层黏连蛋白和纤维连接蛋白对传代人晶状体上皮细胞生长和Cx43表达的影响

目的:观察层黏连蛋白(Ln)和纤维连接蛋白(Fn)对传代培养的人晶状体上皮细胞(hLECs)形态学和连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法:以层黏连蛋白(Ln)和纤维连接蛋白(Fn)处理培养皿表面,以倒置显微镜观察第3代培养的hLECs生长的形态,MTT法记录其生长曲线,免疫荧光法检测Cx43表达,比较两组表达阳性率的变化。结果:在层黏连蛋白处理组,传代细胞以典型的六角形上皮细胞形态为主,而纤维连接蛋白处理组则表现为以梭形的成纤维细胞为主。MTT实验显示,传代后4～7d纤维连接蛋白处理组细胞数多于层黏连蛋白处理组(P<0.05)。免疫荧光反应中,两组Cx43表达的阳性率有明显差别(23/28vs16/28,P<0.05)。结论:层黏连蛋白可以提供适宜hLECs保持上皮细胞状态的体外培养微环境,而纤维连接蛋白可以促进hLECs的增殖和分化。     

晶状体上皮细胞培养及Ⅳ型胶原表达

目的体外培养小牛晶状体上皮细胞，免疫组织化学SABC法检测1V型胶原表达。方法小牛晶状体前囊组织块培养，晶状体上皮细胞原代和传代培养。传代2次后免疫组织化学法检测细胞内1V型胶原表达。结果原代培养2-3周后细胞成单层后传代培养，传代细胞易贴壁，9～10d后可再传代，免疫组织化学检测发现细胞质内有大量Ⅳ型胶原表达，形成细胞的骨架成分。结论晶状体上皮细胞在增生时有大量Ⅳ型胶原表达，其与晶状体后囊混浊有关。     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

层黏连蛋白体外对人虹膜色素上皮细胞的影响

目的:研究不同浓度的层黏连蛋白对体外培养的人虹膜色素上皮细胞(IPE)的作用.方法:采用酶辅助的显微分离法对成人眼进行IPE的原代和传代培养,观察其形态;以不同浓度的层黏连蛋白(0,1,5,10mg/L)处理第3代IPE细胞,MTT法作出生长曲线,免疫荧光法检测细胞角蛋白1(CK1)表达的变化.结果:原代培养的IPE细胞内色素丰富,而传代培养后色素显著减少;低浓度层黏连蛋白(5mg/L)明显促进IPE细胞增殖(0.187 vs 0.151,0.236 vs 0.176,0.245 vs 0.215,0.261vs 0.238,0.279 vs 0.254;P＜0.05);高浓度(10mg/L)明显抑制细胞增殖(0.121 vs 0.151,0.081 vs 0.176,0.094 vs0.215,0.065 vs 0.238,0.078 vs 0.254;P＜0.05);CK1染色均为阳性,高浓度层黏连蛋白(10mg/L)使IPE细胞聚集,CK1表达明显增强.结论:层黏连蛋白对IPE细胞具有双重作用,低浓度的层黏连蛋白适于IPE细胞的体外培养.     

人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究

目的探讨体外培养原代人眼Tenon’s囊成纤维细胞的方法及其生长特性,为抗纤维化研究提供靶细胞模型。方法取翼状胬肉及斜视手术患者的Tenon’s囊组织,用组织块法培养原代成纤维细胞。用免疫荧光方法鉴定细胞。对细胞进行传代、冻存和复苏的观察。对复苏后的细胞行MTT法检测其活力并绘制生长曲线。结果人眼Tenon’s囊成纤维细胞可以在体外用组织块方法培养出来,呈典型的长梭形。免疫荧光鉴定细胞波形蛋白染色阳性。细胞多次传代后依然生长迅速,3 d即可长满瓶底。复苏后细胞2~6 d处生长对数期,增殖能力良好。结论人眼Tenon’s囊成纤维细胞体外生长状态良好,可以液氮冻存,复苏后细胞活力较强,可以用于抗纤维化增生的基础研究。     

