线粒体Miro1蛋白对无镁致痫海马神经元氧化应激损伤的保护作用

目的探讨线粒体Miro1蛋白在体外颞叶癫痫模型中氧化应激方面的保护作用及其机制。方法原代培养新生24h内的SD大鼠海马神经元,通过无镁细胞外液诱导体外癫痫模型。培养至14d的海马神经元随机分为对照组(CON)、无镁诱导组(AE)、无镁诱导+rAd转染组(AE+rAdv)、无镁诱导+rAd-Miro1转染组(AE+rAd-Miro1),CON组及AE组分别用正常细胞外液和无镁细胞外液作用3h后,更换为正常维持液,腺病毒转染组于无镁诱导48h前转染腺病毒,各组分别于造模后24h终止细胞培养,采用Western blot法检测细胞内Miro1、ND6的表达,免疫荧光法检测细胞内ND6表达,比色法测定MDA、GSH的表达。结果与CON组比较,AE组Miro1表达升高,ND6表达降低,MDA表达升高,GSH表达降低,差异均具有统计学意义(P0.05);与AE组比较,AE+rAdv组Miro1表达升高,ND6表达降低,MDA表达升高,GSH表达降低,差异均无统计学意义(P0.05);与AE组比较,AE+rAd-Miro1组Miro1、ND6表达升高,MDA表达降低,GSH表达升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论线粒体蛋白Miro1对无镁致痫海马神经元有保护作用,其机制可能与降低线粒体氧化应激损伤,提高ND6、GSH蛋白表达,降低MDA蛋白表达有关。     

FAM134B介导的内质网自噬在无镁外液致痫海马神经元线粒体钙稳态及凋亡中的作用

目的 探讨FAM134B介导的内质网自噬在无镁外液致痫海马神经元线粒体钙稳态及凋亡中的作用.方法 原代培养新生24 h SD大鼠海马神经元,建立无镁外液诱导的体外癫痫模型,并通过慢病毒载体干预FAM134B表达.将培养10 d的海马神经元随机分为对照组(CON)、无镁诱导组(AE)、空载病毒组(NC)、FAM134B过...     

线粒体钙单向转运体在匹鲁卡品致痫大鼠海马神经损伤中的作用

目的研究线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)在氯化锂-匹鲁卡品(pilocarpine,PILO)癫痫大鼠模型神经损伤中的作用。方法将84只雄性SD大鼠随机分成空白对照(CON)组、PILO组(2 h、8 h、24 h和72 h 4个亚组)、Ru360组和精胺(Spermine)组。观察各组大鼠行为学改变,并荧光染色法测定海马组织线粒体Ca~(2+)浓度,TUNEL染色检测海马CA3区神经元凋亡,并采用Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C和caspase-3表达变化。结果 (1)与CON组比较,PILO组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显升高,凋亡明显增加(P0.05);与CON组比较,PILO组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P0.05)。(2)与PILO组比较,Ru360组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显降低,凋亡明显减少(P0.05);与PILO组比较,Ru360组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显减少,而Bcl-2表达水平明显增多(P0.05)。(3)与PILO组比较,Spermine组海马神经元线粒体Ca~(2+)浓度明显升高,凋亡明显增加(P0.05);与PILO组比较,Spermine组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少(P0.05)。结论 MCU在PILO癫痫大鼠海马神经损伤中发挥重要作用,抑制MCU可发挥对海马神经元凋亡的保护作用,其机制可能是通过抑制线粒体介导的细胞凋亡途径。     

FAM134B介导的自噬在无镁外液致痫海马神经元内质网应激及凋亡中的作用

目的 探讨FAM134B介导的自噬在无镁外液致痫海马神经元内质网应激及凋亡中的作用。方法原代培养新生24 h的SD大鼠海马神经元,通过无镁外液诱导体外癫痫模型。将海马神经元随机分为对照组(CON)、无镁诱导组(AE)、阴性对照组(Lenti-pGV)、过表达FAM134B组(Lenti-FAM134B)和低表达FAM134B组(Lenti-FAM134B-shRNA),并进一步采用选择性自噬抑制剂3-MA进行干预;采用LDH法检测细胞活力、TUNEL法检测细胞凋亡、Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、内质网应激相关蛋白GRP78及CHOP的表达。结果 与CON组相比,AE组LDH释放率明显升高,海马神经元活力下降,神经元凋亡明显增加,过表达FAM134B显著降低LDH释放率,增加海马神经元活力,减少AE诱导的神经元凋亡; AE组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增加,过表达FAM134B使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例进一步增加; AE组GRP78和CHOP的表达明显增加,过表达FAM134B显著减少AE诱导的GRP78和CHOP表达的增加,而低表达FAM134B均发挥相反作用。与过表达FAM134B组相比,3-MA消除过表达FAM134B对AE诱导的内质网应激及神经元活力的影响,显著增加GRP78和CHOP的表达,并增加LDH释放率。结论 FAM134B可能通过调控自噬途径对内质网应激和神经元凋亡发挥保护作用。     

