体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

共聚焦显微镜在活体角膜上皮肿瘤鉴别诊断中的应用

目的 通过活体共聚焦显微镜在角膜上皮肿瘤诊断中的应用,分析、鉴别角膜上皮肿瘤性质.方法 7例角膜上皮肿瘤患者术前均行常规眼部裂隙灯检查、眼前节OCT和活体共聚焦显微镜检查.所有患者均实施角膜肿瘤切除术,术后行肿瘤组织病理学检查,与术前共聚焦显微镜结果比较.结果 7例角膜上皮肿瘤均侵犯透明角膜、角膜缘和球结膜,突起于眼球表面,形状似桑葚,血管丰富.在眼前节OCT检查中5例角膜肿瘤显示密度均匀,与角膜组织之间界限清晰,浅层基质中未见肿瘤密度影;另外2例角膜肿瘤显示,密度不均,与角膜组织界限不清,而且侵犯前弹力层和浅层角膜基质.在活体共聚焦显微镜中7例均显示角膜上皮细胞非典型增生,其中2例非典型增生明显,侵犯前弹力层,在角膜上皮层和浅基质层内形成“癌巢”,5例诊断为角、结膜乳头状瘤,2例诊断为角膜鳞状上皮细胞癌,与术后组织病理学诊断结果一致.结论 活体共聚焦显微镜检查对角膜上皮肿瘤术前诊断肿瘤性质提供重要依据.     

猪脱细胞角膜基质组织结构特点与生物相容性研究

背景构建组织工程化角膜时,载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用,但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点,评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养,经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞,支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察组织的形态学特征;扫描电镜下观察其组织结构特点;并对其物理特性,如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内,同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周,分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞,其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同,抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似。猪脱细胞角膜基质行异种兔角膜基质层间移植1周时可见轻度水肿,2周后水肿基本消退,4周时透明度较好。猪脱细胞角膜基质与兔角膜基质之间贴附良好,未见炎症反应及新生血管。兔角膜上皮细胞接种于猪脱细胞角膜基质上共培养4周后CK3表达阳性。猪脱细胞角膜基质脱水前与脱水2h、4h后及正常猪角膜基质间的抗拉性、膨胀性、含水量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,但脱水2h、4h后及正常猪角膜基质的透明度明显好于脱水前,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论猪脱细胞角膜基质组织结构与正常猪角膜相似,与兔角膜基质和上皮细胞具有良好的生物相容性。     

角膜内皮移植联合超声乳化白内障吸除及人工晶状体置换手术的疗效评价

目的 探讨角膜后弹力层剥除自动角膜刀取材内皮移植术(DSAEK)联合超声乳化白内障吸除及人工晶状体置换手术治疗角膜内皮失代偿并有白内障或人工晶状体异常患者的疗效和并发症情况.方法 回顾性临床自身对照研究.对2007年12月至2008年12月在北京大学第三医院就诊的各种原因引起的角膜内皮失代偿合并有晶状体异常的患者18例(20只眼)分别行DSAEK联合超声乳化白内障吸除人工晶状体植入手术5例(7只眼)、DSAEK联合前房型人工晶状体取出与前段玻璃体切除及后房型人工晶状体悬吊术7例(7只眼)或DSAEK联合前段玻璃体切除及后房型人工晶状体悬吊术6例(6只眼).术后观察视力、角膜透明性的恢复、植片厚度、角膜内皮细胞丢失、植片的脱位率及排斥反应发生情况.采用治疗前后均数比较t检验.结果 术后18例患者眼部刺激症状均消除,角膜水肿全部消退,术前和术后的角膜厚度分别为859μm、553 μm,差异有统计学意义(t=5.303,P＜0.01);术前供体角膜内皮细胞密度为2987个/mm2,术后3个月角膜内皮细胞密度为1803个/mm2,内皮细胞丢失率为41%.术后除去患有眼底病变的患者9只眼,其余患者视力均有大幅度的提高,视力恢复到0.8以上的有6只眼,在眼底正常的患者中占55%(6/11).术后前房人工晶状体眼炎症反应最重,其余患者反应轻微;术后有6只眼植片脱位(30%,6/20)、术后5例出现眼压升高、1例发生植片排斥反应,均为前房人工晶状体眼的患者.结论 DSAEK联合超声乳化白内障吸除及人工晶状体置换手术对于治疗角膜内皮失代偿并有晶状体或人工晶状体异常患者是一种较安全、有效的手术方法.前房人工晶状体眼行DSAEK术后并发症较多,对虬膜、房角结构异常的患者行角膜内皮移植手术应谨慎.

