过氧亚硝基阴离子诱导大鼠气道上皮细胞凋亡及其机制探讨

目的 观察过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)对大鼠气道上皮(rat tracheal epithelial,RTE)细胞凋亡的影响并探讨其作用机制.方法 体外培养RTE细胞,外源性给予不同浓度ONOO-(0.25、0.50、1.00 mmol/L),培养1、6、12 h后,用流式细胞仪检测ONOO-对RTE细胞凋亡百分率的影响、透射电镜观察细胞形态学变化、琼脂糖凝胶电泳观察DNA裂解情况.结果 不同浓度ONOO-均以时间依赖方式引起RTE 细胞凋亡;透射电镜观察到染色质浓缩并凝集成块,核固缩以及凋亡小体形成等;琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯状条带出现.半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抑制剂Ac-DEVD-CHO可明显抑制ONOO-诱导的RTE细胞凋亡.结论 ONOO-以时间依赖方式引起培养的RTE 细胞发生凋亡.caspase-3活化在ONOO-诱导RTE细胞凋亡中起着重要作用.     

Peroxynitrite诱导下咽癌细胞凋亡与PDCD4基因活性相关

目的  探讨peroxynitrite (ONOO-)作用于下咽癌细胞过程中PDCD4基因表达的变化。方法  以体外培养的下咽癌FaDu细胞系为实验材料,不同浓度的ONOO-作用于FaDu细胞,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,采用Ho.33342/PI荧光双染进行形态学观察, RT PCR及Western-blot检测PDCD4mRNA水平及蛋白表达的变化,评价PDCD4基因在ONOO-诱导FaDu细胞凋亡过程中的作用。结果  ONOO-(50、100、200μmol/L) 作用FaDu细胞24h,能够显著抑制细胞增值,并诱导细胞程序性死亡,同时引起PDCD4mRNA水平显著上调,PDCD4蛋白表达显著增加。结论  PDCD4基因可能在ONOO-诱导下咽癌细胞生长的信号转导调节通路中起到关键作用。     

Peroxynitrite诱导下咽癌细胞凋亡与PDCD4基因活性相关性研究

目的 探讨peroxynitritc(ONOO-)作用于下咽癌细胞过程中PDCD4基因表达的变化.方法 以体外培养的下咽癌FaDu细胞系为实验材料,不同浓度的ONOO-作用于FaDu细胞,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,采用Ho.33342/PI荧光双染进行形态学观察,RT-PCR及Western-blot检测PDCD4mRNA水平及蛋白表达的变化,评价PDCD4基因在ONOO-诱导FaDu细胞凋亡过程中的作用.结果 ONOO-(50、100、200 μmol/L)作用FaDu细胞24 h,能够显著抑制细胞增值,并诱导细胞程序性凋亡,同时引起PDCD4mRNA水平显著上调,PDCD4蛋白表达显著增加.结论 PDCD4基因可能在ONOO-诱导下咽癌细胞生长的信号转导调节通路中起到关键作用.     

PD98059抑制Peroxynitrite诱导人脑血管平滑肌细胞DDR2的表达

目的 探讨过氧亚硝酸盐(ONOO-)诱导人脑血管平滑肌细胞(HBVSMCs)盘状结构域受体2(DDR2)表达的机制.方法 体外培养HBVSMCs,用倒置相差显微镜、吖啶橙染色法和MTT比色法对PD98059预处理的细胞进行细胞形态学及细胞生存率检测,采用Western blot及Real-time PCR技术,检测ONOO-作用下HBVSMCs中DDR2表达及施加ERK1/2抑制剂PD98059后DDR2/MMP-9表达的变化.结果 10 μmol/L ONOO-诱导DDR2在蛋白及mRNA水平上呈现高表达(P＜0.05),随着ONOO-浓度的增加,DDR2逐渐呈现低表达(P＜0.05).PD98059预处理后的HBVSMCs,无明显形态学变化,对其进行生存率检测亦无显著影响(P＞0.05).PD98059显著抑制ONOO-诱导的DDR2/MMP-9表达(P＜0.05).结论 ERK1/2信号转导途径抑制剂PD98059可以抑制ONOO-诱导的DDR2/MMP-9表达,ONOO-诱导HBVSMCsDDR2的表达机制与ERK1/2信号转导途径有关.     

