红白忍冬SABATH甲基转移酶基因克隆及其生物信息学分析

目的: 克隆红白忍冬SABATH甲基转移酶基因(rLjSABATHMT),比较忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶同源基因表达量和基因内含子序列的差异,为金银花的活性成分形成及调控机制研究提供基础。方法: 根据cDNA文库提供的基因片段设计特异性引物,从红白忍冬中克隆获得rLjSABATHMT基因cDNA序列及基因组序列。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA 5.0构建SABATH甲基转移酶系统进化树,利用RT-PCR分析SABATHMT同源基因在忍冬与红白忍冬的不同器官、不同花期的表达量,对忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列进行分析和比较。结果: 克隆获得的rLjSABATHMT基因cDNA序列全长为1 251 bp,具有完整编码框,编码365个氨基酸。该基因蛋白序列具有保守的SABATHMT结构域,系统进化树结果表明它可能是水杨酸/安息酸甲基转移酶。基因表达分析结果表明SABATHMT同源基因主要在花中表达。忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列具有丰富的多态性,且有2个SNP为红白忍冬的特有基因型;内含子区motif元件中碱基变异在2个同源基因间具有显著差异。结论: SABATHMT同源基因内含子区变异可能导致了忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶表达差异,为金银花活性成分调控机制研究提供了重要研究基础。     

金银花类药用植物IspE和IspH基因克隆和生物信息学分析

目的:克隆金银花类药用植物4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase,IspE)和4-羟基-3-甲基-2-邻苯基二磷酸还原酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase,IspH)基因,并对其基因序列、蛋白特性和转录活性进行分析、比较.方法:从忍冬Lonicera japonica转录组测序结果中分析获得了IspE,IspH基因.分别以忍冬、红白忍冬L.japonica var.chinensis、红腺忍冬L.hypoglauca和水忍冬L.dasystyla新鲜花蕾为材料,利用RT-PCR技术克隆获得了4种金银花类药用植物IspE和IspH基因的全长cDNA.运用生物信息学分析软件,预测编码蛋白的结构和功能,并通过RT-PCR检测IspE和IspH在忍冬、红白忍冬、红腺忍冬、水忍冬花蕾中的转录情况.结果:金银花类药用植物IspE基因含有1个完整的开放阅读框,长度为1 221 bp,编码406个氨基酸;IspH含有一个完整的开放阅读框,长度为1 380 bp,编码459个氨基酸.IspE和IspH均为非分泌蛋白,均定位于叶绿体中.RT-PCR分析结果表明在忍冬、红腺忍冬和水忍冬的花蕾中IspE,IspH基因的转录水平没有显著差异,但红白忍冬花蕾中IspE,IspH基因的转录水平均显著高于忍冬.结论:克隆获得忍冬、红白忍冬、红腺忍冬和水忍冬中IspE,IspH基因,并证实了其在不同金银花类药用植物中的表达,为进一步研究IspE,IspH基因对萜类化合物生物合成和花香气以及颜色的影响奠定了基础.     

金银花丙二烯氧化物合酶基因(LjAOS)的表达分析

目的检测LjAOS基因在金银花各组织中的表达量及在多种胁迫诱导下的表达量。方法利用半定量RT-PCR技术检测金银花根、白色花蕾、茎、叶组织中LjAOS基因表达量;检测LjAOS基因在茉莉酸/水杨酸/CuSO4/剪伤,尺蠖/白粉病诱导下的表达量。结果 LjAOS基因在金银花的各组织中均有表达,在白色花蕾和叶中的表达量较高;LjAOS基因能迅速响应多种外界胁迫,不同胁迫下LjAOS基因的表达模式不同。结论 LjAOS基因可能与金银花的抗病性、抗虫性密切相关。     

