应用对骨髓和外周血造血干/祖细胞上CXCR-4表达的影响

为了观察rhG-CSF动员对外周血和骨髓造血干/祖细胞上CXCR-4表达的影响,应用三色荧光标记技术对动员前后骨髓和外周血中单个核细胞（MNC）和CD34＋细胞上CXCR-4的表达进行了测定.结果显示,G-CSF动员显著增加了外周血MNC及骨髓CD34＋细胞上CXCR-4的表达,骨髓MNC及外周血CD34＋细胞上CXCR-4的表达无变化,稳态骨髓（SS-BM）中CD34＋细胞比例与G-BM、G-PB中CD34＋细胞比例呈正相关,与采集到的骨髓及外周血中CD34＋细胞/公斤也具有良好的正相关性.结论：G-CSF体内应用后CD34＋细胞上CXCR-4表达的变化可能是动员机制的一部分,CXCR-4的高表达可能有利于MNC的植入,SS-BM中CD34＋细胞的含量可作为动员效果好坏的预测指标.     

不同来源的造血干/祖细胞表面归巢相关分子表达谱的比较研究

目的　比较不同来源的造血干 /祖细胞表面归巢相关分子 (HRM)表达谱的差异性。方法　采用高度灵敏的四色流式细胞术检测脐血 (UCB)、动员后的外周血 (mPB)及骨髓 (BM)来源的造血干 /祖细胞表面系列HRM表达水平。结果　UCB、mPB及BM来源的CD34bright细胞均高度表达黏附分子CD4 4、CD11a、CD18、CD6 2L、CD31及CD4 9d ;但UCB来源的CD34bright细胞及CD34brightCD38-细胞黏附分子CD4 9e、CD4 9f、CD5 4及趋化因子受体CXCR 4的表达水平显著低于mPB及BM来源者 ;上述不同来源的造血干 /祖细胞均不表达其他趋化因子受体 ,包括CCR 1、CCR 2、CCR 3、CCR 5、CXCR 1、CX CR 2、CXCR 3及CXCR 5 ;更为有意义的是 ,只有mPB来源的CD34bright细胞表达基质金属蛋白酶MMP 2及MMP 9。CD34brightMMP 2 及CD34brightMMP 9 细胞百分率分别为 (11.4± 4 .9) %及 (2 7.6± 7.8) %。结论　UCB来源的造血干 /祖细胞低表达或不表达某些HRM ,这可能是UCB移植后造血重建延迟的原因之一。     

人胎盘与脐动、静脉血造血干/祖细胞归巢相关黏附分子表达的研究

为了评价人胎盘组织造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitorcell,HSPC)的归巢能力,采用机械法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用流式细胞术分析胎盘组织及脐动、静脉血有核细胞中CD34+细胞及其亚群的含量,检测三者来源的CD34+细胞表面归巢相关黏附分子CD44、CD11a、CD62L、CD49d、CD49e和CD54的表达水平。结果显示,胎盘组织CD34+细胞及CD34+CD38-细胞百分率明显高于脐动、静脉血;脐动脉与脐静脉血中HSPC百分率没有明显差异。胎盘来源CD34+细胞高度表达黏附分子CD11a、CD49d、CD44、CD49e及CD54,其中表达CD49e及CD54水平明显高于脐动、静脉血CD34+细胞。胎盘来源的CD34+CD62L+细胞百分率为(64.58±15.52)%,低于脐静脉血来源的表达。结论:人胎盘富含HSPC。胎盘来源的CD34+细胞多数黏附分子的表达水平近似或高于脐血,提示胎盘HSPC的归巢能力有可能强于脐带血。     

CXCR-4 expression on bone marrow CD34+ cells prior to mobilization can predict mobilization adequacy in patients with hematologic malignancies