重组人促红细胞生成素对大鼠癫痫持续状态X-连锁凋亡抑制蛋白的影响及作用机制的实验研究

目的观察重组人红细胞生成素(r Hu EPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的SD大鼠海马神经元的影响,应用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002,观察X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的变化情况,进一步探讨r Hu EPO作用的可能机制。方法采用PTZ点燃大鼠SE模型,将大鼠随机分为正常对照组(生理盐水,NS)、PTZ组(PTZ+NS)、r Hu EPO组(PTZ+r Hu EPO)、LY294002组(PTZ+LY294002+r Hu EPO)、二甲基亚砜(DMSO)对照组(PTZ+DMSO+r Hu EPO),检测大鼠行为学和脑电图(EEG)的改变及苏木精-伊红染色观察海马病理学的改变;免疫组织化学法观察磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达;反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马XIAPm RNA的表达,Western blot方法检测各组大鼠海马Akt、p-Akt、XIAP蛋白的表达。结果 PTZ点燃大鼠SE后下调了p-Akt、XIAP的表达;r Hu EPO可以增加p-Akt、XIAP的表达,发挥神经保护作用;加入PI3K抑制剂LY294002,海马p-Akt、XIAP蛋白、XIAPm RNA的表达较r Hu EPO组减少,减弱了r Hu EPO的保护作用。结论从正反两个方面佐证了PI3K/Akt信号通路是r Hu EPO发挥神经保护作用的通路之一,其作用机制可能是r Hu EPO活化PI3K/Akt通路后,对线粒体凋亡途径的相关调控因子XIAP的表达进行了调控,进而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。     

重组人促红细胞生成素对戊四氮致痫大鼠海马Bax表达的影响

目的观察重组人红细胞生成素(r Hu EPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的SD大鼠海马神经元的影响,应用磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002,观察Bax的变化情况,探讨r Hu EPO为临床处理SE提供实验依据。方法采用PTZ点燃大鼠SE模型,将大鼠随机分为正常对照组(NS)、PTZ组(PTZ+NS)、r Hu EPO组(PTZ+r Hu EPO)、LY294002组(PTZ+LY294002+r Hu EPO)、二甲基亚砜(DMSO)对照组(PTZ+DMSO+r Hu EPO),检测各组大鼠行为学和脑电图的改变;TUNEL法检测海马神经细胞的凋亡情况;免疫组织化学法观察磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、Bax的表达;反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马Baxm RNA的表达,Western blot方法检测各组大鼠海马Akt、p-Akt、Bax蛋白的表达。结果 r Hu EPO可以增加p-Akt蛋白的表达、下调Bax蛋白的表达,发挥神经保护作用;加入PI3K抑制剂LY294002,p-Akt的表达较r Hu EPO组减少,海马Bax蛋白、Baxm RNA的表达较r Hu EPO组增加,减弱了r Hu EPO的保护作用(P0.05),差异具有统计学意义。结论 r Hu EPO的抗凋亡从应用PI3K/Akt激活剂和抑制剂两个方面证实作用可能是通过了PI3K/Akt信号通路,通过对线粒体凋亡途径的相关调控因子Bax的表达进行调控,发挥神经保护作用。     