人眼筛板细胞体外培养的研究

目的研究筛板细胞合成细胞外基质的生理与病理，建立筛板细胞培养模型。方法采用酶消化法对１０只人胚眼筛板组织进行体外培养，并利用电镜和免疫组化技术鉴定。结果所培养的细胞呈多角扁平状，核周胞浆内富含颗粒，核相对透明，核仁清楚；细胞表面有微绒毛，核膜周围有异染色质，胞膜附有基底膜及细胞外基质；免疫荧光染色对Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及纤维连接蛋白，层粘连蛋白呈阳性；对神经胶质纤维酸性蛋白，Ⅷ因子相关抗原呈阴性。以上均符合筛板细胞的特点，此细胞株现已传代至第４代。结论成功地建立筛板细胞体外培养模型，可用于青光眼发病机制的研究。     

α晶状体蛋白对脂多糖诱导的视网膜小胶质细胞增生及TNF-α表达的影响

目的观察α晶状体蛋白对脂多糖（LPS）诱导的视网膜小胶质细胞增生及肿瘤坏死因子α（TNF—α）生物学活性的影响。方法原代培养视网膜小胶质细胞，并采用CD11b细胞免疫荧光及流式细胞仪鉴定纯度，加入α晶状体蛋白及LPS后，通过MTT（四氮唑蓝比色细胞增生测定）检测α晶状体蛋白对LPS活化的小胶质细胞增生能力的影响，并采用ELISA、RT—PCR检测TNF—α蛋白水平及mRNA水平表达的变化。结果原代培养的小胶质细胞经免疫组织化学鉴定及流式细胞仪鉴定纯度分别达到95．8％和91．4％，经10^-4／Lα晶状体蛋白预处理后，LPS诱导的小胶质细胞增生被抑制（P〈0．01）；与未处理组比较，TNF—α蛋白质量浓度及mRNA表达量明显降低（P〈0．05）。结论α晶状体蛋白可以减少LPS诱导的原代培养视网膜小胶质细胞增生及TNF—α表达。     

家兔角膜内皮细胞的快速培养

目的:短期内体外扩增获得角膜内皮细胞。方法:采用揭膜法与消化法相结合获取原代角膜内皮细胞。并采用本实验室自行研制的角膜内皮细胞培养体系,在24孔培养板中分别以1×106,5×105,1×105,5×104,1×104,5×103细胞/孔浓度传代培养细胞,观察细胞的生长情况。结果:以1×105～5×105个细胞/孔浓度的细胞悬液并添加消化后的Descemet膜原代培养细胞,4d后细胞形成与在体细胞相似的密集单层,可以快速获取纯化的角膜内皮细胞。传代培养时,虽然不同接种浓度在4d的细胞增殖倍数差异不显著,但以1×105～5×105个细胞/孔的浓度传代,3d就可生长成密集单层并可继续传代,现已传至第10代,但传至第4代,细胞形态开始发生改变;而以5×105个细胞/孔以上的浓度传代细胞时,1d的细胞贴壁率下降;以5×104个细胞/孔以下浓度传代,需7d方可长满皿底,并且细胞开始老化,体积变大,不能继续传代培养。或者细胞不能铺满皿底就衰老死亡。结论:本实验的培养体系可在短期内获得实验用角膜内皮细胞。角膜内皮细胞体外培养的增殖能力与其培养浓度和增殖的空间有关,1×105～5×105个细胞/孔的浓度是角膜内皮细胞快速增殖的适宜培养浓度。     

