人外周血单核细胞体外诱导成熟和激活的树突状细胞

目的　建立从人外周血单核细胞体外诱导培养成熟和激活的树突状细胞 (dendritic cell,DC)的方法。方法　从健康成人外周血分离单核细胞 (PBM) ,加入粒单系集落刺激因子 (GM-CSF) 10 0 μg/L+重组白细胞介素 -4 (rh IL -4 ) 5 0 0 k U /L体外培养 14 d,并于培养结束前 1d加入或不加入肿瘤坏死因子α (TNF -α ) (10 0μg/L ) ,流式细胞仪测定树突状细胞 (DC)的主要组织相容性复合体 (MHC) - 类分子、粘附分子和协同刺激分子 ,分析其成熟度和激活度。结果　 PBM经 GM-CSF+ rh IL-4诱导培养 14 d后 ,细胞成簇 ,表型为 CD83 2 2 .6%、CD865 5 .5 %、CD11c 3 6.1%、CD64 3 .2 %、人类白细胞抗原 (HLA) -DR 13 .4% ;培养结束前 1d加入 TNF -α诱导后 ,细胞表型为 CD83 81.5 %、CD8699.3 %、CD11c 98.8%、CD64 3 .4%、HLA-DR 88.3 %。结论　 GM-CSF +rh IL-4诱导 PB-M14 d,可获得大量不成熟的 DC,该体系有利于 DC扩增 ;培养结束前 1d加入 TNF-α,DC成熟度高 ,激活性好 ,适合于肿瘤免疫治疗     

ErbB-2转基因小鼠乳腺癌干细胞的分离培养

目的:分离、培养ErbB-2转基因小鼠乳腺癌干细胞(BRCSCS),探讨其生物学特性及培养传代条件,为药敏试验及动物实验进行基础性研究。方法:从ErbB-2转基因小鼠乳腺癌组织中获取乳腺癌细胞(BRCCS),然后以FITC标记的CD24、CD44抗体标记细胞,通过流式细胞仪检测并分选CD44+CD24-/low细胞。结果:Erb-B2转基因小鼠乳腺癌组织中CD44+CD24-/low细胞约占细胞总数的2.6%(2.3%～2.9%)。结论:小鼠乳腺癌组织中存在CD44+CD24-/low且具有干细胞特性的BRCCS,利用流式细胞仪可成功地将其从小鼠乳腺癌组织中分离出来。     

小鼠髓源性树突状细胞分离培养及鉴定

目的 建立小鼠髓源性树突状细胞分离培养及鉴定方法。方法 取小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，使用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，rmGM-CSF）20 ng·mL^-1联合白细胞介素-4（interleukin 4，IL-4）10 ng·mL^-1诱导小鼠骨髓前体细胞分化为树突状细胞（dendritic cell）。体外培养10 d，使用流式细胞术鉴定细胞表面树突细胞特异性标志物CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40及CCR7的表达。进一步使用OVA_257-264多肽处理细胞48小时，流式细胞术分析该多肽与MHC I形成的复合物的表达，验证该细胞的抗原提呈功能。结果 依据本文方法，培养第10天每只小鼠可获得1.5Í107~2Í107个细胞。其中，38.4%细胞表达CD11c，CD11c阳性的细胞中有15.2%细胞表达MHCⅡ、32.3%细胞表达CD80、7.22%细胞表达CD86，但CD11c阳性的细胞中CD40阳性细胞仅4.15%，CCR7阳性细胞仅1.83%。LPS刺激24 h后，58.1%细胞表达CD11c，CD11c阳性的细胞中有39.8%细胞表达MHCⅡ、38.6%细胞表达CD80、43.1%细胞表达CD86，30.2%细胞表达CD40，10.2%细胞表达CCR7。使用该方法培养的树突细胞具有较强的抗原提呈能力。结论 本试验成功建立体外培养树突细胞的方法，可为基于树突细胞的基础研究和转化应用提供实验基础。     

