环介导等温扩增联合核酸层析试纸快速鉴定燕窝基原

目的:应用环介导等温扩增技术(LAMP)联合核酸层析试纸(LFD),基于燕窝中残留的线粒体DNA(mtDNA)建立燕窝基原的鉴定方法。方法:以不同生物基原的燕窝样品及伪品为研究对象,提取mtDNA,设计LAMP引物,建立LAMP扩增方法,并评价LAMP扩增浊度法检测与恒温水浴LAMP扩增联合LFD检测方法的特异性及灵敏度。结果:当反应温度为63℃时,燕窝线粒体中的细胞色素基因(mtDNA-cytb)的扩增效果最佳,而且LAMP扩增浊度检测与恒温水浴LAMP扩增联合LFD检测表现出一致的结果,均能有效区分燕窝样品的基原及伪品;在4.32×10~8～4.32×10~3 copies/μL的质粒标准品中具有良好的扩增检测效果。结论:LAMP扩增联合LFD的检测方法可以检测出燕窝核酸成分,对燕窝的基原鉴定具有良好的特异性和灵敏度,用于燕窝的检测快速准确,灵敏简便。     

两种快速鉴定甘草方法的比较

目的:建立快速检测中药材甘草的荧光定量PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)两种技术,并对它们的特异性和灵敏性进行比较。方法:以中药材甘草作为实验对象,提取DNA后,用设计的PCR引物及LAMP引物组合分别对甘草进行普通PCR、荧光定量PCR以及LAMP实验,检测引物的特异性,同时建立模板DNA的浓度梯度,对荧光定量PCR及LAMP的灵敏性进行检测。结果:甘草的特异性序列可以通过荧光定量PCR得到有效扩增,而与甘草相近的混伪品结果显示阴性。荧光定量PCR最低可检测到甘草的浓度为0.67×10~(-4)ng/μL。在LAMP特异性检测中,甘草出现浊度值,其他混伪品显示阴性。灵敏度性检测中,LAMP检测在60 min反应时间内同样检测到的甘草的最低DNA浓度为0.67×10~(-4)ng/μL,反应产物加入荧光染料SYBR GreenⅠ后反应液呈现肉眼可观察的明显的亮绿色。结论:LAMP检测和real-time PCR检测具有相似的特异性、灵敏度和精确性,但LAMP检测方法更为简单、方便,所需时间更短,而且不需要昂贵的仪器。因此,LAMP检测中药的方法更适合于对中药材甘草检测的推广使用。     

中药地龙中参环毛蚓环介导等温扩增快速检测方法

[目的]建立中药材地龙中参环毛蚓的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,实现对参环毛蚓的快速检测。[方法]采集不同产地地龙,提取总DNA后将所提取的总DNA进行线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因片段扩增、测序、比对,判断各产地地龙物种。用设计的LAMP引物组进行地龙LAMP实验,反应结束后向扩增产物中加入核酸染料SYBR GreenⅠ,分别在自然光、紫外光下直接通过肉眼来观察颜色变化及利用琼脂糖凝胶电泳来检测其引物的特异性。[结果]利用新设计的LAMP引物对参环毛蚓实现了特异性扩增,且检出限达40 fg/μL,具有极高的灵敏度。[结论]利用LAMP技术可实现参环毛蚓的现场快速检测。     

环介导等温扩增法鉴定检测冬虫夏草

目的建立冬虫夏草的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,实现对冬虫夏草的快速检测。方法针对冬虫夏草的CS2 serine protease(csp2)基因设计LAMP内外引物对;利用CTAB法提取冬虫夏草DNA;优化扩增反应条件;采用包括冬虫夏草在内的6种不同虫草进行LAMP扩增,并对阳性产物酶切鉴定以检测其特异性,通过对模板DNA的10倍梯度稀释检测其灵敏度;紫外灯下观察凝胶电泳或加入荧光染料SYBR Green I的扩增产物。结果设计的LAMP引物可以特异地针对冬虫夏草的csp2基因进行LAMP扩增,产物可被限制性内切酶Taq1酶切,且有较高的灵敏度,检出限达6 pg/mL。结论 LAMP法可以实现对冬虫夏草的快速鉴定检测,在中药鉴定中有着广阔的应用前景。     