层粘连蛋白和表皮生长因子对兔角膜内皮细胞周期的影响

目的　观察层粘连蛋白和表皮生长因子单独及联合应用对兔角膜内皮细胞周期的影响。方法　体外培养角膜内皮细胞分为对照组、层粘连蛋白组、表皮生长因子 (EGF)组和联合应用组 ,倒置显微镜观察各组细胞形态及数目变化 ;计数 0、12、2 4、36h的各组细胞数目并绘制细胞生长曲线 ;流式细胞技术检测各组细胞周期。结果　倒置显微镜观察及细胞生长曲线显示 ,与对照组相比 ,层粘连蛋白组、EGF组和联合应用组细胞数目明显增多 ,其中联合应用组最为显著 ;细胞周期检测结果显示 ,层粘连蛋白组、EGF组和联合应用组G0～G1期细胞比例显著下降 (P <0 .0 5 ) ,G2～M期细胞比例显著提高 (P <0 .0 5 ) ;EGF组和联合应用组S期细胞比例显著提高 (P <0 .0 5 ) ;联合应用组与层粘连蛋白组相比 ,G0～G1期细胞比例显著下降 (P <0 .0 5 )。结论　层粘连蛋白和表皮生长因子单独及联合应用都可明显促进角膜内皮细胞分裂增生 ,且联合应用有协同作用。     

人眼小梁细胞体外培养及生物学特性研究

目的:建立人眼小梁细胞培养方法并研究其生物学特性。方法:以体外组织块培养的方法获得培养的人小梁细胞,应用光镜、电镜观察细胞的形态学特征,并观察其免疫组化特性和细胞的生长曲线。结果:光镜下小梁细胞为扁平多角形、单层生长;电镜下细胞连接为点粘连和缝隙连接、细胞表面可见微绒毛、胞浆细胞器丰富;免疫组化染色对抗纤维连接蛋白(Anti—FN)、抗层粘连蛋白(Anti—LN)、抗神经元特异性烯醇化酶(Anti—NSE)单抗呈阳性,对抗第Ⅷ因子(Anti-ⅧFactor)单抗呈阴性;传代小梁细胞繁殖时间较长,10天后为平台期。结论:根据体外培养的小梁细胞的形态特点、生长特征、免疫组化特性可对其进行鉴定。人小梁细胞体外培养的成功,为在细胞和分子水平研究青光眼的发病机制提供了有利的条件。眼科学报 1996;12:64—69。     

The effects of laminin and fibronectin on human lens epithelial cells growth characters and vimentin expression

To observe the morphologic characters and the expression of vimentin on human lens epithelial cells (hLECs) cultured on laminin and fibronectin. METHODS: The primary and secondary hLECs were cultured on plates treated with laminin or fibronectin. The feature of hLECS was observed and recorded using an inverse microscope with digital camera and statistical analysis was applied. MTT assay was used to show the growth curve of subcultured cells (the 3^rd passage). Immunofluorescent staining was used to demonstrate the morphologic change in vimentin expression in the 3^rd passaged hLECs. RESULTS: The hLECs in laminin or fibronectin group grew out significantly earlier than the untreated group. The cells could be subcultured fluendly in those two treated groups, while only a few survival cells were found in the untreated group. But the hLECs could undergo apoptosis in laminin group at the terminal phase of their life cycle, while lentoid bodies emerged in fibronectin treated group. There were more viable cells in the fibronectin group from the 4^th to the 7^th day by MTT reaction. Immunofluorescent staining showed a clear morphological difference between the two groups. CONCLUSION: Laminin provide a suitable growth microenvironment for the hLECs while fibronectin promotes the cells proliferation and differentiation.     

低剂量微丝解聚剂对地塞米松诱导的牛小梁细胞骨架及基质蛋白TSP-1的影响

目的研究低剂量的肌动蛋白微丝解聚剂Latrunculin（LAT）-A对地塞米松诱导的牛小梁细胞肌动蛋白细胞骨架及细胞外基质蛋白TSP-1产生的影响。方法体外培养牛眼小梁细胞,分别用地塞米松和LAT-A在不同条件下孵育,免疫荧光显微镜观察细胞骨架形态和结构的改变并用免疫组织化学法对TSP-1的表达进行定位和半定量分析。结果培养的小梁细胞NSE染色阳性,ⅧR∶Ag染色阴性,TSP-1染色阳性。经地塞米松诱导后微丝重组杂乱,细胞外TSP-1表达减弱。LAT-A可部分逆转此重组,促进其恢复;LAT-A可抑制TSP-1表达,且随作用时间的延长抑制作用更强。结论低剂量的LAT-A可以逆转由地塞米松诱导的细胞骨架的改变,并对TSP-1的产生有抑制作用。     