鼠抗人CD3噬菌体基因工程单链抗体的初步制备

本研究应用PCR方法，从小鼠杂交瘤细胞中扩增鼠抗人CD3抗体重、轻链可变区基因，经DNA接头连接后与噬菌粒pCANTAB5重组；转化大肠杆菌形成抗体可变区基因文库。通过文库的“抢救”、亲和筛选、再转染、克隆化及鉴定，得到高亲和力鼠抗人CD3噬菌体基因工程单链抗体。     

内吗啡肽在小鼠树突状细胞的诱导表达

目的研究内吗啡肽-1和内吗啡肽-2在小鼠树突状细胞的表达。方法从7～8周龄的C57BL/6J小鼠骨髓提取骨髓前体细胞培养,经CD11c(树突状细胞的特异性标记)免疫磁珠分选,获得纯化的树突状细胞。流式细胞仪分析表明,CD11c阳性细胞纯度达95%以上。免疫荧光染色研究内吗啡肽-1和内吗啡肽-2在树突状细胞的表达;酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)的方法,检测培养树突状细胞上清液中的内吗啡肽-1和内吗啡肽-2的含量。结果免疫荧光染色表明,活化的树突状细胞内可分泌内吗啡肽-1和内吗啡肽-2;酶免疫测定检测结果表明,不同的Toll样受体(toll like receptor,TLR)配体活化树突状细胞促使分泌不同浓度的内吗啡肽-1和内吗啡肽-2。结论活化的树突状细胞可诱导内吗啡肽的表达。     

噬菌体展示筛选人源细胞黏附分子L1结构域抗体及其体外实验研究

目的使用噬菌体展示技术筛选人源细胞黏附分子L1结构域抗体并体外观察其对神经来源细胞信号通路及细胞聚集的影响。方法以L1纤黏连蛋白FN2-3区肽段为抗原,利用噬菌体抗体库(DAb library)筛选并纯化相应人源结构域抗体,并通过酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫荧光观察抗体与抗原结合特性。给予神经来源SK-N-SH细胞抗体,使用蛋白质印迹(Western blot)观察24 h时其对L1下游信号通路Erk及Akt1激活的影响。使用结晶紫进行细胞染色观察抗体对细胞聚集的影响。结果成功筛选出与L1FN2-3区肽段结合的结构域抗体H2-1,与SK-N-SH细胞内源性L1结合良好。与溶剂对照组相比,该抗体可有效促进SK-NSH细胞中L1下游信号分子Erk1/2及Akt1磷酸化激活(分别为P<0.01和P<0.05),并可促进神经突生长及神经细胞聚集。结论 L1激动型结构域抗体可激活L1相关信号分子,促进神经突生长等作用,具有进一步实验治疗脊髓损伤等神经系统创伤性疾病的研究价值。     

人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化

目的制备人绒促性素(hCG)单克隆抗体。方法hCG抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1融合,间接ELISA法筛选阳性孔,有限稀释法进行克隆化培养;制备腹水抗体;间接ELISA法测定抗体效价;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体。结果得到2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-3以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单抗纯度达98%以上,回收率达75%。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,可用于早孕、肿瘤等诊断的研究。     

IL-2基因修饰对树突状细胞表面粘附分子的影响

为研究白细胞介素 2 (IL -2 )基因修饰后对树突状细胞 (DC)表面粘附分子的变化 ,分析白细胞介素 -2对树突状细胞的活化作用。制备小鼠骨髓树突状细胞 ,用重组腺病毒介导白细胞介素 -2基因修饰 ,通过流式细胞仪分析树突状细胞表型特征。结果 ,树突状细胞经IL -2基因修饰后 ,能分泌高水平的白细胞介素 -2〔3.2 5ng·(1× 1 0 6)·m1 - 1·2 4h- 1〕 ,其表面MHC -Ⅱ、B7-1、B7-2和CD4 0表达明显上调。提示IL -2基因修饰树突状细胞 ,能促进树突状细胞的成熟 ,上调树突状细胞表面与抗原提呈相关的免疫粘附分子的表达     