Caspase-9在戊四氮所致癫痫持续状态大鼠神经元中的表达及重组人红细胞生成素的影响

目的观察重组人红细胞生成素(r Hu EPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的SD大鼠海马神经元的影响,应用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002,观察门冬氨酸特异半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的变化情况,为r Hu EPO在癫痫诊疗中提供实验室依据。方法采用PTZ点燃大鼠SE模型,将大鼠随机分为正常对照组(生理盐水,NS)、PTZ组(PTZ+NS)、r Hu EPO组(PTZ+r Hu EPO)、LY294002组(PTZ+LY294002+r Hu EPO)、二甲基亚砜(DMSO)对照组(PTZ+DMSO+r Hu EPO),检测各组大鼠行为学和脑电图(EEG)的改变;TUNEL法检测海马神经细胞的凋亡情况;免疫组织化学法观察磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、Caspase-9的表达;反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马Caspase-9m RNA的表达,Western blot方法检测各组大鼠海马Akt、p-Akt、Caspase-9蛋白的表达。结果r Hu EPO可以下调Caspase-9的表达,发挥神经保护作用;加入PI3K抑制剂LY294002,海马Caspase-9蛋白、Caspase-9m RNA的表达较r Hu EPO组增加,减弱了r Hu EPO的保护作用(P0.05)。结论 r Hu EPO在癫痫持续状态所致损伤中具有神经保护作用,应用PI3K/Akt抑制剂进一步佐证了该作用可能是通过了PI3K/Akt信号通路,通过对线粒体凋亡途径的相关调控因子Caspase-9的表达进行调控,发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。     

脐血间充质干细胞外泌体对APP/PS1小鼠海马神经元的保护作用及其机制

目的 研究脐血间充质干细胞外泌体(MSC-EXO)对阿尔茨海默病(AD)小鼠海马神经元的保护作用及其机制。方法 将20只APP/PS1小鼠随机分为AD+saline组和AD+EXO组,每组10只;将10只野生型C57小鼠作为正常对照组。AD+EXO组小鼠经尾静脉注射EXO悬液,AD+saline组和对照组小鼠注射等体积的生理盐水。30 d后取脑,用免疫组织化学染色检测脑内Aβ负荷,尼氏染色检测神经元的数量及尼氏小体,透射电子显微镜观察海马神经元的超微结构,Western blot检测海马Nrf2、Keap1及HO-1的表达量。结果 与对照组相比,AD+saline小鼠脑内有大量Aβ沉积,Aβ阳性面积明显增多,海马DG区神经元数量减少(P 0. 01);并且海马神经元的线粒体出现明显肿胀、空泡化等损伤表现。与AD+saline相比,AD+EXO小鼠皮层与海马组织的Aβ负荷降低,海马DG区的神经元数量显著增多(P 0. 05),线粒体水肿、空泡化减轻。与对照组相比,AD+saline组小鼠海马Nrf2、HO-1蛋白的表达量升高,Keap1蛋白的表达量降低(均P 0. 05);而AD+EXO组与AD+saline组相比,Nrf2和HO-1蛋白的表达量降低,Keap1蛋白的表达量升高(均P 0. 05)。结论MSC-EXO可能通过调节Nrf2/Keap1通路,而发挥对APP/PS1小鼠海马神经元的保护作用。     

Omi/HtrA2在无镁外液致痫海马神经元凋亡中的作用机制及其特异性抑制剂UCF-101的神经元保护作用

目的观察线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/Htra2在体外颞叶癫痫模型中神经元凋亡方面发挥的作用及其机制,以及其特异性抑制剂UCF-101对痫性损伤神经元的保护作用。方法原代培养新生24 h内的SD大鼠海马神经元至10 d,随机分成对照组、无镁细胞外液处理后3 h组、8 h组以及24 h组,观察细胞形态学特征,采用免疫蛋白印迹法观察海马神经元中Omi/Htra2蛋白的表达变化;再随机将神经元分为对照组、无镁细胞外液处理后24 h组、UCF-101处理组以及DMSO组,采用TUNEL法检测各组神经元凋亡,免疫蛋白印迹法观察神经元XIAP、caspase3、HAX-1蛋白的表达变化。结果随着无镁外液作用时间的延长,Omi/Htra2在线粒体中的含量逐渐减少,胞浆中含量逐渐增多。与正常对照组相比,致痫24 h后神经元凋亡数目以及caspase3蛋白表达显著增多(P<0.05),且HAX-1蛋白表达下降(P<0.05),而XIAP蛋白的表达正常对照组与模型组相比无统计学差异。与致痫24 h组相比,UCF-101处理组神经元凋亡细胞数和caspase3的表达均明显减少(P<0.05),XIAP及HAX-1蛋白表达增多(P<0.05),DMSO组神经元凋亡细胞数、上述蛋白表达方面与致痫24 h组无明显差异(P>0.05)。结论神经元遭到无镁细胞外液作用后,Omi/Htra2从线粒体移位到了胞浆,其特异性抑制剂UCF-101能有效抑制神经元凋亡,下调神经元caspase3蛋白的表达,上调XIAP、HAX-1蛋白的表达,发挥神经元保护作用。     

