潮霉素抗性HBV包装细胞系的构建

目的 配合HBV载体的研究，为HBV载体提供包装。方法 HBV全基因经删除包装信号e区后，插入到潮霉素抗性pMEP4载体，转染HepG2细胞系，用潮霉素筛选形成细胞克隆。检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系，进一步转染稳定表达复制缺损型HBV的质粒，PCR方法观察上清液中病毒的形成。结果 包装细胞系高表达HBsAg和HBcAg：携带重组HBV的G418抗性重组逆转录病毒感染潮霉素抗性包装细胞系后，经两种抗生素同时筛选，在细胞培养上清液中能检出突变型HBV，未检出野生型HBV。结论 删除了包装信号的HBV次全基因，失去了形成完整HBV颗粒的能力，但能为复制缺损型HBV提供包装所需的结构蛋白。     

乙型肝炎病毒C基因截短对S基因转录与表达的影响

目的 研究HBV C基因截短对S基因转录与表达的影响。方法采用分子克隆、定点突变技术构建C基因截短型HBV载体，瞬时转染HepG2细胞。应用RT-PCR、实时荧光定量PCR检测S基因的转录；应用Western blot、ELISA检测S蛋白的表达。结果经酶切鉴定，C基因截短型HBV载体构建成功；C基因截短对HBVS基因转录没有影响，但C基因截短141nt后可显著提高HBV S蛋白表达。结论HBV C基因截短可影响HBV S基因的生物学功能，机制发生在转录后或翻译水平。     

细胞内La表达对乙肝病毒复制的影响研究

目的：研究细胞内La的表达对HBV病毒复制的影响。方法：针对人La蛋白序列设计并合成特异性的SiR—NA，转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，实时荧光定量PCR测定HepG2．2．15细胞中La mRNA变化水平及HBV DNA复制水平。结果：特异性SiRNA干扰La蛋白的mRNA表达，使La在HepG2．2．15细胞中的表达降低；HepG2.2．15细胞分泌在培养上清液中的HBV DNA水平显著下降，相关性分析结果显示，HBV DNA变化水平与La mRNA变化水平呈正相关。结论：细胞内La可以保护HBV RNA免受核酸酶的破坏、促进HBV病毒复制。     

肝癌患者肝组织中2.2 kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体结构及功能的研究

目的 研究肝癌患者肝组织中2.2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体的结构和功能。方法 PCR扩增12对肝癌组织及癌旁肝组织中的乙型肝炎病毒（Hepatitis Bvirus,HBV)全基因组，克隆3.2kb全长HBV基因组及2.2kb剪接变异体基因组，测序并比较它们基因结构的差异。将2.2kbHBV剪接体基因组与全长基因组共同转染HepG2细胞，分别以HBV全长基因组特异性引物及剪接变异体特异性引物对转染后细胞内HBV核心颗粒进行PCR检测，以判定2.2kbHBV剪接变异体对全长HBV复制功能的影响。结果 2.2kbHBV基因组剪接变异体见于所有的癌组织及癌旁组织，相同模板量获得的扩增产物进行图象扫描分析。发现癌组织中2.2kbHBV基因组剪接变异体与全长HBV的比值高于癌旁组织，序列分析表明，2.2kbHBV剪接变异体保留5′端包装信号以及与完整的X基因、C及preC基因。细胞转染细胞显示，加入2.2kb剪接变异体共转染，细胞中3.2kb全长HBV基因组的复制量可增强3-7倍。结论 肝组织内普遍存在2.2kbHBV基因组剪接变异体，该变异体在癌组织中的相对量高于癌旁组织，2.2kbHBV基因组剪接变异体可使全长HBV基因组复制增强，提示可能与肝癌的发生、发展相关。     