金银花HQT基因在真核植物细胞中对绿原酸生物合成的调控

目的通过构建羟基桂皮酰辅酶A羟基桂皮酰转移酶(hydroxycinnamoyl CoA quinate hydrocycinnamoyl transferase,HQT)基因真核表达载体以及建立金银花的遗传转化系统,阐明金银花HQT基因在真核生物细胞中对绿原酸量的调控机制。方法应用通路克隆系统技术构建HQT基因真核表达载体,利用根癌农杆菌介导法,构建含金银花HQT基因的工程菌,对转染成功的外植体进行愈伤诱导,进而进行半定量RT-PCR检测转基因愈伤组织中HQT基因的相对表达量以及利用HPLC检测其绿原酸的量,并对二者相关性进行分析。结果金银花愈伤组织中绿原酸的量随HQT基因表达量的升高而升高。结论金银花HQT基因在真核生物细胞内对绿原酸的生物合成具备调控作用。     

灵芝精氨酸甲基转移酶基因鉴定及表达分析

目的:在灵芝转录组基础上,对灵芝蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs)GLPRMT1,GLPRMT2和GLPRMT3基因进行全面的生物信息学分析。方法:利用生物信息学方法对灵芝GLPRMT1,GLPRMT2和GLPRMT3基因编码氨基酸序列的理化特性、亲/疏水性、功能域、二级结构、三级结构和系统发育进化等进行分析和预测;利用转录组FPKM分析灵芝不同生长时期GLPRMT1,GLPRMT2和GLPRMT3基因的相对表达量。结果:GLPRMT1和GLPRMT2均具有完整的开放阅读框且为全长,而GLPRMT3不为全长互补脱氧核糖核酸;GLPRMT1,GLPRMT2和GLPRMT3都具有蛋白质精氨酸甲基转移酶最保守的Ado Met-MTases结构域;GLPRMT1,GLPRMT2,GLPRMT3分别与真菌的PRMT3家族,PRMT1家族和PRMT5家族聚为一支;GLPRMT2的表达量明显高于GLPRMT1和GLPRMT3,且3个蛋白质精氨酸甲基转移酶基因表达随着灵芝个体的发育均呈上升趋势。结论:本研究结果为揭示灵芝的表观调控机制提供理论基础。     

灰毡毛忍冬内参基因筛选和Mads-box家族基因AGL15的时空表达分析

目的筛选灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides基因表达分析的内参基因,研究其Mads-box基因家族AGL15基因(Lm AGL15)的时空表达特性。方法克隆灰毡毛忍冬内参基因18 S r RNA、Ubiquilin、Actin和Efl-β的基因片段,评价了4个基因在不同部位叶、茎和花蕾,以及4个基因在灰毡毛忍冬生长不同时期的稳定性,筛选内参基因,分析Lm AGL15基因的时空表达特性。结果 18 S r RNA表达最稳定,适宜作为内参基因,叶片、茎的Lm AGL15基因相对表达量较低,花蕾相对表达量较高。花蕾不同发育时期,Lm AGL15的相对表达量呈现逐渐降低的变化,20 d后Lm AGL15的相对表达量最低,然后依次是花蕾初期(15 d)、青绿色花蕾期(10 d)、绿白色花蕾期(5 d)。结论 18 S r RNA是适宜的内参基因。叶片、茎和花蕾中,Lm AGL15的相对表达量差异明显。花蕾发育不同时期,Lm AGL15的相对表达量呈逐渐降低的变化,与花蕾开放变化规律相似。     

基于新疆紫草转录组的对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)基因的挖掘及生物信息学分析

对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)在紫草素类化合物的生物合成途径中起重要作用。该文主要通过生物信息学的方法从新疆紫草转录组中获得6个PGT基因,并预测其编码蛋白的理化性质,进行相关基因的表达分析。结构域预测结果显示,6个PGT蛋白序列均包含Ubi A异戊烯基转移酶家族保守结构域及异戊烯焦磷酸结合位点NDxx Dxxx D和可能的芳环的结合位点GX(K/Y)ST AL;系统进化树分析显示PGT与同源的对羟基苯甲酸多异戊烯转移酶(PPT)属于2个不同的进化枝;基因表达分析表明在紫草素类化合物产量较高的新疆紫草红色高产系悬浮细胞及植株的地下部分,其PGT基因的表达量明显高于白色低产系及植株的地上部分,说明新疆紫草PGT基因的表达量与紫草素类化合物的合成呈正相关。该研究为进一步了解对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)的功能及特性奠定了基础,并为紫草素类化合物生物合成及代谢调控提供依据。     