阿托伐他汀对Aβ1-40诱导AD模型的氧化应激及凋亡的影响

目的观察阿托伐他汀对Aβ1-40诱导AD大鼠模型的氧化应激和凋亡的影响。方法雄性SD大鼠40只,体质量250～300g,随机分为空白对照组、假手术组、Aβ组、Aβ+生理盐水组、Aβ+阿托伐他汀组,每组8只。后3组在大鼠双侧海马CA1区立体定向注射Aβ造AD模型,假手术组注射生理盐水,正常对照组不做任何处理。Aβ+阿托伐他汀组在造模1周前开始给予阿托伐他汀20mg/(kg.d)灌胃,Aβ+生理盐水组给予等量生理盐水灌胃。造模4周后,测定大鼠脑皮质、海马组织MDA、SOD及GSH活性的变化;蛋白印迹技术检测大鼠海马区Bcl-2及Caspase-3的表达。结果与空白对照组相比,Aβ组大鼠脑皮质、海马组织内MDA活性明显升高(P<0.05),SOD、GSH活性明显降低(P<0.05),Caspase-3的表达升高(P<0.05),Bcl-2的表达降低(P<0.05),与Aβ组相比,Aβ+阿托伐他汀组大鼠的大脑皮质、海马组织内MDA明显减低(P<0.05),SOD、GSH活性明显升高(P<0.05),Caspase-3的表达下降(P<0.05),Bcl-2的表达升高(P<0.05)。结论阿托伐他汀对Aβ1-40诱导AD大鼠模型有一定的脑保护作用,其机制与抑制氧化应激及抗凋亡有关。     

雌激素对大鼠海马神经元免疫亲和素表达的影响

目的 研究雌激素和雌激素受体抑制剂对大鼠海马神经元中免疫亲和素FKBP12表达的影响.方法 原代培养的大鼠海马神经元分为对照组(C)、雌激素组(E)、雌激素+雌激素受体抑制剂ICI 182,780组(E+I)、单独ICI 182,780组(I).雌激素和ICI 182,780终浓度为10-8 mol/L.药物作用48 h后用Western blot方法检测FKBP12蛋白,实时荧光定量PCR检测FKBP12 mRNA.结果 神经元中FKBP12蛋白有稳定表达,雌激素作用后FKBP12的表达明显升高,ICI 182,780能阻断雌激素的作用;FKBP12 mRNA的表达与蛋白表达的变化相平行.结论 雌激素可以上调大鼠海马神经元中免疫亲和素FKBP12的表达,这种作用通过雌激素受体来实现.     

地黄多糖调控环状RNA0010729/miR-326通路对海马神经元缺氧复氧损伤的影响

目的 探讨地黄多糖对海马神经元缺氧复氧损伤的影响及其保护机制是否与调控环状RNA 0010729(circ_0010729)和微小RNA-326(microRNA-326,miR-326)表达有关。方法 体外培养大鼠海马神经元建立缺氧复氧损伤模型; 将大鼠海马神经元分为对照组、模型组、模型+地黄多糖低剂量组、模型+地黄多糖中剂量组、模型+地黄多糖高剂量组、模型+小干扰RNA阴性对照(Small interfering RNA negative control,si-NC)组、模型+si-circ_0010729组、模型+地黄多糖高剂量+空载质粒(Empty plasmid,pcDNA)组、模型+地黄多糖高剂量+pcDNA-circ_0010729组; 流式细胞术检测细胞凋亡; 试剂盒检测丙二醛(Malonaldehyde,MDA)水平和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性; 实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测circ_0010729,miR-326表达水平; 荧光素酶报告实验确定circ_0010729和miR-326靶向关系。结果 与对照组比较,模型组细胞凋亡率、MDA水平、circ_0010729表达水平升高(P<0.05),SOD活性、miR-326表达水平降低(P<0.05); 与模型组比较,模型+地黄多糖低剂量组、模型+地黄多糖中剂量组、模型+地黄多糖高剂量组细胞凋亡率、MDA水平、circ_0010729表达水平降低(P<0.05),SOD活性、miR-326表达水平升高(P<0.05); 与模型+si-NC组比较,模型+si-circ_0010729组细胞凋亡率、MDA水平降低(P<0.05),SOD活性升高(P<0.05); 与模型+地黄多糖高剂量+pcDNA组比较,模型+地黄多糖高剂量+pcDNA-circ_0010729组细胞凋亡率、MDA水平升高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05)。结论 地黄多糖能够有效抑制缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元凋亡和氧化损伤,其机制可能与抑制circ_0010729/miR-326通路有关。     