青光眼患者小梁网中ONOO^-的表达及与眼压升高关系的研究

目的检测正常人和原发性急性闭角型青光眼(primary acute angle closure glaucoma,PAACG)及原发性慢性闭角型青光眼(primary chronic angle closure glaucoma,PCACG)患者小梁网组织标本中过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)的表达,探讨小梁网中ONOO-的变化、分布及与青光眼的关系。方法取正常眼6例及PAACG患者14例18只眼及PCACG患者12例15只眼小梁网组织标本,应用形态学观察,免疫组织化学方法检测小梁细胞ONOO-的标志物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)的表达,并采用计算机图像分析系统对检测结果进行分析。结果正常人的小梁网组织标本NT的表达呈弱阳性或不表达,PAACG组小梁网组织中NT呈强阳性表达,PCACG组小梁网组织中NT呈阳性表达,3组间的差异均具有统计学意义(F=25.32,P<0.01),眼压与小梁网NT着色强度呈相关关系(P<0.01)。结论正常人的小梁网细胞ONOO-微弱表达而PAACG与PCACG患者小梁网细胞ONOO-大量表达且其表达量随眼压的升高而增多,表明眼压升高可导致ONOO-过量生成,从而损伤小梁网细胞,进一步加重青光眼眼压升高。     

黄芩苷对过氧化亚硝酸盐引起内皮细胞损伤的细胞保护机制

黄芩苷能否减少过氧化亚硝酸盐(ONOO-)及减轻其对内皮细胞(ECs)的损害鲜有报道。作者研究了黄芩苷清除ONOO-的作用及其对ONOO-引起内皮细胞损伤的细胞保护的分子机理。用改良的Kooy等的方法,通过检测荧光素染料DHR123的氧化,测定黄芩苷清除ONOO-的活性;分别通过检测2,7-二氯二氢荧光素乙酸酯(H-DCFDA)氧化成荧光素2,7-二氯荧光素(DCF),以及4,5-二氨乙酸酯荧光素(NO.指示剂)的变化,测定黄芩苷对O2-和NO.的清除活性;以MTT法检测黄芩苷对ONOO-损害ECs的抑制作用;用分光光度法分析黄芩苷对ONOO-与酪氨酸反应的作用;以蛋白质…     

青光眼患者小梁网中ONOO￣的表达及与眼压升高关系的研究

目的 检测正常人和原发性急性闭角型青光眼(primary acute angle closure glaucoma,PAACG) 及原发性慢性闭角型青光眼(primary chronic angle closure glaucoma,PCACG)患者小梁网组织标本中过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)的表达,探讨小梁网中ONOO-的变化、分布及与青光眼的关系.方法 取正常眼6例及PAACG患者14例18只眼及PCACG患者12例15只眼小梁网组织标本,应用形态学观察,免疫组织化学方法检测小梁细胞ONOO-的标志物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)的表达,并采用计算机图像分析系统对检测结果进行分析.结果 正常人的小梁网组织标本NT的表达呈弱阳性或不表达,PAACG组小梁网组织中NT呈强阳性表达,PCACG组小梁网组织中NT呈阳性表达,3组间的差异均具有统计学意义(F=25.32,P＜0.01),眼压与小梁网NT着色强度呈相关关系(P＜0.01).结论 正常人的小梁网细胞ONOO-微弱表达而PAACG与PCACG患者小梁网细胞ONOO-大量表达且其表达量随眼压的升高而增多,表明眼压升高可导致ONOO-过量生成,从而损伤小梁网细胞,进一步加重青光眼眼压升高.     

黄连及其主要成分小檗碱对人鼻咽癌CNE-2Z生长的抑制作用

目的观察黄连及其主要成分小檗碱对人鼻咽癌细胞CNE-2Z的增殖和细胞周期的作用。方法MTT法、凋亡检测试剂盒检测不同浓度黄连以及小檗碱对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z生长抑制作用以及凋亡;流式细胞仪检测细胞周期的改变;裸鼠实验进行进一步的体内实验。结果黄连及其小檗碱能够抑制CNE-2Z细胞增殖,且随药物浓度增加抑制效应增强,呈现浓度依赖性,不同浓度的黄连和小檗碱分别处理细胞24,48,72h时,抑制率随浓度的增加和时间的延长而增加,其IC50黄连分别为(13.70±2.46)μg/ml,(10.02±3.41)μg/ml、(8.94±2.45)μg/ml,小檗碱分别为(3.59±1.24)μg/ml,(2.84±1.02)μg/ml,(1.47±0.45)μg/ml,各IC50间的差异有非常显著性(P<0.01)。不同浓度黄连和小檗碱作用细胞24h后,G0/G1期细胞明显下降,S期细胞明显升高(P<0.05,P<0.01)。两者对CNE-2Z细胞周期具有阻滞作用,可以阻滞在S期。动物实验显示肿瘤体积减小,差异有显著性。结论黄连及其主要成分小檗碱对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z具有增殖抑制作用,该抑制作用具有剂量和时间依赖性;一定剂量的黄连和小檗碱可能通过阻滞CNE-2Z于S期而抑制其增殖;对鼻咽癌细胞接种的裸鼠肿瘤体积有抑制作用。     