Abstract：

Objective To evaluate the effect and explore the complications of Descemet-stripping automated endothelial keratoplasty (DSAEK) combined with phacoemulcification cataract surgery or lens exchange in corneal endothelial dysftnction eyes with lens disorders. Methods Retrospective case series.Eighteen consecutive cases (20 eyes) were performed DSAEK combined with lens surgery from December 2007 to December 2008 in Department of Ophthalmology, Peking University Third Hospital. Five cases (7 eyes) were performed DSAEK combined with phacoemulcification and intraocular lens (IOL) insertion.Seven cases were combined with anterior chamber IOL extraction, anterior vitrectomy and posterior chamber IOL insertion. Six aphakia cases were performed with DSAEK combined with anterior vitrectomy and sclera fixation posterior chamber IOL insertion. Postoperatively, the visual acuity, corneal transparency, central corneal thickness (CCT), endothelial cell density (ECD) and complications were observed during the follow-up. Results The irritation was disappeared in all of patients. All of the corneas became transparent.The preoperative and postoperative mean CCT of the recipient beds was 859 μm and 553 μm respectively. T value was 5.303 ( t = 5.303, P ＜ 0.01 ). It was extremely significant difference. The mean ECD of the donors was 2987 cells/mm2. The ECD was 1803 cells/mm2 in three months postoperatively. The rate of endothelial cells loss was 41%. The visual acuity improved significantly except 9 eyes which had fundus disorders. Six eyes were better than 0.8. It was 55% in normal retinal function patients (6/11). The inflammatory reaction of the anterior chamber IOL eyes was most serious. Six eyes underwent graft dislocation. Five cases underwent high intraocular pressure. One case occurred graft rejection.These complications occurred in anterior chamber IOL eyes. Conclusions DSAEK combined with phacoemulcification cataract surgery or lens exchange is a safe and effective surgical treatment for corneal endothelial dysfunction with lens disorders. More complications occur in anterior chamber IOL eyes. DSAEK should be cautiously chosen in abnormal iris and chamber angle structural eyes.     

环孢素A不同给药方式抑制兔眼穿透角膜移植术后免疫排斥反应的研究

背景环孢素A（CsA）是治疗角膜移植免疫排斥反应的主要药物,但合适的药物剂型和给药途径对提高药物利用度有重要意义。目的探讨CsA缓释微球结膜下给药、前房给药及CsA滴眼液局部点眼途径抑制兔眼穿透角膜移植术（PKP）后的排斥反应。方法健康清洁级成年新西兰白兔60只60只眼作为受体,健康清洁级青紫蓝兔30只60只眼作为供体。将受体兔按随机数字表法随机分为空白对照组、结膜下给药组、结膜下对照组、前房给药组、前房对照组和CsA滴眼液组,每组10只实验兔。所有实验兔行PKP。术毕结膜下给药组和前房给药组兔眼以相应的给药途径注射12g／LCsA缓释微球悬液0．1ml,结膜下对照组和前房对照组采取相应的给药途径注射空白微球悬液0．1ml,CsA滴眼液组每日应用质量分数1％（10g／L）CsA滴眼液点眼,空白对照组PKP术后不给予CsA药物。术后裂隙灯显微镜下定期观察各组术眼角膜植片的透明度、水肿情况、新生血管生长情况等,并计算术眼的排斥反应指数（RI）。分别于术前,术后3d,术后1、2、3周和术后1、2、3个月用Tono—pen眼压计测量眼压;分别于术后1个月、3个月获取各组植片行常规组织病理学检查。结果术后各组兔眼眼压较术前均明显下降,手术前后兔眼眼压的总体比较差异有统计学意义（F目目：29．210,P=0．000）;同一时间点各组兔眼眼压比较差异无统计学意义（F捆=0．254,P=0．938）。空白对照组、结膜下对照组及前房对照组于术后2～3周出现不同程度的角膜植片混浊和新生血管,术后4周时植片混浊加重,R1分别为8．60±1．52、8．60±0．55和8．80±0．84;结膜下给药组、前房给药组及CsA滴眼液组于术后3周时出现角膜新生血管,但未发现植片混浊,R1分别为4．40＋0．89、3．20±0．84和3．00±0．71,均明显低于空白对照组、结膜下对照组和前房对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。其中前房给药组兔眼术后前房有轻度炎症反应,随时间延长逐渐减轻,至术后3个月时}肖失。组织病理学检查可见,空白对照组、结膜下对照组、前房对照组术眼角膜植片均明显增厚,有大量炎性细胞浸润和新生血管长人;而结膜下给药组、前房给药组和CsA滴眼液组植片的炎性细胞浸润明显减轻,新生血管减少。结论CsA缓释微球经不同途径给药均可抑制兔眼角膜移植术后的排斥反应,其中经前房给药途径的整体疗效较经结膜下给药途径更佳。