金银花莽草酸/奎宁酸香豆酰转移酶（LjHCT）基因克隆与序列分析

莽草酸/奎宁酸香豆酰转移酶（HCT）是金银花中绿原酸合成途径的关键酶。本研究利用已经获得的金银花（Lonicera japonica Thunb.）大量表达序列标签（EST）数据,通过cDNA 末端快速扩增（RACE）技术克隆获得8 条可能的HCT 基因cDNA 全长序列。通过序列相似性比较、蛋白质理化性质和保守结构域分析确定其中1 个基因为金银花HCT（LjHCT）基因。该基因全长1 275 个碱基,蛋白质分子量约为47kDa,为进一步研究HCT 在绿原酸合成过程中的功能奠定基础。     

灵芝DNA甲基转移酶(GlMET1)基因克隆及原核表达诱导分析

DNA甲基转移酶是DNA甲基化过程中最关键的酶,对生物体内的基因表达调节起着重要作用。研究根据灵芝转录组数据,通过全基因合成首次克隆得到灵芝DNA甲基转移酶Gl MET1,Genbank注册号为KU239998,并对其基因特性和空间结构进行全面的生物信息学分析。原核表达诱导分析表明p ET28a(+)-Gl MET1重组质粒在BL21(DE3)中能成功表达出目的蛋白,对其诱导条件进行优化,得出蛋白最合适的表达条件为:诱导温度为16℃,重组菌生长2.5 h(A600为0.8),IPTG浓度为0.2 mmol·L~(-1),诱导时间为12 h。实时荧光定量PCR结果表明不同品种灵芝Gl MET1的基因表达水平均有明显差异,且Gl MET1在成熟期的表达水平均低于幼年期,说明Gl MET1表达量随着灵芝的生长发育呈下降趋势。该研究结果为深入研究DNA甲基转移酶蛋白的作用机制奠定了基础。     

金银花中表达基因密码子偏好性分析＊

密码子是生物体中重要的遗传信息载体,经过长期进化,不同的生物体对同一密码子形成了一定程度的使用偏好性。本研究对已获得的金银花转录组进行基因预测,利用CodonW程序对所有含有完整阅读框的预测基因,以及参与绿原酸合成的羟基化肉桂酰转移酶（HQT）基因进行密码子偏好性分析。并将HQT基因与大肠杆菌、酵母和拟南芥全基因组的密码子使用频率进行比较,为在细菌、真菌和植物中表达金银花中HQT基因,或通过合成生物学手段异源合成绿原酸奠定了前期研究基础。     

鸢尾科3种药用植物种子的形态学及显微结构

目的:研究鸢尾科3种药用植物射干、鸢尾、马蔺种子的形态学及显微结构,为射干、鸢尾、马蔺种子的质量评价和鉴别提供科学依据。方法:用体式显微镜观察射干、鸢尾、马蔺种子形态,用石蜡切片方法制作射干、鸢尾、马蔺种子的切片,观察其显微结构。结果:射干和鸢尾种子均呈球形,外包黑色光滑的假种皮,表面有网状纹饰。射干种脐圆形或椭圆形,微凸,黄褐色。鸢尾种脐圆形,灰白色或黄白色。马蔺种子为不规则球形,暗砖红色、棕褐色或暗紫黑色,无光泽,内外种皮结合紧密,种脐黄白色,线形。显微结构可见,射干种皮细胞浅紫红色,鸢尾种皮细胞深紫色,马蔺种子不具假种皮,种皮结构较为复杂;三者的胚乳均较为发达、致密,胚位于中央。马蔺种子在形状、表皮颜色、假种皮有无、种脐颜色和形态上与射干、鸢尾种子有显著差异,从以上特征可与后两者予以区分;射干、鸢尾种子外观相似,但二者种脐的颜色和形态不同,种皮细胞颜色不同,可作为鉴别特征。结论:上述部分的特征可作为射干、鸢尾、马蔺种子的主要特征与其他物种区别,为三者的鉴别提供依据。     