靶向肺树突状细胞的哮喘治疗

已知肺树突状细胞(DC)通过激活Ⅱ型辅助性T淋巴细胞(Th2细胞)应答而在过敏性哮喘的发病过程中起着决定性作用。因此,干预其功能发挥的策略可能成为治疗哮喘的新途径。Lambrecht等的研究发现,小鼠局部给予免疫调节剂FTY720后,可以通过改变肺树突状细胞功能抑制实验诱导的哮喘发生。FTY720是1-磷酸-鞘氨醇受体激动剂,作为一种免疫抑制剂它被认为通过将淋巴细胞保留在淋巴器官中,阻止这些细胞流入炎症部位而发挥作用。然而,应用该抑制剂治疗后会导致外周淋巴细胞减少症的发生。因此,研究探讨了局部给予FTY720对哮喘模型小鼠的治疗效果。…     

抗体治疗致死性癌症的新突破

美国明尼苏达州的科研人员研究出了一种在自然界中原本不存在的抗肿瘤免疫反应 ,这种免疫反应可以用于治疗恶性黑素瘤一种致死性很强的皮肤癌。将sHIgM12抗体引入小鼠体内 ,这种抗体可在树突状细胞和T细胞表面形成交联结构 ,树突状细胞是启动这种免疫反应的关键点。这种交联可以激活T细胞 ,引起免疫应答。在外环境正常时 ,恶性黑素瘤不会影响树突细胞 ,也就是说这种癌免疫原性很低。研究人员采用三组小鼠 ,一组给予sHIgM12抗体 ,另外两组给予已知不会形成交联结构的抗体作对照 ,来检测这种抗体的效果。然后在所有小鼠体内都植入恶性黑素…     

人血红蛋白单抗的鉴定和免疫学特性分析

本实验采用8～12周龄BALB/C系的纯种小鼠,通过一系列的免疫反应来激活其免疫系统,取冲击后2～3d的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。通过检测培养上清效价来筛选阳性克隆子并克隆化,共获得8株有效细胞株,对其进行特异性鉴定得Hb-2、Hb-3和Hb-4特异性抗人血红蛋白,其他5株有交叉反应;亚类测定结果显示Hb-2为IgG2a、Hb-3和Hb-4均为IgG1;动物保护实验显示该3株细胞的中和活性较好;夹心ELISA测定抗原表位显示Hb-2和Hb-3、Hb-2和Hb-4的抗原识别表位均不相同,Hb-3和Hb-4的抗原识别表位相同;竞争性ELISA测单抗的亲和力常数kaff=1.4×10-10 mol/L。     

B7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样肾炎的免疫干预效应

目的探讨在诱导c GVHD小鼠狼疮样肾炎模型并通过各项指标鉴定其造模成功的基础上,运用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体阻断B7/CD28共刺激信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应。方法将6~8周龄雌性(C57BL/6×BALB/c)BCF1小鼠随机分为4组,模型组于0、3、7和11 d经眼眶静脉注射100μL雌性亲代BALB/c小鼠脾脏细胞107/只。抗体干预组在造模后第1、3、5、8、15、30及60天分别经眼眶静脉注射100μL B7-1人-鼠嵌合抗体(克隆号2B11)200μg/只,环磷酰胺(CTX)干预组在末次注射淋巴细胞后第1、3、5、8、15天分别腹腔注射100μL CTX 2.5 mg/只。按照上述时间点分析小鼠抗ds DNA抗体、ANA及尿蛋白含量,12周时处死小鼠观察肾脏组织HE染色、免疫复合物(IC)沉积等情况。结果模型组100%小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为++~++++,抗体干预组12周时仅有30%的小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为+~++;12周时与模型组相比,抗体干预组小鼠血清抗ds DNA抗体阳性率由50%降至0;抗体干预组ANA阳性率由90%降至40%,且荧光面积与荧光亮度均下降;HE染色镜下观察,抗体干预组肾小球囊腔大小较为均一,炎性细胞浸润减少;直接免疫荧光法可见抗体干预组肾小球血管襻IC沉积减少。结论 B7-1人-鼠嵌合抗体可通过阻断或削弱B7/CD28共刺激信号通路,减少自身抗体和IC生成,逆转狼疮肾炎的病理损伤,提示该自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体对狼疮肾炎具有潜在的防治作用。     

轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上的适应性培养及免疫原性分析

目的:研究轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上的适应性及其免疫原性。方法:将轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上连续传代20代,进行适应培养,通过RNA-PAGE、PCR、核酸电泳、病毒滴度及小鼠免疫试验鉴定其遗传稳定性和免疫原性。结果:筛选出1株Vero细胞适应株(Ls)。该毒株在Vero细胞上稳定传代20代,具有遗传稳定性,且自第5代后病毒滴度均稳定在7.0 lgTCID50.mL-1以上。动物免疫结果表明,Vero细胞适应株Ls诱导小鼠产生高滴度的血清抗体。结论:Ls株可在Vero细胞上稳定增殖,具有遗传稳定性和良好的免疫原性。     

人结缔组织生长因子单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的人结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)免疫BalB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备CTGF单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),获得2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系7C7和8A11。两株细胞染色体众数分别为95条和91条;单抗亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG1型;间接ELISA法测定7C7和8A11腹水效价分别为:1.3×105和8.1×104;相对亲和力:7C7>8A11。CTGF单克隆抗体的制备为相关实验研究和临床诊断提供了条件。     

亲水突变法提高抗VEGFR2单链抗体的体外亲和力

为了提高抗VEGFR2单链抗体AK404R的亲和力,本研究采用亲水突变法将AK404R的重链CDR3区进行突变,建立次级突变单链抗体库。利用噬菌体展示技术从次级突变库中筛选具有抗VEGFR2特异性、高亲和力抗体,获得的抗体突变株经大肠杆菌HB2151分泌表达,镍亲和色谱柱纯化,并采用竞争性ELISA法、生物信息学方法分别对其亲和力和结构进行了分析。本研究最终建立了6.4×105的次级突变单链抗体库,其中两株突变株的亲和力有明显提高,两株突变株经分离纯化得到电泳纯的蛋白,竞争性ELISA结果显示突变体WZ01和WZ02的亲和力比亲本提高了3倍;生物信息学方法分析突变体与抗原的作用面增大、契合紧密,这可能是亲和力提高的原因之一。研究结果表明,在重链CDR3区引入亲水性氨基酸构建抗体突变库,可有效提高scFv的亲和力。     

基于M2与OK-432的肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞疫苗抗小鼠Lewis肺癌作用研究

目的：建立增强肺癌细胞裂解物（L）致敏的树突状细胞（D）疫苗（L-D）免疫临床治疗肺癌效果的方法。方法：以来源于热休克蛋白70第407~426的两段重复序列（M）和OK-432（O）为佐剂刺激Lewis肺癌细胞裂解物,制备了树突状细胞疫苗LMO-D。结果：与L-D相比, LMO-D显著增加CD11c、CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅰ和Ⅱ等细胞表面抗原的表达;LMO-D免疫荷瘤小鼠后,显著增强Th1类细胞因子肿瘤坏死因子α和干扰素γ,而不增强Th2类细胞因子白介素-5的表达;T淋巴细胞增殖诱导显著和淋巴细胞毒反应;此外LMO-D显著降低荷瘤小鼠瘤重与体积,延长了荷瘤小鼠的生存期。结论：LMO-D可通过诱导显著的T细胞免疫反应有效抑制肿瘤生长。     

