基于PCR技术可视化鉴别金钱白花蛇方法的建立

目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtDNA Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。     

应用PCR-RFLP方法鉴定梅花鹿茸与马鹿茸

目的 建立一种应用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿茸与马鹿茸的方法。方法 提取各种鹿茸样品的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对正品鹿茸的特异性片段进行扩增,鉴别鹿茸的真伪,然后对正品鹿茸利用动物通用引物进行PCR扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对正品鹿茸的种属来源进行确证。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可将梅花鹿茸及马鹿茸与驯鹿、麋鹿、新西兰鹿等伪品鹿茸加以区分,通过对限制性内切酶Msp I 进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿茸与马鹿茸。结论 本实验建立了一种基于限制性片段长度多态性技术快速、准确的鉴别鹿茸真伪及种属鉴定的方法,为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

特异性扩增技术鉴定龟甲与鳖甲

目的基于特异性扩增建立动物药龟甲与鳖甲的真伪鉴定技术。方法根据龟甲与鳖甲及3种常见伪品的全基因组序列的差异设计了5对特异性引物(PCR、PTS、PMS、PPS、PAF),采用SDS法、酚仿抽提法从龟甲与鳖甲中提取与纯化DNA,并通过聚合酶链式反应(PCR)对目标片段进行扩增,产物以琼脂糖凝胶电泳分析及凝胶成像系统检测,并根据电泳条带的有无及分子量大小以鉴定真伪。结果龟甲与鳖甲及其常见伪品巴西龟、花龟、佛罗里达鳖的DNA经扩增后分别在120、120、81、105、114 bp处产生条带,且引物间无交叉反应,体现出很强的专属性,5个物种DNA的检出限为1 ng。自制药材、饮片、掺伪品均扩增出与目的片段相一致的条带。在市售样品中,18批龟甲和20批鳖甲经鉴定为正品,2批龟甲药材经鉴定为来源于巴西龟的伪品。结论本文所建立的技术可准确、快速地鉴定龟甲与鳖甲的真伪,有助于监控其产品质量。     

桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒的研制与评价

目的 本研究旨在研制一种快速检测试剂盒,鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,并对其进行性能评价。方法 建立DNA提取方法,确保有效提取桃仁及苦杏仁基因组DNA,紫外分光光度法测其浓度及纯度。美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询并比对桃仁及苦杏仁的ITS序列,针对特异性位点,NCBI Primer-Blast设计种属特异性引物。建立并优化聚合酶链式反应(PCR)检测体系,DH5α感受态细胞克隆特异性片段,测序验证体系准确性,制备阳性对照。组装DNA检测试剂盒,对其特异性、稳定性及重复性进行评价,并对市售桃仁和苦杏仁样品进行检测。结果 所建立DNA提取方法,提取效率高,DNA质量浓度高于100 ng·μL^-1,A_260/280处于1.80～2.10之间。该试剂盒可准确鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,检测灵敏度高,特异性强,最低检测限为1 ng·μL^-1。反复冻融20次后仍可有效检测,可于-20 ℃保存1年。20个市售样品中检出1个桃仁伪品及2个苦杏仁伪品,其余均为正品。结论 桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒特异性强、灵敏性高、稳定性好,具有良好重复性,可快速鉴定桃仁及苦杏仁,为桃仁中药材市场质量安全管理提供有力支持。     

蛤蚧真伪鉴定试剂盒的研制与性能评价

目的 蛤蚧作为我国的名贵中药材，资源少，市场需求量大，导致市场常有混伪品出现，因此研制蛤蚧真伪鉴定试剂盒，为蛤蚧药材鉴定提供新的方法。方法 以蛤蚧细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)为靶基因，设计特异性引物，确定合适的PCR反应条件，研制蛤蚧真伪鉴定试剂盒。结果 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，正品可以扩增出约250～500bp之间(473bp)的扩增条带，而伪品无蹼壁虎和石龙子均没有条带。结论 研制出的蛤蚧真伪鉴定试剂盒特异性强，灵敏度高，重复性好，适用范围广，操作简单，结果准确，可以为蛤蚧的DNA分子鉴别提供技术保障，可以保证药源无误，药效可靠。     