干旱胁迫下忍冬全基因组DNA甲基化和转录组分析

目的 分析干旱胁迫下忍冬Lonicera japonica全基因组DNA甲基化水平变化、模式以及与基因表达的关系,为进一步探究忍冬响应干旱胁迫的分子机制奠定基础。方法 采用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序法（whole-genome bisulfite sequencing,WGBS）,测定干旱胁迫下忍冬全基因组DNA甲基化水平,并联合转录组测序结果对差异甲基化基因相关的差异表达基因进行分析。结果 干旱胁迫下忍冬整体甲基化水平普遍上升;其中CG类型甲基化水平明显高于CHG或CHH甲基化类型;对不同干旱胁迫处理下的忍冬进行差异甲基化区域（differentially methylated regions,DMR）分析,发现1935、2158和1750个差异甲基化相关基因,基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析表明,显著富集的通路主要包括亚油酸代谢,氮代谢通路和次生代谢物的生物合成通路等。通过转录组测序技术,发现差异甲基化基因相关的差异表达基因主要富集于次生代谢产物合成相关通路,同时筛选出4个在干旱胁迫下基因表达量上升显著的忍冬MYB（Lonicera japonica MYB,LjMYB）LjMYB转录因子。结论 干旱胁迫下忍冬甲基化水平上升,推测DNA甲基化调控基因表达是干旱影响金银花有效成分生物合成的作用机制之一。     

基于RAPD的福建产南方红豆杉遗传多样性研究

目的对福建省23个不同地理种源的南方红豆杉Taxus chinensis var.mairei进行分析,以揭示其种源和种群的遗传多样性,为南方红豆杉资源的收集与保护提供一定的理论依据。方法利用RAPD分子标记技术,对福建省23个不同地理种源的南方红豆杉的遗传多样性进行分析。结果物种水平上的观测等位基因数(Na)为1.974 4,有效等位基因数(N_e)为1.603 8,Nei’s基因多样性指数(H)为0.351 3,Shannon多样性指数(I)为0.522 8。不同种源的南方红豆杉的遗传多样性相对较高。通过对种源和种群的遗传多样性分析,发现23个不同种源的南方红豆杉的遗传距离变化幅度为0.240 4~0.912 0,遗传相似度的变化幅度为0.401 7~0.786 3。7个不同种群的南方红豆杉群体的遗传距离变化幅度为0.021 0~0.379 4,遗传相似度的变化幅度为0.684 3~0.979 2。根据Nei法计算南方红豆杉7个种群遗传多样性遗传相似度(D_(st))为0.108 8,分化指数(G_(st))为0.369 0,基因流系数(N_m)为0.855 0,总的遗传变异中有36.9%的变异存在于群体间,群体内的变异63.1%,种群内存在明显分化。结论不同种源间的南方红豆杉存在一定的遗传变异,但不同种群间的南方红豆杉群体的相似度又比较高,亲缘关系较近。     

中药重楼全球产地生态适宜性分析

在野外调查和数据收集的基础上,结合药用植物全球产地生态适宜性分析系统(geographic information system for global medicinal plants,GMPGIS),对中药重楼全球产地生态适宜性区域进行分析和评价。以重楼药材基原物种云南重楼Paris polyphylla var.yunnanensis和七叶一枝花P.polyphylla var.chinensis道地产区、主产区与野生分布区的采样点为依据,选取最冷季平均气温、最热季平均气温、年平均气温、年均降水量、年均相对湿度、年均日照强度和土壤类型7个生态指标作为主要参考因子,经过生态相似性比对分析得出云南重楼与七叶一枝花在全球范围内的生态适宜性产区和潜在种植区。结果表明云南重楼和七叶一枝花的最大生态相似度区域相似,在全球范围内主要分布在中国、巴西、美国、赞比亚、刚果、缅甸、坦桑尼亚、墨西哥、安哥拉及玻利维亚等19个国家。其中,中国的最大生态适宜性产区主要包括云南、四川、广西、湖南、湖北、广东、贵州、江西、福建和安徽等16个省区。该研究表明GMPGIS可以较好地应用于中药材引种及生产区划,研究结果可为重楼药材的资源保护和可持续利用提供参考依据。     