β-羟基丁酸对糖氧剥夺原代神经元的保护作用及其机制研究

目的探讨β-羟基丁酸(BHB)对SD大鼠神经元细胞缺氧损伤的保护作用及其机制。方法原代培养SD大鼠神经元细胞,不同浓度(2 m M、5 m M、10 m M、20 m M和50 m M)BHB预处理24 h,三气培养箱糖氧剥夺培养2 h,线粒体超氧化物探针检测细胞线粒体氧化应激状态,CCK8检测细胞活力变化,QPCR测Na+偶联单羧酸转运体1(SMCT1)、caspae3和Cytochrome C的m RNA表达,Western Blot测SMCT1、caspase3、细胞色素C(Cytochrome C)、ERK1/2和p-ERK1/2(T202/204)蛋白表达。结果 2 m M、5 m M和10 m M浓度BHB对神经元细胞活力无显著影响(P0.05),20 m M和50m M浓度BHB可致神经元活力显著降低(P0.05)。神经元缺氧培养后,活力降低(P0.05),线粒体氧化应激反应增强(P0.05),SMCT1的m RNA水平和蛋白水平显著降低(P0.05),caspase3与Cytochrome C的m RNA水平和蛋白水平明显增强(P0.05),ERK1/2的蛋白磷酸化水平降低(P0.05)。BHB预处理缺氧神经元,低浓度对细胞无明显影响(P0.05);浓度增至10 m M,相比单纯缺氧组,神经元活力显著改善(P0.05),线粒体氧化应激状态降低(P0.05),SMCT1的m RNA水平和蛋白水平显著增加(P0.05),caspase3与Cytochrome C的m RNA水平和蛋白水平明显降低(P0.05),ERK1/2的蛋白磷酸化水平升高(P0.05)。结论高浓度(20 m M)BHB对神经元细胞有毒性作用;低浓度(5 m M)BHB对糖氧剥夺的神经元细胞无明显作用;10 m M浓度的BHB预处理可增加SMCT1转运体的表达,通过启动ERK1/2信号通路,降低神经元线粒体的氧化应激,减少凋亡,从而对糖氧剥夺的原代神经元细胞发挥保护作用。     

促红细胞生成素对β淀粉样蛋白诱导大鼠海马CA_1区锥体细胞线粒体细胞色素C释放的影响

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对β淀粉样蛋白诱导大鼠海马CA1区神经元凋亡的影响及可能机制。方法采用大鼠海马内注射β淀粉样蛋白(Aβ)制作阿尔茨海默病(AD)模型。将SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组及EPO处理组。Aβ大鼠海马内注射造模,然后在生理盐水组大鼠行脑室立体定向注射生理盐水,EPO处理组则行脑室立体定向注射重组人促红细胞生成素(rHu-EPO)。观察术后24小时海马CA1区神经元细胞色素C(Cyt C)的变化,以及术后7天海马CA1区细胞凋亡变化。结果 EPO处理组大鼠海马CA1区神经元Cyt C的表达明显高于生理盐水组(P<0.01),EPO处理组大鼠海马CA1区凋亡细胞较生理盐水组减少(P<0.01)。结论 EPO可以通过抑制Aβ1-40诱导海马CA1区锥体细胞线粒体Cyt C释放来抑制神经元凋亡。     

甲硫氨酸维B_1对创伤性癫痫大鼠的治疗机制研究

目的探讨甲硫氨酸维B_1(MVB_1)对创伤性癫痫(PTE)的治疗机制。方法将15只雄性SD大鼠随机分为假手术组、癫痫组和癫痫MVB1治疗组,Morris水迷宫方法观察各组大鼠学习和记忆行为变化,检测各组大鼠血清和海马组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和还原性谷胱甘肽(GSH)浓度变化。结果癫痫组大鼠5d的逃避潜伏期显著延长,站台穿越次数显著降低,目标象限时间显著缩短,血清及海马组织SOD和GSH水平显著降低,MDA水平显著增加。癫痫大鼠MVB1处理后,5d的逃避潜伏期均显著缩短,站台穿越次数显著增加,目标象限时间显著延长,血清及海马组织SOD和GSH水平显著增加,MDA水平显著降低。结论 MVB1可改善PTE大鼠的学习记忆功能,可通过提高SOD和GSH浓度,降低MDA浓度来抑制脂质过氧化和减轻自由基损伤,为MVB1临床治疗癫痫提供了新的理论依据。     