HBV感染HepG2细胞早期过程研究

目的 探讨HBV吸附穿入HepG2细胞的方式，明确HBV难以自然感染细胞系的受限因素，为建立HBV自然感染细胞模型奠定基础。方法 在4℃和37℃条件下，HBV吸附HepG2细胞，用PCR方法检测胰酶消化液和细胞内的病毒DNA。另一部分HepG2细胞经过低温同步化处理，接种HBV后，于不同时相分别收集细胞和培养上清液，其中部分细胞进行核浆分离，通过问接免疫荧光、ELISA和PCR方法分别检测其中的病毒抗原和DNA，并且通过选择性PCR检测HepG2细胞HBV cccDNA。结果 在4℃条件下，HBV只是吸附于HepG2细胞膜表面。37℃条件下，部分吸附于HepG2细胞表面的病毒颗粒发生穿人，进入细胞浆，HepG2细胞和胰酶溶液中均可检出HBV DNA。接种病毒后4h、8h、24h HepG2细胞HBV DNA均呈阳性，至48h转为弱阳性，而96h为阴性。各时相上清液HBV DNA和病毒抗原均为阴性。HBV穿入HepG2细胞后，首先主要分布于胞浆中，随后出现胞核聚集性，胞浆中的病毒逐渐减少直至消失(感染后24h)，而胞核中的病毒数量早期逐渐增加，从48h开始呈下降趋势，至96h消失。病毒接种后8h核膜与核浆中均可检出病毒DNA。各时相cccDNA检测始终阴性。结论 HBV可能以“共受体”模式感染靶细胞。病毒脱衣壳过程受阻可能是HepG2细胞不支持HBV复制型感染的主要受限因素。     

重组逆转录病毒载体携带乙型肝炎病毒载体的构建与表达

目的 探索利用逆转录病毒载体表达HBV载体的可能性及复制缺损性HBV能否被正确包装。方法 在逆转录病毒载体中插入表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元，制备重组逆转录病毒后分别用以感染Hep G2和2．2．15细胞，免疫荧光法检测细胞内HBV核心抗原的表达，PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果 在包装细胞系PA317中能形成较高滴度的重组逆转录病毒，用以感染Hep G2细胞后，可检出核心抗原的表达。感染2．2．15细胞后，在培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论 重组逆转录病毒能携带HBV载体在细胞内表达，并在有野生型HBV提供结构蛋白的前提下，发挥HBV载体的功能，可望用于抗HBV基因治疗。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G可能通过G→A突变抑制乙型肝炎病毒的复制

目的研究胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G(A3G)对HBV复制的影响及作用机制。方法利用脂质体介导A3G和HBV的真核表达质粒瞬时共转染人肝癌细胞株HepG2,以空载体pcDNA3.1与HBV真核表达质粒共转染为对照,同时转染含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒载体以判定转染效率。共转染两天后用荧光定量PCR方法定量细胞内核壳体(core)相关HBV DNA水平,用Western blot检测细胞内A3G和HBcAg的表达,并对细胞内core相关HBV DNA X基因进行PCR扩增、T-A克隆和测序,分析X基因中的碱基突变。结果经EGFP判定的转染效率平均为29%。共转染0.5μgA3G和0.5μgHBV的HepG2细胞内core相关HBV DNA量平均下降为对照的8.9%,共转染2μgA3G和0.5μgHBV的平均下降为对照的0.6%。共转染A3G和HBV表达质粒后,HepG2细胞内HBV的X基因中发生G→A突变的数目明显增多,33个克隆中有9个克隆检测到了16～37个G→A突变,突变总数达254个,而对照的33个克隆中仅有2个克隆各检测到2个G→A突变。进一步的分析发现,共转染A3G后发生的G→A突变大多集中于几个热点区域,突变靶点常在GG二核苷酸中的第一个G上。结论胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G可能通过诱导。HBV DNA的X基因发生G→A超突变,抑制HBV在人肝癌细胞HepG2中的复制。     

鸟苷结合蛋白1对柯萨奇病毒B3及乙型肝炎病毒体外介导的不同作用

目的构建人鸟苷结合蛋白1（hGBP-1）真核表达质粒，观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3（CVB3）和乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因，克隆到pCR2．1TA克隆载体，再亚克隆到pcDNA3．1（-）真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞，Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1．3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平；Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒，能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞，不能抑制HBV复制，HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用，CVB3感染量显著降低，尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用，但不能抑制HBV的复制。     

