大鼠雪旺细胞对脊髓源性神经干细胞生长及分化的影响

目的 观察雪旺细胞(SCs)在体外对脊髓来源的神经干细胞(NSCs)生长及分化的影响.方法 分别从胎鼠脊髓和出生24 h内的SD大鼠坐骨神经分离培养NSCs及SCs并鉴定.实验分成对照组:NSCs单独培养组;A组:脑源性神经营养因子(黼)与NSCs共培养组;B组:SCs与NSCs共培养组;C组:BDNF+SCs与NSC共培养组.观察NSCs的形态学变化,计数并测量细胞团的数量及直径.利用免疫细胞化学方法检测神经元样细胞的表达并计算其百分率及阳性细胞突起的平均长度.结果 来源于新生大鼠脊髓组织的NSCs能够表达NSCs的标志物神经巢蛋白(Nestin),NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞;72 h,A、B、C组细胞团的数量及细胞团的平均直径,均大于对照组(P＜0.05);传代培养3 d、7 d、14 d的NAP-2染色阳性神经元样细胞所占的百分率及阳性细胞突起平均长度均大于对照组(P＜0.05).结论 大鼠SCs在体外能够促进脊髓来源的NSCs生长并诱导其定向分化.     

嗅鞘细胞体外诱导神经干细胞分化的实验研究

目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)体外诱导神经干细胞(neuron stell cells,NSCs)分化的作用.方法:分别从3月龄SD大鼠的嗅球和新牛SD大鼠的海马中分离OECs及NSCs.进行体外分离、培养及免疫荧光鉴定.构建OECs与NSCs共培养体系,分为3组,纯化培养的OECs+NSCs组,末纯化培养的OECs+NSCs组,单纯NSCs组.共培养后4、8、12d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率.结果:经P75和S100双重免疫荧光鉴定所培养的细胞为OECs,经巢蛋白抗体(Nestin)免疫荧光鉴定所培养的细胞为NSCs.荧光显微镜观察可见被特异件烯醇化酶一异硫氰酸荧光素(NSE-FITC)荧光标记的神经元大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突.在各时时间点,共培养组中可见到多个神经元聚集生长,神经元数目明显多于单纯NSCs培养组,而共培养组之间无明显差别.共培养后12d,共培养组中NSCs分化为神经元的百分率大约为23%,而单纯NSCs培养组约为4%.在各时间点,共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异(P<0.001),而共培养组之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:OECs在体外能够有效诱导NSCs向神经元转化.     

成年大鼠压迫性脊髓损伤后损伤区神经干细胞的分离培养实验研究

目的 研究脊髓损伤后损伤反应性巢蛋白(nestin)和胶质酸性纤维蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)阳性共存(nestin+/GFAP+)细胞的分裂、增殖和分化能力,以探讨其是否具有神经干细胞(neural stem cells,NSCs)特性. 方法 8周龄雄性SD大鼠12只,体重200～250 g,随机分为正常对照组和模型组(n=6).模型组利用动脉瘤夹压迫法建立成年大鼠脊髓损伤动物模型,正常对照组不作任何处理.造模后5 d,两组分别取大鼠Ts脊髓节段,分离中央管周围室管膜区以外的脊髓灰质和白质,制成单细胞悬液,用无血清NSCs培养基进行培养,并用含血清NSCs培养基进行诱导分化,利用免疫荧光化学和流式细胞仪观察细胞类型及分裂、分化、增殖能力. 结果 模型组培养后3～7 d,单细胞悬液中有大量高度表达的nestin+/GFAP+共存细胞,细胞计数为5.15±0.71;对照组为1.12±0.38;两组比较差异有统计学意义(P<0.01).细胞周期结果 示,模型组S期细胞比例(15.49%±3.04%)及增殖指数(15.88%±2.56%)均明显高于对照组(5.84%±0.28%,6.47%±0.61%),两组比较差异有统计学意义(P<0.01).模型组原代细胞逐渐形成边缘光滑、中心膨隆有立体感的小克隆球,nestin免疫荧光染色呈强阳性,多次传代后获得大量细胞克隆球.对照组单细胞悬液原代及传代培养均未见明显克隆球生长.免疫染色结果 示模型组克隆球诱导分化约5 d,细胞球中含有大量半乳糖脑苷脂(galactocerebroside,GaLC)-nestin免疫染色阳性细胞;5～7 d,大量β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)-nestin和GFAP免疫染色阳性细胞;7～14 d出现GaLC阳性少突胶质细胞、β-tubulin Ⅲ神经元和GFAP染色阳性的胞体及细胞突起. 结论 成年大鼠压迫性脊髓损伤后,剔除中央管周围室管膜区脊髓白质与灰质分离而得的nestin+/GFAP+细胞,具有自我更新能力和多分化潜能,是中枢神经系统的NSCs.     