檀香及其混淆品的鉴别与数字化研究

目的 通过对正品檀香及其市售混伪品进行比较研究,找出特征性鉴别点。方法 采用性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、挥发油含量测定及气相色谱-质谱联用自动解卷积定性系统(GC-MS-AMDIS)自动智能化成分鉴定等手段,对正品檀香及其市售混伪品进行比较研究。结果 性状鉴别中,檀香独有的奶香味为其鉴别点;显微鉴别中油脂的颜色,分布及方晶数量可用于区分正伪品;伪品的挥发油成分与正品檀香差异较大,且不以檀香醇为主要成分;挥发油的含量测定可作为最准确、简便的检验手段,用以判断檀香样品是否符合药典标准的规定。结论 建立正品檀香及市售混伪品的鉴别方法,并给檀香的质量评价提供依据。     

基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究

目的:筛选获得金银花真伪鉴别SNP位点并建立双向位点特异性PCR方法,用于鉴别金银花和其常见伪品以及两者的混杂品.方法:通过对GenBank收录的忍冬属植物叶绿体trnL-trnF序列进行对比分析,获得金银花真伪鉴别SNP位点;并依据该SNP位点设计特异性引物,对84份金银花基原植物及其市售饮片、伪品进行双向位点特异性PCR扩增,并根据真伪品的特异性条带进行金银花药材鉴别.结果:退火温度为61℃时,正品均出现468 bp的条带,红腺忍冬、华南忍冬、灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、水忍冬、金银忍冬、郁香忍冬、新疆忍冬、繁果忍冬等9个伪品均出现324 bp的条带,在正品DNA中掺入5％以上伪品时同时出现正品和伪品条带.结论:双向位点特异性PCR可以鉴别金银花真伪品及两者的混杂样品.     

柴胡及其常见伪品的DNA指纹鉴定

目的:建立柴胡及其伪品DNA指纹鉴别方法.方法:采用改良的CTAB法提取柴胡及常见伪品的干根基因组DNA,设计鉴别正品柴胡及其伪品的特异性引物,利用PCR扩增技术对正品柴胡及其伪品进行DNA指纹鉴定.结果:改良的CTAB法提取出大小为23 kb的基因组DNA条带,纯度在(1.71±0.11),且经特异引物PCR扩增,只有正品柴胡能扩增出173bp大小的片段,而伪品未能扩增出目的片段.结论:柴胡DNA具有特异性指纹特征,可作为市售柴胡的真伪鉴定依据.     

基于巢式PCR方法联合Sanger测序技术对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪的鉴定

目的 基于DNA条形码技术建立一种可以实现对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪品鉴定的方法。方法 首先以COⅠ通用引物对大黄庶虫丸中成药DNA进行一轮聚合酶链式反应(PCR)扩增,随后采用自行设计和筛选出的水蛭通用引物对一轮PCR反应液进行二轮PCR扩增,联合Sanger测序技术,对二轮PCR扩增产物测序,最后对测序结果峰图采用seqman软件进行序列拼接,将拼接后的DNA序列在NCBI数据库中用BLAST在线比对软件进行比对判定,进而鉴定水蛭成分真伪。结果 本实验建立的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术通过了对9份经COⅠ通用引物鉴定的水蛭干药材的验证,结果验证两方法鉴定结果一致。同时采用本研究建立的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术对收集的14批大黄庶虫丸进行鉴定,共有5批鉴定出含有伪品水蛭成分。结论 本实验建立的的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术能够实现对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪品的鉴定,对中成药的质量控制具有一定的意义。     