To investigate the mechanisms of mobilization and of the factors implicated in the homing of progenitors and possibly understand the reasons for unpredicted mobilization failure, we analyzed CXCR-4 (CD184) expression on bone marrow (BM) CD34+ cells prior to peripheral blood stem cell (PBSC) mobilization in 24 patients affected by hematologic malignancies (non-Hodgkin lymphoma, multiple myeloma, and acute myeloid leukemia). We wanted to determine whether the level of CXCR-4 expressed by hematopoietic stem cells could influence mobilization process and therefore could be considered a predictive factor for mobilization adequacy. These data were also compared with stromal cell function as assessed by colony forming unit-fibroblast (CFU-F) and CFU endothelial cells (CFU-En) assays and stromal layer confluence capacity exhibited by patients' BM cells. In this study, we also compared CXCR-4 expression on CD34+ cells from different sources and at different migration stages specifically bone marrow (BM), steady state peripheral blood (SSPB), fetal cord blood (FCB), cord blood (CB), and mobilized PBSC. Seven (29%) of the 24 patients undergoing mobilization failed to achieve an adequate number of CD34+ stem cells (5 x 10(6)/kg CD34+ cells) and showed a very high expression frequency of CXCR-4 on BM CD34(+) stem cells (mean number of positive cells, 97%) investigated before the mobilization regimen. We also found that high expression intensity per cell for CXCR-4 was associated with lower amounts of mobilized CD34+ cells whereas those patients (17 out of 24 patients, 71%) with lower expression intensity per cell of CD184 on BM CD34+ cells prior to mobilization harvested at least 5 x 10(6)/kg CD34+ cells. Setting a cut off of 5 x 10(6)/kg CD34+ cells harvested, patients mobilizing less had a mean value of 97% CD34+ cells expressing CXCR-4 with a relative mean channel fluorescence of 458 whereas patients mobilizing more than 5 x 10(6)/kg CD34+ progenitors showed a mean value of 59.8% CD34+/CXCR4+ cells with a relative mean channel fluorescence value of 305. Interestingly, in the poor mobilizers group, the marrow stromal microenvironment was found to be more severely damaged in comparison with that of good mobilizers. The comparative analysis of CXCR-4 expression showed no difference in percentage values between steady-state PB (87.4%) and BM (85.1%) stem cells whereas mobilized CD34+ stem cells have a lower expression frequency of CXCR-4 (71.6%) compared to that of progenitors from other sources. Fetal blood CD34+ stem cells had the lowest mean expression frequency of CD184 antigen (36.3%), while CB cells had the highest (94.8%). In conclusion, this study provides evidence that monitoring CXCR-4 CD34 double positive cells before mobilization can be regarded as a predictive factor for mobilization outcome, giving us directional cues for the choice of the best stem cell mobilization regimens.     

重组人粒细胞集落刺激因子动员对CD4+T淋巴细胞迁移和黏附功能的影响

目的探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员对CD4+T淋巴细胞表面分子CXCR4和淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)所介导功能和相关信号机制的影响.方法在rhG-CSF动员前和动员后第5天抽取供者外周血,用三色荧光标记检测动员前后CD4+T淋巴细胞LFA-1和CXCR4的表达率,并应用免疫磁性分选法分离纯化CD4+T淋巴细胞,检测动员前后CD4+T淋巴细胞对基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)的迁移能力和对细胞间黏附分子1(ICAM-1)的黏附能力.结果rhG-CSF动员前后CD4+T淋巴细胞的LFA-1(CD11a)和CXCR4表达率差异无统计学意义(P＞0.05),动员前后CD4+T细胞LFA-1表达率均为100%;动员前CD4+T淋巴细胞CXCR4表达率为(84.58±20.31)%,动员后为(81.23±22.46)%.动员前后CD4+T淋巴细胞向SDF-1α的4 h迁移率分别为(28.5±10.3)%和(31.2±8.9)%,差异无统计学意义(P＞0.05);动员前后CD4+T淋巴细胞在CD3单抗作用下对ICAM-1的黏附率分别为(85.59±14.21)%和(61.45±15.07)%,动员前显著高于动员后(P＜0.05).结论rhG-CSF动员不影响CD4+T淋巴细胞LFA-1和CXCR4的表达,但影响CD4+T淋巴细胞通过LFA-1对ICAM-1的黏附能力.     

MIP-1α和血小板第4因子对造血干细胞化疗药物损伤的保护作用

目的 研究巨噬细胞炎性蛋白（ＭＩＰ－１α）、血小板第４因子（ＰＦ４）及二联合对造血干细胞化疗药物损伤的保护效应及其分子机制。方法 将骨髓、脐血单个核细胞及白血病细胞株ＨＬ－６０分别予ＭＩＰ－１α、ＰＦ４、ＭＩＰ－１α＋ＰＦ４、ＰＢＳ预处理４８ｈ,再经柔红霉（ＤＮＲ）孵育２４ｈ后,用锥虫蓝９台盼蓝）拒染法测细胞活性,用流式细胞仪测细胞仪测细胞周期及ＣＤ３４＾＋、ＣＤ３８＾－细胞含量,细胞集落培养、