人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLy S)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达。方法:以哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例为0.1%的阳性细胞。从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库。经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的Sc Fv序列。经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 Sc Fv抗体蛋白并通过Fortie Bio Octet QK进行亲和力分析。结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLy S Sc Fv抗体序列,成功构建并表达了anti-Bly S Sc Fv抗体蛋白,该单链抗体与的BLy S亲和常数为3.08 nmol·L-1。结论:从哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库中成功获得了可结合BLy S的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLy S具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础。     

CD40-CD40配体相互作用对培养的人单核细胞二酰基甘油-蛋白激酶C信号通路及胞内Ca^2＋的影响

目的：探讨CD40-CD40配体(CD40L)相互作用是否能激活人外周血单核细胞(PBMC)内二酰基甘油(DAG)-蛋白激酶C(PKC)信号通路．方法：细胞内DAG含量采用放射酶标记、薄层层析和放射自显影方法检测．细胞PKC活性及胞内游离钙分别采用[γ-^32P]ATP磷酸转移法和Fluo-3荧光负载流式细胞术检测．结果：CD40L以剂量依赖方式刺激人外周血单核细胞合成DAG,并具有双时限性变化,第一峰值在20s,第二峰值在10min时出现．然后DAG水平缓慢下降,至少持续20-30min．单核细胞蛋白激酶,C总活性受CD40L刺激后明显增加,峰值在12min,持续20min以上．并且这种作用主要是胞浆PKC活性向胞膜PKC活性转位所致．CD40L,能刺激胞内游离Ca^2 出现短暂的快速升高,继之为持续阶段．移去细胞外Ca^2 ,胞内快速阶段无影响,而持续阶段明显受到抑制．抗CD40抗体能显著抑制CD40L引起的胞内DAG-PKC信号通路激活及[Ca^2 ]i的动态变化．结论：CD40-CD40L相互作用能激活人外周血单核细胞[Ca^2 ]i动态变化及二酰基甘油-蛋白激酶C信号通路．     

一种新型的靶向BCL9/β-catenin的抗肿瘤和免疫调控的双功能订书肽抑制剂

基于之前在Science Translational Medicine发表的工作,我们对SAH-BCL9_B订书肽进行优化并研究先导化合物hsBCL9ct24的肿瘤药理作用机制。通过构效关系优化获得一系列活性化合物,并得到一种新的靶向β-catenin/BCL9复合体的十二肽抑制剂hsBCL9ct24。该分子可以在Kd仅为4.31 nmol·L~(-1)时以高亲和力的结合β-catenin,细胞水平抑制Wnt报告基因IC_(50)191 nmol·L~(-1)。hsBCL9ct24 sc给予的半衰期为13 h,生物利用度为70%。通过研究发现单药sc给予30 mg·kg~(-1),在CT26结肠癌小鼠模型中肿瘤生长抑制率为95%。hsBCL9ct24能够降低肿瘤VEGF和CD44的表达抑制肿瘤细胞迁移。我们还发现,hsBCL9ct24通过抑制TGF-β-CCL20/CCL22轴和促进趋化因子CCL4的表达,分别降低了调节性T细胞对肿瘤的浸润,提高了CD103+DC细胞对肿瘤的浸润,因此提高细胞毒性CD8~+T细胞、效应CD8+细胞和效应CD4~+细胞对肿瘤的浸润,发挥调节肿瘤微环境的作用。hsBCL9ct24和PD-1抗体联用,还能够提高免疫抵抗小鼠模型中PD-1抗体的响应率,且相较于大部分的Wnt抑制剂,hs BCL9_(CT)24显示出较好的耐受性,具有良好治疗窗口。     

氯霉素单克隆抗体的制备与纯化

目的制备氯霉素(CAP)单克隆抗体。方法用人工合成抗原氯霉素-牛血清白蛋白(CAP-BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例融合,间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;制备腹水抗体;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体,用间接竞争ELISA法和间接ELISA测定抗体特异性。结果得到两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-4以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单克隆抗体纯度达98%,回收率达80%,抗体活性好并且与BSA、甲砜霉素、磺二甲基嘧啶等无交叉反应。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,对动物性食品中CAP的检测具有较大的价值。