杜仲药材特异性PCR的鉴定方法研究

目的:利用杜仲药材及其混伪品的rDNA-ITS序列差异设计DNA特异引物,实现杜仲药材的快速分子标记鉴定。方法:从NCBI数据库下载杜仲药材及其混伪品的rDNA-ITS序列,比对获得差异DNA片段,设计特异性引物,优化PCR扩增条件和检测方法。结果:扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和荧光反应检测,杜仲药材能扩增400bp的鉴定条带,加入SYBR GreenⅠ染料后在紫外光下有绿色荧光,而其混伪品不具特异条带和绿色荧光。结论:特异性PCR能有效鉴别杜仲药材及其混伪品,通过条件优化显著缩短PCR扩增时间,荧光染料检测能更直观显示鉴定结果,为杜仲药材的快速鉴定提供了新的思路和方法。     

环介导等温扩增技术在西洋参鉴定中的应用

目的 探讨利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术鉴别西洋参的方法.方法 针对西洋参的CYP450基因设计特异性引物,应用RT-LAMP(real time-LAMP)、琼脂糖凝胶电泳和可视化检测3种方法对LAMP检测方法进行优化,并对其灵敏性...     

梅花鹿茸和马鹿茸多肽化学性质及生物活性比较

目的 :比较梅花鹿茸多肽和马鹿茸多肽化学组成及生物活性异同。方法 :用相同工艺提取梅花鹿茸和马鹿茸多肽组分 ;采用电泳和质谱等分离分析手段比较多肽组分的化学性质 ;用 [³H]TdR参入细胞DNA比较两种鹿茸多肽的促细胞增殖活性。结果 :梅花鹿茸和马鹿茸多肽组分的电泳图谱和质谱有明显差异 ,而中国的东北马鹿茸和新西兰马鹿茸多肽的图谱十分相近 ;梅花鹿茸和马鹿茸多肽对软骨细胞和表皮细胞分裂都有促进作用 ,但马鹿茸多肽对表皮细胞的增殖作用比梅花鹿茸多肽强。结论 :梅花鹿茸和马鹿茸多肽的化学性质和生物活性有较大差异。     

葡萄球菌分类与鉴定的两种方法研究与探讨

目的 鉴于葡萄球菌传统表型鉴定方法的局限性,为确保药品微生物检验中葡萄球菌检验结果的准确性,依据《中国药典》2015年版四部通则,利用DNA测序技术对15株菌株成功进行了序列测定,并与传统的生化鉴定方法进行比较和分析。方法 用PCR仪扩增提取到的葡萄球菌基因组DNA,然后进行琼脂糖凝胶电泳并对目的条带进行切胶回收,用ABI 3500测序仪对15株菌株进行DNA序列测序,对测定结果用CExpress软件进行拼接,并与数据库进行比对,用该结果与VITEKⅡ生化鉴定仪的结果进行比较和分析。结果 15株菌株的测序结果除了10号菌株DNA相似度为93.38%外,其余均大于99%,序列比对结果与VITEKⅡ生化鉴定仪的结果一致。结论 利用DNA测序技术对葡萄球菌进行鉴定的结果比传统的表型鉴定和生化鉴定结果更为准确可靠。     

鹿茸线粒体DNA的指纹鉴定研究

 目的 通过鹿茸特异性引物鉴别和随机扩增多态DNA(RAPD)鉴别的比较,选择一种更简便的方法用于鉴别鹿茸。 方法 采用盐析法从梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸、市售鹿茸等样品中抽提线粒体DNA,并应用试剂盒进行纯化。进行特异性引物扩增和序列测定,同时进行随机扩增多态DNA扩增。结果 梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸以及部分市售鹿茸经特异性引物扩增后均可在琼脂糖凝胶中显示313 bp片段,只是条带亮度不同。而其余市售鹿茸无扩增条带; 随机扩增多态DNA不仅有效显示阳性与阴性的DNA扩增结果,而且对梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸的聚合酶链反应产物的差异,以不同的条带数目和条带亮度得以验证。结论 随机扩增多态DNA鉴别鹿茸真伪的方法更准确快捷,通过随机扩增多态DNA扩增后主条带与梅花鹿茸或马鹿茸扩增的条带大小和亮度一致,则为正品;如不一致,则为《中国药典》规定外的鹿茸或其他混淆品。这种方法对于筛选、甄别市售动物中药材,特别是名贵中药具有广阔的应用前景。     