基于PI3K/Akt通路研究右美托咪定对癫痫持续状态大鼠海马神经元自噬的调节作用

目的 探讨右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)对癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)大鼠海马神经元自噬的调节作用及对磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法 采用戊四氮(PTZ)点燃制备SE大鼠模型,随机分为模型组(M组)、Dex低剂量(Dex-L)组、Dex高剂量(Dex-H)组、Dex-H +LY294002(Dex-H+LY)组,另取正常SD大鼠为对照组(NC组),每组各15只; Dex-L组、Dex-H组分别腹腔注射Dex 25、100 μg/kg; Dex-H+LY组脑室注射5 μL PI3K抑制剂LY294002+腹腔注射Dex 100 μg/kg,NC组、M组大鼠腹腔注射等量生理盐水; 观察大鼠行为学表现并进行脑电图描记; 原位末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠海马神经元凋亡情况; 免疫印迹(WB)检测各组大鼠海马组织中LC3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平。结果 NC组大鼠脑电图无异常放电现象,主要以α、β波为主; M组大鼠出现大量阵发性棘波、高幅尖波、棘慢复合波、尖慢复合波等; Dex-L组、Dex-M组大鼠癫痫发作减少或波幅降低; Dex-H+LY组大鼠癫痫样放电较Dex-H组明显增加。与NC组比较,M组大鼠海马神经元凋亡细胞数、海马LC3-Ⅱ蛋白表达显著增加,海马LC3-Ⅰ,p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与M组比较,Dex-L组、Dex-H组大鼠海马神经元凋亡细胞数、海马LC3-Ⅱ蛋白表达依次减少(P<0.05),海马LC3-Ⅰ,p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt蛋白表达水平依次增高(P<0.05); 与Dex-H组比较,Dex-H+LY组大鼠海马神经元凋亡细胞数、海马LC3-Ⅱ蛋白表达显著增加,海马LC3-Ⅰ,p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论 Dex可能通过促进PI3K/Akt信号通路激活来抑制SE大鼠海马神经元过度自噬,减轻神经元凋亡,发挥抗惊厥及脑保护作用。     

褪黑素对癫痫状态大鼠海马Caspase-3 mRNA表达和脂质过氧化的影响

目的 探讨褪黑素（melatonin,Mel）神经元保护作用的机制.方法 采用匹罗卡品（pilocarpine,PILO）诱导大鼠癫痫持续状态（status epilepticus,SE）模型,用比色法检测海马丙二醛（malondialdehyde,MDA）、还原型谷光甘肽（glutathione,GSH）水平和谷光甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）的活力,用RT-PCR技术检测海马caspase-3 mRNA的表达.结果 PILO组大鼠SE后6h～72h,海马MDA含量明显高于对照组（P＜0.01）;海马GSH含量和GR活力均明显低于对照组（P＜0.01）,SE后7d,海马MDA含量和GR活力基本恢复正常.PILO＋Mel组大鼠,在SE后各时相点海马MDA含量均明显低于PILO组大鼠（P＜0.01）;而海马GSH含量和GR活力均显著高于PILO组大鼠（P＜0.05）.SE后6h～72h,PILO组大鼠海马caspase-3 mRNA的表达明显高于对照组（P＜0.01）和PILO＋Mel组（P＜0.01）,提示给予Mel可明显抑制SE大鼠海马caspase-3 mRNA的表达.结论 Mel发挥神经元保护作用的机制是通过提高SE大鼠海马GSH水平和GR活力,来减轻脂质过氧化损伤;并通过抑制caspase-3 mRNA的表达,来干预细胞凋亡.     