高糖对人晶状体上皮细胞凋亡的作用

目的:研究不同浓度的高糖(HG)对人晶状体上皮细胞凋亡的作用。方法:用不同浓度的HG诱导人晶状体上皮细胞凋亡,处理组:DMEM+HG;对照组:DMEM。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测人晶状体上皮细胞的生长活性;原位末端核苷标记(TUNEL)法检测细胞凋亡的凋亡指数(AI),并在电镜下观察TUNEL染色阳性细胞的形态及分布。结果:HG可抑制人晶状体上皮细胞生长,诱导细胞的凋亡,并呈剂量及时间依赖性,HG诱导组细胞凋亡率明显高于正常组(P<0.01)。TUNEL染色法在电镜下观察到HG诱导24h后,TUNEL染色阳性细胞核固缩或碎裂呈棕黄色,细胞大小不一;而TUNEL染色阴性细胞着色均匀,大小均一。结论:高糖具有促使人晶状体上皮细胞凋亡形成的作用,尤其是在120~150mmol/L浓度范围内。     

Isolation, culture, and characterization of human fetal trabecular meshwork cells

PURPOSE: To isolate and characterize fetal trabecular meshwork (FTM) cells for study in culture. Cultured adult trabecular meshwork (TM) cells often possess a slower rate of growth and restricted number of population doublings, limiting the ability to perform expanded testing. METHODS: Fetal eyes from 24-week gestation abortions were delicately dissected to isolate the developing trabecular meshwork tissue. Three primary cultures were achieved and passaged. Light microscopy was used to compare the FTM cells to two cultured adult TM cell lines. Immunocytochemistry and Western blot analysis were utilized to identify specific protein expression. RESULTS: The FTM cells demonstrated similar microscopic characteristics to adult TM cells, including monolayer formation, cobblestone pattern, and comparable size. FTM cells exhibited faster, more consistent doubling times when compared with adult TM cells. They grew rapidly even after passage 8, whereas their adult counterparts slowed significantly with each successive passage and failed to reach confluence at passages 4 to 5. Immunofluorescent staining was positive for actin, vimentin, fibronectin, laminin, aquaporin-1, CD-44, and myocilin in both FTM and adult TM cells. In both fetal and adult cells, Western blots showed substantial increase in myocilin after exposure to dexamethasone. CONCLUSIONS: Characterization by microscopy and immunocytochemistry suggest that FTM cells have properties similar to adult TM cells. Fetal tissues may be a useful source of abundant, rapidly dividing FTM cells for in vitro investigation. The ability to do expanded research in this field may contribute to a better understanding of the molecular mechanisms in glaucoma development.     

Serum-free spheroid culture of mouse corneal keratocytes

PURPOSE: To develop a serum-free mass culture system for mouse keratocytes. METHODS: Corneas of C57BL6/J mice were enzyme digested after the epithelium and endothelium were removed. Stromal cells were cultured in serum-free DMEM/F12 (1:1) containing epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor 2 (FGF2), and B27 supplement. Primary spheres were dissociated by trypsin and subcultured as suspended secondary spheres. Cells from postnatal day (P)6 to P10 spheres were subcultured onto plastic dishes or type I collagen gels for phenotype analysis. The expression of the keratocyte markers keratocan, aldehyde dehydrogenase (Aldh), and CD34, were analyzed by RT-PCR, and vimentin and alpha-smooth muscle actin (alpha-SMA) were examined by immunocytochemistry. RESULTS: Primary keratocytes formed spheres, which were cultured for over 12 passages. Suspended sphere cells expressed vimentin, keratocan, CD34, and lumican, but were negative for cytokeratin K12 (K12) and Pax6. Sphere cells subcultured on plastic exhibited a dendritic morphology characteristic of keratocytes, and maintained keratocan, Aldh, and CD34 expression in serum-free medium. Sphere cells subcultured with 10% serum became fibroblastic, and expressed alpha-SMA when stimulated by transforming growth factor (TGF)-beta. alpha-SMA-positive cells demonstrated contractile properties on collagen gels, compatible with the myofibroblast phenotype. CONCLUSIONS: The phenotype of mouse keratocytes can be maintained in vitro for more than 12 passages by the serum-free sphere culturing technique.     

TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞生物学行为改变及表达整合素连接激酶(ILK)的研究

目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor beta 2,TGF-β2)对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)生物学行为及表达整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的影响.方法 组织块贴壁法培养原代HTFs,免疫荧光染色鉴定波形蛋白和角蛋白.MTT法检测不同浓度TGF-β2对HTFs细胞的促增殖作用,RT-PCR检测TGF-β2作用前后α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)、ILK mRNA的表达,Western Blot检测α-SMA、ILK、E-cadherin蛋白的表达,细胞免疫荧光染色检测α-SMA、E-cadherin蛋白的表达.结果 MTT检测结果显示,TGF-β2作用48 h、72 h,5.0 μg· L-1及10.0 μg· L-1诱导下的OD值显著高于0.1μg·L-1、1.0 μg·L-1组及空白对照组(均为P＜O.05),5.0 μg·L-1及10.0 μg·L-1作用48 h及72 h的OD值显著高于24 h(均为P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,5.0μg·L-1TGF-β2诱导48 h后,α-SMA mRNA及ILK mRNA水平和空白对照组相比明显上调,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).Western Blot检测结果显示,ILK、α-SMA及E-cadherin在空白对照组和5.0 μg· L-1TGF-β2处理组均有表达,但TGF-β2能够明显上调三者的表达,5.0 μg·L-TGF-β2处理48 h组与空白对照组差异均有统计学意义(均为P＜0.05).细胞免疫荧光染色结果显示,TGF-β2处理组α-SMA、E-cadherin均有荧光表达,其中oα-SMA表达在细胞质中,而E-cadherin在细胞质和细胞核中均有表达.结论TGF-β2可以诱导体外培养HTFs增殖,转分化及黏附性增强,同时促进ILK的高表达,提示ILK在青光眼术后瘢痕化过程中可能也起到一定作用.     

人眼筛板细胞体培养的研究

研究筛板细胞合成细胞外基质的生理与病理，建立筛板细胞培养模型，方法采用酶消化法对１０只人胚眼筛板组织本外培养，并利用电镜和免疫组织化技术鉴定。结论，成功地建立了筛板细胞外培养模型，可用于青光眼发病机制的研究 。     

未折叠蛋白应答在晶状体上皮细胞凋亡中作用的研究

目的 探讨内质网应激中未折叠蛋白应答在晶状体上皮细胞凋亡中的作用及其与白内障发病机制的关系.方法 将hLECs分为对照组和实验组A、B、C、D组,分别用0、1、2、5、10mmol/L的同型半胱氨酸(Hey)作用细胞24h,应用MTT法检测不同浓度药物对细胞增殖抑制率:应用Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡率;应刚活性氧荧光探针DCFH-DA检测刺激后细胞中活性氧产物(R0s);应川GSH检测试剂盒检测刺激后细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)的含量;应用Westernblot技术检测刺激后细胞中的GRP78,caspase-12的表达.结果 不同浓度的Hey刺激晶体上皮细胞后,细胞活力呈浓度依赖性下降,其中5mmol/L,10mmol/LHey可使细胞活性下降48.3%.57.7%.与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01),并且能诱导细胞的明显凋亡;细胞中ROS水平呈浓度依赖性升高,GSH减少,C、D组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);Western bolt技术检测显示刺激后细胞中GRP78,emspase-12表达升高,C、D组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 高浓度的内质网刺激因子可刺激晶体上皮细胞产生内质网应激,并通过未折叠蛋白反应导致晶体-亡皮细胞凋亡,产生白内障.