基于化学指纹图谱和多指标成分含量测定的梅花鹿鹿茸质量评价

目的采用高效液相色谱法建立鹿茸中核苷类成分指纹图谱,进行聚类分析与主成分分析,并比较梅花鹿鹿茸药材中6种核苷成分的差异。方法采用高效液相色谱法对15批不同产地梅花鹿鹿茸进行测定,以甲醇-0.07%冰醋酸为流动相梯度洗脱,流速1 mL·min^-1,检测波长为254 nm。运用国家药典委员会"中药色谱指纹图谱相似度评价软件"2012版进行评价,并对6种核苷类成分进行含量测定。结果建立了鹿茸核苷类成分HPLC指纹图谱,确定了6个共有峰构成鹿茸药材的特征峰,且方法学考察达到标准。结论该法所建立的鹿茸核苷类指纹图谱特征性强、方法简便,结合6种核苷类成分含量测定可更好控制其质量,对梅花鹿鹿茸的鉴定及质量控制具有指导意义和参考价值。     

应用多重PCR技术鉴别3种肾源性中药的实验研究

目的 建立一种应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别3种肾源性药品的方法。方法 提取梅花鹿、驴、犬3个物种肾组织的基因组DNA,通过多重PCR对梅花鹿、驴、犬的特异性片段进行扩增,鉴别样品中是否含有梅花鹿、驴、犬3种动物源性成分。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可同时将梅花鹿、驴、狗的肾与其他物种进行区分。结论 本研究建立了一种基于多重PCR技术的快速、准确的同时鉴别梅花鹿、驴、犬3个物种肾源性药品方法,为解决药用性产品易混、难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

鹿角与鹿角脱盘显微鉴定研究

目的:利用显微特征参数,分析比较鹿角与鹿角脱盘显微结构差异,为鹿角粉与鹿角脱盘粉鉴别,以及两者质地差异性提供显微结构基础。方法:采用光学显微镜观察鹿角脱盘、鹿角及鹿骨粉末显微特征,并测定和比较三者的骨陷窝长/短径比值和骨陷窝面积占比显微特征数。结果:鹿角脱盘骨陷窝长/短径比值为2.04~2.38、骨陷窝面积比为35.04%~45.82%;鹿角的骨陷窝长/短径比值为1.69~2、骨陷窝面积比为40.60%~61.77%;鹿骨骨陷窝长/短径比值为1.54、骨陷窝面积比为71.8%。结论:鹿角、鹿角脱盘及鹿骨中三者显微鉴定参数均具有明显的差异性;表明骨陷窝长/短径比与骨陷窝面积比,不仅可作为鹿角与鹿角脱盘显微鉴定参数;也阐释了鹿角脱盘角质地比鹿角更为坚硬的组织结构基础,即随着骨陷窝形态由圆变长、骨陷窝面积比降低,其骨化程度增加、质地更加坚硬。     

基于电子鼻技术的不同品质鹿茸饮片气味特征分析

目的:基于电子鼻技术对不同品质鹿茸饮片气味特征进行分析与表征。方法:采用PEN3型电子鼻系统,分析22批鹿茸样品的气味特征,以对传感器响应值为指标,进行传感器区别贡献率分析(Loadings)、主成分分析(PCA)、线性判别分析(LDA)。结果:Loadings分析表明,5个传感器对鹿茸饮片气味特征具有较好的响应,不同规格鹿茸饮片气味差异贡献率主要体现为氮氧化物类、甲烷等短链烷烃、有机硫化物、醇醚醛酮类、芳香成分、无机硫化物等成分;PCA表明不同品种与规格鹿茸饮片,其气味的差异性比较明显;LDA发现不同品种及规格鹿茸饮片(除梅花鹿白片与粉片外)样品的气味差异均较明显,表明构成气味的物质存在差异性。结论:电子鼻技术可阐明不同品质鹿茸饮片气味的物质基础;不同品质鹿茸饮片气味存在差异性可揭示鹿茸饮片气味的科学内涵并为其质量控制提供参考。