右美托咪定调节MAPK/ERK-CREB通路对大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的探讨右美托咪定(DEX)调节MAPK/ERK-CREB通路对大鼠海马神经元凋亡的保护作用。方法通过腹腔注射氯化锂-毛果芸香碱构建癫痫持续状态(SE)大鼠模型,并随机分为4组,每组各10只。SE+DEX组在SE模型构建成功后腹腔注射DEX 1μmol/L,阳性对照组腹腔注射1μmol/L苯巴比妥,药物干预24 h后,通过Nissl法和TUNEL法检测大鼠海马神经元损伤及凋亡情况,Western blot法检测大鼠海马组织中MAPK、p ERK、p CREB蛋白和凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax表达。结果与正常对照组相比,SE、阳性对照组、SE+DEX组大鼠Racine分值显著增加(P 0. 05),大鼠海马神经元数、Bcl-2蛋白表达量显著减少(P 0. 05),棕褐色TUNEL阳性细胞数、MAPK、p-ERK、p-CREB、caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达量显著增加(P 0. 05)。与SE组相比,阳性对照组、SE+DEX组大鼠Racine分值显著降低(P 0. 05),大鼠海马神经元数、Bcl-2蛋白表达量显著增加(P 0. 05),棕褐色TUNEL阳性细胞、MAPK、p-ERK、p-CREB、caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表达量显著减少(P 0. 05)。结论 DEX可能通过抑制MAPK/ERK-CREB通路抑制海马神经元凋亡对其有保护作用。     

MLK3介导的腺病毒表达谷氨酸受体羧基肽段对大鼠缺血性脑损伤的保护作用

目的 探讨大鼠脑缺血再灌注后腺病毒表达谷氨酸受体羧基肽段对海马CA_1区神经元的保护和MLK3表达的影响.方法 将SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注对照组、表达病毒处理组、非表达病毒处理组及溶剂组.采用焦油紫染色、免疫印迹检测大鼠缺血再灌注后海马神经元损伤和脑组织MLK3表达的情况.结果 表达病毒处理组与缺血再灌注对照组、空载病毒处理组及溶剂组相比,海马CA_1区神经元损伤明显减轻,脑组织MLK3表达明显降低(P<0.05).结论 腺病毒表达谷氨酸受体羧基肽段可能通过降低脑组织中MLK3的表达对海马CA_1区神经元起保护作用.     

miR-146a通过靶向TRIB3调节癫痫大鼠海马神经元凋亡及炎症反应

目的探讨miR-146a靶向调控Tribble同源蛋白3(TRIB3)对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影响,以及对炎症反应的调控作用。方法体外培养新生Sprague-Dawley(SD)大鼠的海马神经元,制备癫痫海马神经元模型,采用免疫荧光双染法和膜片钳技术检测癫痫海马神经元模型。将海马神经元随机分为四组:空白对照组(control组):正常海马神经元;癫痫组(EP组):癫痫海马神经元;阴性对照组(miR-146a NC组):转染100 nM miR-146a NC至癫痫海马神经元;miR-146a mimic组:转染100 nM miR-146a mimic至癫痫海马神经元,采用脂质体介导法进行转染;流式细胞术检测各组海马神经元细胞的凋亡情况;Western blot检测各组海马神经元中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)以及肿瘤抑制基因p53的蛋白表达;ELISA法检测各组海马神经元细胞培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6 (IL-6)含量;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平;双荧光素酶报告基因实验确定miR-146a与TRIB3的靶向作用情况。结果癫痫组大鼠海马神经元与正常组大鼠海马神经元相比较形态未见明显异常;癫痫大鼠海马神经元自发性放电频率明显较正常大鼠海马神经元明显增加(P0.05);与空白对照组比较,癫痫组miR-146a表达水平升高,海马神经元凋亡数目显著增加,海马神经元中caspase-3、Bax及p53的蛋白表达显著增加,Bcl-2蛋白表达减少,TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平与细胞培养液中的含量均升高,差异均有统计学意义(P 0.01)。与癫痫组比较,miR-146a mimic组海马神经元凋亡数目下降,caspase-3、Bax及p53的蛋白表达显著减少,Bcl-2蛋白表达增加,TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平与含量均下降,差异均有统计学意义(P 0.01)。TRIB3与miR-146a存在靶向关系,在野生型TRIB3-WT中,miR-146a mimic组荧光素酶活性较miR-146a NC组显著降低(P0.01)。结论高表达miR-146a通过靶向调节TRIB3 mRNA表达来抑制海马神经元凋亡的发生,并减少TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的释放。