绿色荧光蛋白转基因神经干细胞脑出血大鼠脑内移植后血管生成与神经形态学的改变

目的 观察绿色荧光蛋白转基因神经干细胞(NSCs/GFP)脑出血大鼠脑内移植后血管生成与神经形态学改变.方法 分离、培养及纯化NSCs/GFP,并进行体外诱导分化.注射动脉血制作大鼠脑出血模型,3d后将NSCs/GFP注入血肿同侧尾状核,观察NSCs/GFP在脑内分化情况以及大鼠不同时间点行为学的变化.结果 成功分离、培养及鉴定NSCs/GFP,体外诱导分化为内皮细胞和平滑肌细胞；移植入脑出血大鼠脑内后,能促进其肢体功能恢复(P＜0.05),且能分化为神经元、星型胶质细胞、内皮细胞及平滑肌细胞.结论 NSCs/GFP移植入脑出血大鼠脑内能改善其运动功能,并有生成血管与神经的能力.     

嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的诱导分化作用研究

[目的]探讨大鼠嗅神经鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞的诱导分化作用。[方法]通过差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞，在接种培养后的9～12d，收集并制备嗅鞘细胞条件培养液，与纯化培养第3代的骨髓基质干细胞共培养，观察其诱导分化后的形态学变化，免疫荧光染色鉴定诱导分化结果。[结果]发现大鼠嗅鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞有明显的诱导分化作用，在72h时荧光显微镜下观察并计算MAP-2和GFAP阳性细胞的比率分别为55％、23％。[结论]大鼠嗅鞘细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠骨髓基质干细胞向神经样细胞分化的作用。     

诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为唾液腺腺泡样细胞的实验研究

目的:探讨在共培养系统下大鼠骨髓间充质干细胞分化为唾液腺腺泡样细胞的实验.方法:以纯化1代SD大鼠颌下腺腺泡细胞和3代骨髓间充质干细胞作为共培养实验对象.实验分组:含唾液腺培养液的共培养组;含10%FBS、DMEM/F12的共培养组;含唾液腺培养液的非共培养组;含10%FBS、DMEM/F12的非共培养组.培养1个月经α-淀粉酶(α-amylase)免疫组化染色各组的MSCs,计算阳性细胞数得出MSCs的转化率,并且通过光镜和电镜鉴定细胞形态变化.结果:各组诱导的MSCs经α-amylase染色,共培养组阳性细胞数较非共培养组多(P＜0.05),且诱导成功的细胞在镜下形态类似于唾液腺腺泡细胞.结论:在共培养条件下成功实现了MSCs向 SGCs的形态学转化,唾液腺专用培养液能够提高SGCs的诱导效率.     