大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因（GLUT1）的复制缺陷型重组腺病毒载体，为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-Glut1，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-Glut1，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印迹法（Western blotting）从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果:经PCR分析及DNA测序显示GLUT1 cDNA序列正确；筛选出重组腺病毒质粒pAd-Glut1后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及Western blotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论:成功扩增了大鼠GLUT1基因并构建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。     

HBc二聚体组装核衣壳相关功能域突变对HBV复制的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)二聚体组装相关功能域突变对核心颗粒组装及HBV复制的影响.方法 基于HBc空间结构,PCR定点诱变二聚体组装核衣壳相关功能域重要氨基酸位点,以pcDNA3.1为载体构建4个突变体表达质粒pHBc14-18M、pHBc120-135M、pHBc23-39M和pHBc122-139M.将突变质粒与HBc缺失的含1.2拷贝HBV基因质粒pHBV1.2-core-共转染HepG2细胞,通过Northern blot检测HBV前基因组(pgRNA),Southern blot检测复制中间体,非变性琼脂糖凝胶电泳(native agarose gel electrophoresis)及Western blot检测细胞核心颗粒观察突变质粒自身形成核衣壳情况.将突变质粒与含有1.2拷贝HBV基因质粒pHBV1.2共转染HepG2细胞观测突变质粒对野生型HBc组装及HBV复制的影响.结果 突变质粒与pHBV1.2-core-质粒共转染HepG2细胞,pHBc14-18M、pHBc120-135M和pHBc122-139M突变能够组成核衣壳样结构.pHBc23-39M不能形成核衣壳样结构.Northern blot结果显示所有突变质粒组均未见pgRNA条带,Southern blot检测复制中间体也未见条带.将突变质粒与pHBV1.2共转染HepG2细胞,pHBc14-18M、pHBc120-135M和pHBc122-139M组HBV复制中间体及上清中病毒颗粒明显减少,而pHBc23-39M组无减少.结论 HBc23-39位氨基酸突变可阻止二聚体多聚化,不能形成核衣壳样结构,且不能与野生HBc二聚体相互作用.HBc14-18、120-135、122-139区域的氨基酸突变,能够形成核衣壳样结构但不支持HBV DNA复制,并且能与野生HBc二聚体相互作用,形成杂合体,干扰野生型HBV DNA的复制.     

稳定分泌重组HBV载体颗粒细胞系的构建

目的 制备一个持续分泌表达杀稻瘟菌素抗性基因(BsdR)的重组乙型肝炎病毒细胞系.方法 删除HBV质粒中各基因的表达,在S基因区插入目的 基因BsdR,以构建载体质粒pCH-BsdR;具有G418抗性的无包装信号的HBV辅助质粒pcDNA3.1-CH3142与载体质粒共转染HepG2细胞,经G418和Bsd共筛选,获得细胞克隆,进行系列检测.结果 挑选36个细胞克隆,经检测,最终筛选出3个细胞株,具有形成松弛环状DNA的能力,细胞培养上清液中病毒定量分别为4.1×106、3.6×106、1.2×106拷贝/ml.观察到有囊膜的重组HBV颗粒的形成.未检测到野生型HBV的产生.结论 该细胞系能够大量制备重组HBV载体颗粒,有助于HBV载体在基因治疗方面的应用和易感细胞系的筛选.     