中药人参与西洋参饮片的电子鼻检测方法及识别模式

目的:利用电子鼻技术研究中药人参与西洋参饮片的气味检测方法进行分析,采用PCA模式识别方法,达到准确、快速鉴别人参、西洋参饮片的目的。方法:通过正交试验对人参、西洋参样品的粒径,检测样品量,顶空进样量,孵化时间,孵化温度等重要因素进行筛选,确定人参、西洋参饮片电子鼻检测的最佳条件;并采用归一法对数据进行特征提取,通过PCA多元统计学方法对特征数据进行分析。结果:建立了人参与西洋参饮片的电子鼻检测方法,得到人参、西洋参气味识别指纹图谱,建立了人参与西洋参饮片的PCA识别模式。结论:本实验采用电子鼻技术建立了人参与西洋参饮片准确而快速的鉴别方法,为中药真伪的快速鉴别及气味的科学化、标准化研究提供了新的思路。     

利用线粒体 cox Ⅱ内含子对西洋参和人参的分子鉴别

目的:基于西洋参和人参在线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(coxⅡ)的内含子对西洋参和人参进行鉴别,为人参类药材提供简单准确的分子检测手段。方法:利用通用引物对人参和西洋参线粒体coxⅡ基因的内含子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,将扩增后的序列进行双向测序,通过序列比对挖掘人参和西洋参的插入/缺失序列。根据人参和西洋参的特异性插入序列分别设计两者的品种特异性引物,建立鉴别人参和西洋参的多重PCR体系,并确定该多重PCR体系的检测限。结果:在线粒体coxⅡ的内含子中发掘了人参和西洋参的插入/缺失序列。在多重PCR体系下,人参产生了729 bp的条带,西洋参产生了141 bp的条带,人参和西洋参的混合品则分别产生了729 bp和141 bp的条带。该多重PCR体系可以检测人参中0. 1%的西洋参掺入,检测限低至0. 001 ng。结论:该方法建立的多重PCR体系既不需要对反应体系进行优化,也不需要引入额外的碱基错配,可以对不同来源的人参和西洋参进行准确的鉴定,为人参和西洋参植物来源的鉴定提供了新的分子标记方法。     

人参和西洋参特有挥发性成分鉴别

目的: 对比研究人参和西洋参挥发性成分,探讨用于鉴别的可能性。 方法: 人参和西洋参分别采用水蒸气蒸馏法、索氏提取法、固相微萃取法和吹扫捕集法得到挥发性成分,运用GC-MS技术分离与检测,所得总离子流图通过NIST谱库检索并结合保留指数(Kovats' RI)对具体化学成分进行分析和鉴定。 结果: 4种方法提取的人参和西洋参挥发性气味成分种类和含量存在差异,水蒸气蒸馏共鉴定人参样品萜类化合物42个(相对含量69%),西洋参28个(41%);索氏提取共鉴定人参样品萜类化合物26个(50%),西洋参15个(18%);固相微萃取共鉴定人参样品萜类化合物18个(49%),西洋参5个(46%);吹扫捕集共鉴定人参样品萜类化合物2个(4%),西洋参4个(13%)。 结论: 同一方法条件下人参和西洋参各自具有的特征性成分,可用于辅助区别人参和西洋参。     

西洋参实时荧光定量PCR快速鉴别方法的建立

基于ITS2片段序列特征,该研究设计了西洋参的特异性引物、探针,通过条件的优化建立了西洋参的实时荧光定量PCR快速鉴别方法。利用该方法对43个中药材样本进行了验证,结果能准确地鉴别出43个药材样本中的22个西洋参,并且灵敏度高,检测限可达到1×10~(-4)ng。该方法具有准确、快捷、灵敏的特点,可对西洋参及其加工产品进行准确的鉴别和检测,应用前景广阔。     