真皮来源成体多能干细胞的分离鉴定和生物学性状的研究

目的:从新生大鼠和成人真皮组织分离鉴定多能干细胞,并研究其生物学性状。方法:以新生大鼠背部皮肤和成人包皮为研究对象,依据体外贴壁生长的性状,采用酶消化法分离真皮多能干细胞,通过定向诱导其多向分化实验进行鉴定。结果:早期贴壁筛选的新生大鼠和成人皮肤组织原代真皮细胞克隆经过传代培养后细胞形态均一,约90%的细胞处于 Go/G1期,细胞表面波形蛋白表达阳性,但Ⅷ因子和角蛋白表达阴性。经诱导分化后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,具有多能分化潜能。体外培养的多能干细胞具有异质性,含有体积大小不同的细胞亚群。绿色荧光蛋白 GFP 基因转染真皮多能干细胞可获得良好表达。结论:大鼠和人真皮组织中均存在成体多能干细胞,提示真皮可能是成体多能干细胞的又一来源。     

自组装peptide胶对神经干细胞在大鼠急性损伤脊髓中细胞分化的影响

目的 观察自组装peptide胶对神经干细胞(NSCs)在大鼠急性期损伤脊髓中的细胞分化的影响.方法 分离、培养和鉴定大鼠NSCs与自组装peptide胶共培养;SD大鼠25只采用NYU-Ⅱ型脊髓打击器制作T10脊髓损伤模型;急性期于损伤脊髓区分别行注射移植,其中联合细胞移植组(n=10)、单纯细胞移植组(n=10)及对照组(n=5).术后第2、4、8周取损伤部位脊髓,免疫组织化学染色检测移植细胞的分化.结果 成功建立大鼠NSCs的体外培养体系;移植的NSCs在大鼠脊髓内存活超过8周,单纯移植组、细胞分化比例较低,分化的NSCs主要为表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原细胞,未见NSCs分化为表达微管相关蛋白(MAP2)标志抗原细胞;联合移植组,细胞分化比例较高;NSCs可分化为表达MAP2、Oligo、GFAP标志抗原细胞.结论 自组装peptide胶能够提高神经干细胞在大鼠急性期损伤脊髓中的分化比率,并有部分细胞可分化为表达神经元特异抗原的细胞.     

成年脊髓损伤大鼠脊髓神经干细胞的体外培养及分化研究

目的 探讨大鼠脊髓损伤后脊髓神经干细胞的分离培养方法及分化情况.方法 采用Allen法制作大鼠脊髓损伤模型,利用无血清培养和单细胞克隆技术在成年脊髓损伤7 d大鼠脊髓中分离具有单细胞克隆能力的神经干细胞,并进行培养鉴定.结果 从成年脊髓损伤7 d大鼠脊髓中成功分离出神经干细胞,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原.分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原.结论 致伤7 d的成年大鼠脊髓组织体外町培养出神经十细胞,并分化为神经无细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞,有可能参与脊髓损伤的修复过程.     

骨碎补类黄酮对系膜增殖性肾小球肾炎大鼠模型的抑制作用

目的:探讨骨碎补类黄酮提取物(flavonoid fraction,FF)对单克隆抗体OX-7诱导的系膜增殖性肾小球肾炎大鼠模型(anti-Thy 1.1 GN)的作用.方法:利用单克隆抗体OX-7诱导的anti-Thy 1.1 GN动物模型,将大鼠随机分成正常对照组、模型组(Thy 1.1 GN)、Thy 1.1 GN FF组、FF组.检测尿蛋白,三色染色评估肾小球细胞外基质改变,免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)、ED-1及α-SMA在肾小球的表达,同时检测肾皮质超氧化物歧化酶(SOD)活性.结果:Thy 1.1 GN FF组尿蛋白量及三色染色面积均比Thy 1.1 GN组减少(分别P＜0.05和P＜0.01);免疫组化显示PCNA、ED-1阳性细胞数及α-SMA在肾小球表达下调,均与Thy 1.1 GN组有统计学差异(P＜0.01);FF还可加快anti-Thy 1.1 GN模型肾皮质SOD活性的恢复(P＜0.01).结论:FF通过抗氧化活性,抑制大鼠系膜增殖性肾小球肾炎系膜细胞的增殖及基质的增加.