黄连及其主要成分小檗碱对人鼻咽癌细胞CNE-2Z生长的抑制作用

[摘要] 目的 观察黄连及其主要成分小檗碱对人鼻咽癌细胞CNE-2Z的增殖和细胞周期的作用。方法 MTT法、凋亡检测试剂盒检测不同浓度黄连以及小檗碱对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z生长抑制作用以及凋亡;流式细胞仪检测细胞周期的改变;裸鼠实验进行进一步的体内实验。结果 黄连及其小檗碱能够抑制CNE-2Z细胞增殖,且随药物浓度增加抑制效应增强,呈现浓度依赖性,不同浓度的黄连和小檗碱分别处理细胞24,48,72 h 时,抑制率随浓度的增加和时间的延长而增加,其IC50黄连分别为(13.70±2.46) ug/ml、(10.02±3.41) ug/ml、(8.94±2.45) ug/ml,小檗碱分别为(3.59±1.24) ug/ml、(2.84±1.02) ug/ml、(1.47±0.45) ug/ml,各IC50间的差异有非常显著性(p<0.01)。不同浓度黄连和小檗碱作用细胞24 h 后,G0/G1期细胞明显下降,S期细胞明显升高(p<0.05,p<0.01)。两者对CNE-2Z 细胞周期具有阻滞作用,可以阻滞在S期。动物实验显示肿瘤体积减小,具有统计学意义。结论 黄连及其主要成分小檗碱对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z具有增殖抑制作用,该抑制作用具有剂量和时间依赖性;一定剂量的黄连和小檗碱可能通过阻滞CNE-2Z于S期而抑制其增殖;对鼻烟癌细胞接种的裸鼠肿瘤体积有抑制作用。 [关键词] 黄连 小檗碱 鼻咽肿瘤 细胞增殖     

DDR2在Peroxynitrite诱导人中枢血管平滑肌细胞凋亡中的表达

目的  探究过氧亚硝酸盐(peroxynitrite, ONOO-) 诱导人中枢血管平滑肌细胞（HCVSMCs）凋亡过程中盘状结构域受体 (DDR2)基因表达的变化。方法  以不同浓度的ONOO-作用于体外培养的HCVSMCs,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,吖啶橙染色进行形态学观察。同时, 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot 检测DDR2 mRNA及蛋白表达。结果  与对照组相比,以ONOO-作用于HCVSMCs 24h可显著抑制该系细胞增生,诱导细胞凋亡(P<0.05),并引起DDR2 mRNA及蛋白水平总体呈现下调趋势(P<0.05)。结论  DDR2基因可能在ONOO-诱导HCVSMCs凋亡的信号转导调节通路中起关键作用。     

高糖条件下致钙信号改变的机制研究

目的 探讨高糖对大鼠心房肌钙信号的影响及其机制。方法 分离大鼠心房肌细胞,分成2 部分： 第1 部分分左旋葡萄糖（LG）组、正常葡萄糖（NG）组、高葡萄糖（HG）组、HG+ 尿酸组;第2 部分分 过氧化亚硝基阴离子（ONOO-）组、分解后ONOO-（DC-ONOO-）组、ONOO-+ 尿酸组。观察钙瞬变、 钙通道蛋白RYR2、钙调控蛋白FKBP12.6 的变化。结果 HG 组的钙瞬变幅度较NG 组高,ONOO- 增加钙 释放,尿酸可以减弱其效应;HG 组和ONOO- 组RYR2 蛋白的表达降低,尿酸可抑制HG 和ONOO- 导致 的RYR2 蛋白表达效应,高糖可调控RYR2 蛋白上游调控分子FKBP12.6 的表达。结论 ①高糖及ONOO- 增加钙释放,氧化应激抑制因子―尿酸减少钙释放;②高糖减少RYR2 表达,尿酸可以抑制其效应;③高糖 可以通过氧化应激调控RYR2 上游信号通路分子FKBP12.6,从而调控钙信号。     