西洋参对卵巢早衰大鼠卵巢HPGDS PLA_2G_4A、PTGS_1基因表达的影响

目的:观察西洋参对卵巢早衰(POF)大鼠基因表达的影响。方法:成年雌性SD大鼠连续14 d腹腔注射4-乙烯基环己烯双环氧化物(VCD)80 mg/kg建立POF模型。模型复制成功后随机分为2组,西洋参组灌服西洋参2.25 g/kg;模型组灌服等容量生理盐水,每d 1次共30 d;正常对照组不做任何干预。对各组大鼠进行一般状况观察,采用电化学法检测血清E_2、FSH及LH水平,采用实时定量PCR(QRT-PCR)方法,检测各组大鼠卵巢组织HPGDS、PLA_2G_4A及PTGS_1的表达。结果:西洋参组大鼠较POF模型组体毛柔顺而整洁,活动敏捷;西洋参组大鼠血清激素水平更趋近于正常对照组;QRT-PCR实验结果显示,与POF模型组比较,西洋参组卵巢HPGDS、PLA_2G_4A及PTGS_1表达显著下调。结论:西洋参能够缓解卵巢的衰竭、降低VCD对卵巢的损伤。     

西洋参UPLC-UV-ELSD指纹图谱研究

目的采用UPLC-UV-ELSD法研究6个产地28个批次西洋参药材,对不同产地西洋参采用指纹图谱聚类分析、主成分分析(PCA)及相似度评价等技术进行研究,为西洋参药材的品质评价及生产区划提供参考。方法采用Waters Acquity UPLC色谱系统,TUV检测器,ELSD检测器,色谱柱为ACQUITYUPLC~(TM) BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7μm),以乙腈-水进行二元梯度洗脱,检测波长203 nm,柱温30℃,漂移管温度为50℃,喷雾器参数50%,氮气压力为275.8 kPa(40 psi)。结果建立了西洋参的UPLC特征指纹图谱共有模式,标定12个共有峰,采用10个对照品指认了10个共有峰,PCA分析结果显示,北京、吉林、黑龙江地区的西洋参中人参皂苷Rg_1、Re、Rc、Rb_2、Rb_3等成分要区别于美国、山东、陕西地区的西洋参;而美国、山东、陕西产区西洋参中人参皂苷Rg_2、Rb_1、Rd区别于北京、吉林、黑龙江地区。结论所建立色谱条件稳定性及重复性良好,可为西洋参药材的质量评价及质量控制提供依据。     

从人参药性历史记载的变化看单味药药性成因

总结人参药性成因及单味药药性研究的意义,为中药药性研究提供参考。通过本草学研究,考证历代中医药古籍文献对于中药人参药理药性与功效应用的论述,从“单味药药性成因假说”角度,辨析单味药人参药性历史变化过程,总结单味药人参药性成因。人参药性历史变化过程是中医学具体理论流派指导下的不同流派临床实践经验总结过程,是中药临床功效与临床用药倾向影响中药单味药药性形成过程的具体实例。单味药人参的复杂药性成因体现了中药单味药药性理论与药性实践形成过程中的科学性。     

基于PCR技术可视化鉴别金钱白花蛇方法的建立

目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtDNA Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。     

超高效液相色谱串联质谱法测定缬沙坦制剂中的2个亚硝胺类遗传毒性杂质

目的 建立超高效液相色谱串联质谱法,同时测定缬沙坦胶囊和分散片中N-亚硝基二甲胺(NDMA)和N-亚硝基二乙胺(NDEA)2个亚硝胺类遗传毒性杂质的残留量。方法 采用安捷伦Zorbax Eclipse Plus C₁₈色谱柱(3.0 mm×150 mm,1.8 μm),以0.1%甲酸水溶液为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱,流速为0.5 mL·min^-1。质谱采用大气压化学电离(APCI)离子源,多反应监测(MRM)正离子检测模式进行定量分析。结果 NDMA和NDEA线性范围、灵敏度、精密度、准确度、专属性均满足分析要求。经检验,102批缬沙坦胶囊和52批缬沙坦分散片中,NDMA和NDEA含量均不超过定量限浓度,均符合规定。结论 本方法操作简便、快速、准确、灵敏度高、专属性好,适用于缬沙坦胶囊和分散片中NDMA和NDEA的限度检查和定量检测。     