霉酚酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

目的:探讨霉酚酸（MPA）在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。 方法:将不同浓度的MPA（1-20 mg/L）作用于HepG2.2.15细胞，在外加或不加鸟嘌呤核苷（简称鸟苷）的情况下，分别收集第4 d细胞培养上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg），采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测细胞内乙型肝炎病毒核心蛋白mRNA（HBV core mRNA）,狭缝印迹杂交法定量分析细胞内 HBV DNA。 结果:在不外加鸟苷情况下，MPA对HBV复制具有抑制作用，随着浓度增加，对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升，细胞内HBV DNA复制水平下降。外加鸟苷后能逆转MPA对HBV复制的抑制作用。 结论:MPA对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌及HBV DNA复制具有抑制作用。MPA可能通过减少细胞内鸟苷酸的合成来实现对HBV复制的抑制。     

乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变株复制质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒 (HBV)前C区和基本核心启动子区 (BCP)突变株的复制质粒。方法　以含 1 2倍拷贝HBVDNA全基因的质粒 (pHBV1 2 )为工具 ,采用分子克隆、PCR定点诱变、限制性酶切长度多态性和序列分析等技术构建目的质粒。转染肝癌细胞株Huh7后 ,测定培养上清HBsAg、HBVDNA来了解病毒抗原的表达和病毒复制。结果　成功构建了 10种HBV全基因前C区 /BCP区突变的表达质粒 ,转染肝癌细胞株 ,获得病毒的表达和病毒颗粒的分泌。其中 ,pUC HBVT176 2、A176 4双突变以及pUC HBVT175 3突变株复制效率较高 ,转染细胞培养上清的HBVDNA为3 16× 10 5拷贝 ml。野生型复制子培养上清HBVDNA含量稍低于BCP突变复制子。结论　获得 10株含有不同前C区和BCP区突变的HBV全基因复制质粒 ,为体外进一步研究上述变异的生物学意义提供基本模型。     

Hepatitis B virus regulatory HBx protein binding to DDB1 is required but is not sufficient for maximal HBV replication

Robust hepatitis B virus (HBV) replication is stimulated by the regulatory HBx protein. HBx binds the cellular protein DDB1; however, the importance of this interaction for HBV replication remains unknown. We tested whether HBx binding to DDB1 was required for HBV replication using a plasmid based replication assay in HepG2 cells. Three DDB1 binding-deficient HBx point mutants (HBx⁶⁹, HBx^90/91, HBx^R96E) failed to restore wildtype levels of replication from an HBx-deficient plasmid, which established the importance of the HBx-DDB1 interaction for maximal HBV replication. Analysis of overlapping HBx truncation mutants revealed that both the HBx-DDB1 binding domain and the carboxyl region are required for maximal HBV replication both in vitro and in vivo, suggesting the HBx-DDB1 interaction recruits regulatory functions critical for replication. Finally we demonstrate that HBx localizes to the Cul4A-DDB1 complex, and discuss the possible implications for models of HBV replication.     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。     

HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达

目的：研究GM-CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用。方法：采用PCR方法，扩增HBV preS2 S基因约846 bp的片段和rhGM-CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过T-A克隆技术和基因定向克隆，构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒HBV preS2S-rhGM-CSF成功地构建。将其转染HepG2细胞后，目的基因的转录通过RT-PCR得到证实，而且表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-preS2和抗-GM-CSF单克隆抗体(mAb)均产生特异性反应。结论：融合基因表达载体pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙肝DNA疫苗奠定了实验基础。     

原蛋白转化酶在转化生长因子β_1抑制HBV复制效应中的作用

目的:探讨原蛋白转化酶(PCs)在转化生长因子β1(TGFβ1)抑制HBV复制效应中的作用。方法:常规培养的HepG2.2.15细胞加2μg/L或5μg/L重组TGFβ1或/和20μmol/L PC抑制剂作用18h,收集细胞提取细胞总RNA和HBV衣壳DNA,采用荧光定量PCR技术检测PC mRNA和HBV DNA含量。结果:HepG2.2.15细胞的7种PCs均有不同程度的表达。加用重组TGFβ1后除PC5/6下调外,其余PCs均显著上调。尽管PC1/3和PC2上调最显著,但结合基础表达水平的分析显示furin和PACE4在TGFβ1处理前后均为优势表达PCs。在HepG2.2.15细胞上,进一步使用PC抑制剂可消除TGFβ1抑制HBV复制的效应。结论:上调PCs mRNA表达是TGFβ1抑制HBV复制的重要中间环节。此结果对进一步探讨TGFβ1有效干预HBV复制具有积极意义。