黄连-大黄-肉桂复方对肝癌细胞增殖及PTEN-PI3K-AKT/SGK1信号通路的影响

目的:观察黄连-大黄-肉桂复方对肝癌细胞增殖的抑制作用,并探索其作用机制。方法:采用醇提法提取黄连-大黄-肉桂复方药液,观察药物作用24 h后SMMC-7721人肝癌细胞株细胞形态的改变;通过MTT法检测不同浓度药物作用24 h、48 h和72 h对肝癌细胞增殖的影响;采用RTq PCR法检测肝癌细胞PTEN、AKT和SGK1基因的mRNA表达。结果:较低浓度的黄连-大黄-肉桂复方作用24 h对肝癌细胞的形态影响较小,而浓度增至2.1 mg/ml可使肝癌细胞部分固缩,大多细胞凋亡,其对肝癌细胞的恶性增殖具有显著抑制作用,并存在时效和量效关系,0.5 mg/ml药物作用48 h即可致肝癌细胞增殖半数得到抑制;药物作用后AKT mRNA表达明显降低,PTEN mRNA表达上调、SGK1 mRNA表达降低。结论:黄连-大黄-肉桂复方能有效抑制肝癌细胞的恶性增殖,且具有时效和量效关系;其抑制作用可能与调节细胞PTEN-PI3K-AKT/SGK1信号转导通路有关。     

黄连生物碱的提取纯化及降脂作用

目的：提取纯化黄连主要生物碱并研究其降脂作用。方法：采用乙醇浸泡、加酸加碱及大孔吸附树脂提取总生物碱,用萃取、柱层析及重结晶分离黄连生物碱。以高脂饲料喂养鹌鹑建立高脂模型,观察各用药组对鹌鹑血清TC、TG、LDL-C及HDL-C影响。结果：小檗碱、黄连碱及巴马汀有明显降低TC、LDL-C水平的作用。结论：小檗碱、黄连碱及巴马汀有明显降脂作用。     

过氧亚硝基阴离子调控谷氨酸脱氢酶的催化功能

目的:观察过氧亚硝基阴离子(ONOO-)对谷氨酸脱氢酶(GDH)的硝基化修饰及功能调控.方法: GDH与ONOO-体外反应,测定酶活性及别构调节效应.Western Blot检测GDH硝基化修饰;制备含"去硝基化酶"的脾脏蛋白,观察能否逆转ONOO-作用.结果: 4～12 μmol/L ONOO-不影响GDH活性和二磷酸腺苷(ADP)别构激活作用,但使三磷酸鸟苷(GTP,10 μmol/L)别构抑制作用由(49±4)%降低至(69±7)%和(75±3)%;36～108 μmol/L ONOO-使GDH活性由(0.81±0.05)kat/kg降低至(0.55±0.06)和(0.29±0.07)kat/kg,使GTP(10 μmol/L)别构抑制作用降低至(83±4)%和(95±7)%;324 μmol/L ONOO-使GDH完全失活. Western Blot检测到ONOO-使GDH发生硝基化修饰.脾脏蛋白可部分逆转上述作用.结论: ONOO-可通过硝基化修饰调控GDH催化功能.     

丹皮酚拮抗过氧亚硝基阴离子致大鼠成骨细胞凋亡的作用

目的探讨丹皮酚拮抗过氧亚硝基阴离子(ONOO-)对体外培养大鼠成骨细胞凋亡的作用。方法用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,采用淬灭流动反应方法体外制备ONOO-,以1 mm o l/L终浓度加入成骨细胞培养体系,作用30 m in后弃去,继续常规培养12 h,用Hoechst33258染色法及TUNEL法检测成骨细胞的凋亡,并以0.1 mm o l/L丹皮酚消除ONOO-(1 mm o l/L)对大鼠成骨细胞凋亡的影响。结果1 mm o l/L的ONOO-可导致大鼠成骨细胞凋亡;0.1 mm o l/L丹皮酚能拮抗ONOO-(1 mm o l/L)所引起的大鼠成骨细胞凋亡。结论丹皮酚0.1 mm o l/L在体外具有拮抗ONOO-(1 mm o l/L)致大鼠成骨细胞凋亡的作用。     