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??OBJECTIVE To develop a rapid DNA detection kit for DNA extraction and PCR identification of Panax ginseng C.A. Mey. METHODS The classical DNA extraction and PCR identification METHODS for Panax ginseng C.A. Mey were modified, and the compositions and reaction conditions of the kit were determined. In addition, the specificity, stability, sensitivity, and repeatability of the kit were evaluated. The genomic DNAs of genuine and counterfeit ginseng goods were extracted by the kit and PCR was performed to identify the authenticity. The purity of the extracted DNA was detected by UV spectrophotometry. Finally, commercially available ginseng samples were verified. RESULTS The purity of the genomic DNA extracted by the kit was (1.73??0.13)(OD₂₆₀/ OD₂₈₀), and a fragment between 150 and 200 bp could be amplified only from authentic Panax ginseng C.A. Mey. The specificity of the kit was 100%. The repetitive experiments showed that the average intra-assay CV% and inter-assay CV% of the kit were 2.38% and 2.62%, respectively. The DNA in solutions diluted by 200 times could still be detected. Stability experiment proved that repeated freeze-thawing for 20 times had no significant effect on the activity of this kit and the test sample could be stored at -20 ?? for one year. The specificity test confirmed that 8 samples among the 10 commercial products were genuine, and 2 were counterfeit. CONCLUSION The nucleic acid extraction and purity of the DNA detection kit can meet the requirement for identification of Panax ginseng C.A. Mey.The kit has good specificity, high sensitivity, and good stability, so it is suitable for the rapid detection of Panax ginseng C.A. Mey.     

以三七总皂苷壳聚糖纳米粒为例探讨超滤离心法在包封率评价中的可靠性

目的 以建立三七总皂苷壳聚糖纳米粒(PNS-NPs)包封率的测定方法为例,探讨可能导致包封率测定错误结果的原因及解决方法。方法 通过加入促透剂,破坏皂苷分子的聚集状态,进而使用超滤离心法分离PNS-NPs中包封药物与游离药物,以避免游离药物被超滤膜非特异性截留。本实验对促渗剂类型进行了选择,对超滤离心方法的回收率与重复性进行了方法学验证,并对多批次的PNS-NPs的包封率进行了测定。结果 该方法能有效实现壳聚糖纳米粒中包封药物与游离药物的分离,回收率,重复性满足测定要求。结论 所建立的分离方法可适用于易产生分子间缔合药物的纳米制剂包封率测定,避免误导性的实验结果。     

香棒虫草的生药学研究与数字化表征

目的 研究香棒虫草的生药学鉴别特征,并与冬虫夏草进行比较。方法 应用数码相机、体式显微镜与其数码成像系统对香棒虫草子座和虫体的外观性状特征进行观察和表征;通过冷冻切片和荧光染色,体式荧光显微镜与其数码成像系统、荧光显微镜工作站,对香棒虫草子座和虫体部位的横切面显微特征进行观察和表征;应用扫描电镜对表面及剖面的特征进行探究,并与冬虫夏草进行了生药学鉴别特征比较。结果 系统阐明了香棒虫草头部上颚、胸足、腹节环节、尾部刚毛及体壁针状毛等性状特征,子座部位不同菌丝层荧光显微特征及虫体部位中虫体组织和菌丝组织荧光显微特征差异。香棒虫草与冬虫夏草相比,在虫体形态、腹足有无、气孔形态、子座长出部位等性状特征,以及体壁被毛、刚毛、毛片等显微特征中存在明显差异。结论 通过对香棒虫草进行生药学研究,可为香棒虫草资源的开发与利用提供参考;通过与冬虫夏草的对比研究,可以避免混淆用药,为市场监管提供科学依据,也为虫草类药用品种数字化表征规范的建立奠定基础。     