栀子等中药抑制柯萨奇B3病毒的体外实验研究

目的探讨栀子、黄连、黄芩、大青叶及复方制剂在体外抗柯萨奇B3病毒(CVB3)的作用。方法用细胞培养技术比较栀子、黄连、黄芩、大青叶及复方制剂等药物对CVB3引起的细胞病变的抑制作用。结果黄芩抗病毒作用最强,治疗指数(TI)为35.09;黄连抑制病毒增殖的作用最强,TI为83;栀子抑制病毒吸附和增殖作用最强,TI为238.09。结论栀子、黄连、黄芩、大青叶及复方制剂等药物对CVB3增殖的不同环节均有抑制作用。     

黄连解毒汤有效部位对培养大鼠皮层神经元谷氨酸损伤的保护作用

目的观察黄连解毒汤有效部位对培养神经细胞谷氨酸兴奋毒性的保护作用.方法体外培养新生大鼠皮层神经细胞,加入谷氨酸观察谷氨酸对神经细胞的兴奋毒性及黄连解毒汤有效部位的保护作用.结果黄连解毒汤有效部位305 mg/kg能明显增高模型细胞的活性;610、305、153 mg/kg能显著降低模型细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,降低MDA生成;305、153 mg/kg可减少NO生成,610 mg/kg还可提高SOD活性.结论黄连解毒汤有效部位对培养神经细胞谷氨酸兴奋毒性具有显著的保护作用,其机制可能与降低NO含量、抗过氧化作用有关.     

黄芪对过氧亚硝酸盐阴离子导致的血管反应性异常的保护作用

目的 探讨黄芪对过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)导致的血管反应性异常的影响.方法 32只SD大鼠随机分为2组,正常对照组与黄芪灌胃组,每组16只.大鼠喂养4周后处死,取胸主动脉,制备离体血管环标本.每组大鼠血管随机分为不同处理组(ONOO-组、未处理组)孵育.完成孵育后采用大鼠离体主动脉环灌流模型观察2组大鼠血管对苯肾上素(PE)/乙酰胆碱(Aeh)诱导的收缩/舒张反应性的变化.结果 正常对照组不同处理血管在PE的作用下收缩反应性均呈浓度依赖性增高;在高浓度(10、100 μmol/L)时,ONOO-处理组血管对PE的最大收缩力明显高于未处理组(P均<0.05);2组血管在Ach的作用下舒张反应性均呈浓度依赖性增高,在高浓度(100 μmol/L)时,ONOO-处理组血管对Ach的最大舒张率明显低于未处理组(P<0.05).在黄芪灌胃ONOO-处理组与未处理组大鼠血管上述改变均无明显差异(P>0.05).表明ONOO-导致的血管舒缩功能异常可以被黄芪改善.结论 黄芪可改善ONOO-导致的血管反应性异常,因此对血管功能具有保护作用.     

黄连散、二甲双胍及参芪降糖颗粒降糖作用的对比实验研究

目的观察黄连散、二甲双胍及参芪降糖颗粒对链脲佐菌素（STZ）所致的2型糖尿病小鼠降糖作用的区别。方法采用小剂量多次腹腔注射STZ法复制2型糖尿病小鼠动物模型,检测空腹血糖、体重、血清胰岛素的变化及胰岛β细胞病理改变情况。结果给药14d后,黄连散、二甲双胍及参芪降糖颗粒均能降低2型糖尿病小鼠的血糖,增加血清胰岛素含量,有效控制小鼠体重降低,改善胰岛β细胞损坏。与模型组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。黄连散低剂量组降糖作用与二甲双胍比较无统计学意义（P〉0.05）,但优于参芪降糖颗粒（P〈0.05）。结论黄连散降糖效果较参芪降糖颗粒显著,与二甲双胍接近,但其对胰岛β细胞具有更好修复作用。     

黄连素游子导入治疗伤口愈合迟缓、急性感染性疾病的初步总结

一、概述:黄连又名王连、支连、宜连等,因为黄色故名,药用其根也有用其茎,国内产地以广西、陕西、云南、四川等地著名,其中以四川为佳,又称川连,黄连之主要成份为黄连碱(C_(12)H_(15)NO_5),小蘖碱(C_2oH_(17)NO_3),它在祖国医学史上的应用已有两千多年的历史并取得了丰富的经验。二、黄连的制菌作用:黄连有清心火燥脾湿凉血消淤,厚肠止泻的作用又健胃作用可治消渴蛀虫血痢虫疮等疾