杜仲叶清除DPPH自由基动力学特性及抗氧化活性成分筛选

目的 研究杜仲叶抗氧化清除1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基的动力学特性,筛选其抗氧化活性成分,建立与抗氧化活性相关的质量控制方法.方法 比较不同杜仲叶样品浓度、反应温度和反应时间对DPPH自由基清除率的影响,测定杜仲叶清除DPPH自由基活性的半数清除率(IC50).采用DPPH-HPLC法测定杜仲叶与DPP...     

不同基原柴胡配方颗粒的鉴别研究

目的 基于超高效液相色谱(UPLC)特征图谱,建立快速、有效鉴别南、北柴胡配方颗粒的方法。方法 采用色谱柱ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流动相为乙腈-水,流速0.4 mL·min^-1梯度洗脱,检测波长为211 nm,250 nm,柱温35 ℃,对南、北柴胡配方颗粒进行特征图谱测定,分析特征峰差异。结果 特征图谱方法精密度、稳定性良好,表明建立的方法合理、可行。其中北柴胡配方颗粒特征图谱有9个共有峰,南柴胡配方颗粒特征图谱有12个共有峰,南、北柴胡配方颗粒有7个共有峰,说明两者主要化学成分大体相同,个别成分存在一定差异。以特征峰差异可以对南、北柴胡配方颗粒进行区分,并进一步确定了南、北柴胡配方颗粒鉴别的直观区分点(β值)。结论 UPLC特征图谱可对南、北柴胡配方颗粒进行质量评价,且能快速、准确、直观地反映南、北柴胡配方颗粒的基原差异,为南、北柴胡配方颗粒合理的临床应用提供重要的数据支撑。     

1H定量核磁共振波谱法测定新型P2Y12受体抑制剂TSD-1中非氘TSD-1-ND的含量

目的 建立¹H定量核磁共振波谱(¹H quantitative nuclear magnetic resonance, ¹H qNMR)法测定TSD-1原料药中非氘TSD-1-ND的含量。方法 采用核磁共振波谱法,使用BRUKER AV-400型核磁共振仪,以氘代氯仿为溶剂,弛豫延迟时间为10 s,扫描次数32次。结果 以化学位移δ分别为3.75和3.03的TSD-1-ND和丁二酸酐的氢质子峰作为定量峰,其峰面积比与其质量比的线性回归方程为Y=3.493 1X-0.059 7,相关系数(r)为0.998 1,3批TSD-1-ND测得含量分别为0.169 7%、0.180 6%和0.167 7%。结论 该法操作简单,测定结果准确,可用于TSD-1中非氘TSD-1-ND的含量测定。     

基于PCR-核酸试纸条快速鉴定鹿茸及其伪品的实验研究

目的 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与核酸试纸条相结合的方法,实现鹿茸真伪的可视化检测。方法 采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)碱变性法提取正品及伪品鹿茸样品基因组DNA,通过查找细胞色素C氧化酶亚基I(COI)特异性位点,应用Primer 3.0软件设计鹿茸特异引物,摸索PCR最佳反应体系及条件,建立PCR-核酸试纸条及琼脂糖凝胶电泳鉴定鹿茸真伪的最优条件。同时,通过克隆测序,验证鹿茸真伪鉴定的准确性。结果 本实验中正品鹿茸在PCR-核酸试纸条上均出现两条带,阴性对照及伪品出现一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合,且试纸条检测的灵敏度可达1 ng·μL^-1。对9个市售鹿茸样品检测,正品鹿茸5个,合格率为45%。结论 自主构建的PCR-核酸试纸条检测方法简单、快速、特异性较好,可在较短时间内实现鹿茸真伪的可视化检测,检测结果稳定,为中药材鉴定提供又一新的方法。