金银花颜色与有效成分含量的相关性分析

目的:通过测定金银花的颜色及其有效成分绿原酸和木犀草苷的含量,将代表颜色的指标值与代表质量的指标值相联系,探索颜色与有效成分之间的相关性.方法:采用高效液相色谱法测定18批不同产地、采收期、加工方法的金银花样品中绿原酸、木犀草苷的含量,利用电子感观分析方法(色度仪)测量金银花的颜色.结果:绿原酸的含量与色度测量值L*值呈负相关,木犀草苷的含量与颜色值之间不存在显著相关关系.结论:通过该方法对颜色的测量,快速地判断或预测绿原酸的含量,其具体机制有待进一步研究.     

七叶一枝花甾体皂苷种类及含量差异研究进展＊

重楼是我国传统的名贵中药，七叶一枝花为历版《中国药典》收载的重楼药材两个基原植物之一，具有清热解毒、消肿止痛、活血化瘀等功效，其主要活性成分为甾体皂苷类物质。由于重楼市场需求量剧增和七叶一枝花成药时间较长，导致大量依靠人工种植。然而，人工种植过程中产地、采收年限和采收月份都会影响七叶一枝花的甾体皂苷含量。本文系统地总结了七叶一枝花中主要活性成分甾体皂苷的种类，以及不同产地、不同生长年限及不同采收月份的七叶一枝花根茎中甾体皂苷含量差异的研究现状，以期为进一步研究七叶一枝花品质差异、野生资源驯化及规范化种植提供参考。     

重楼根际及药用部位内生真菌多样性与群落结构差异分析

目的寻找能促进宿主植物活性代谢产物合成的微生物,为后续功能菌群的建立及功能基因的发掘,提供理论支持。方法应用IlluminaMiseqPE250高通量测序技术对重楼根际土壤真菌、根及根茎内生真菌ITS1区进行序列测定,并进行生物信息学分析。结果测序结果共获得154228条序列,这些序列对应的根际土、根茎、根分别被聚类为408、119、57个OTUs。结论重楼根际及内生真菌多样性的关系为根际土根茎根,在重楼药用部位根茎中发现Mucoromycota门较非药用部位根中的门为特有门,Ascomycota门为优势门,Roseodiscus属真菌为重楼根茎内生真菌优势菌群,根茎和根部的特有种群及优势菌群可能与重楼活性产物合成密切相关。     

基于16 S rRNA序列研究华重楼植株可培养内生细菌的多样性

目的分析华重楼Paris polyphylla健株和茎腐病感病植株内生可培养内生细菌的多样性。方法用牛肉膏蛋白胨培养基分离华重楼茎腐病及健康植株根茎、茎、叶等不同部位的细菌,采用16 S rRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增结合DNA测序技术,对分离自华重楼健株及茎腐病植株不同部位的细菌进行初步鉴定。结果从华重楼的健康植株和感病植株中分离到11属23种细菌。从健株分离到4属11种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到9、10和5种内生细菌。从病株分离得到10属14种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到11、8和3种内生细菌。华重楼健株的根茎部内生细菌量最高,达2.999×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为7.32×104 cfu/g,华重楼健株根茎、茎、叶中的芽孢杆菌量最高,比例分别为73.3%、67.1%和81.8%。华重楼病株的茎部内生细菌量最高,达2.817×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为2.76×104 cfu/g,华重楼病株的根茎、茎、叶部的假单胞菌量最高,比例分别为35.6%、50.3%和60.5%。华重楼健株不同部位的多样性指数和均匀度指数均高于病株。结论华重楼健康植株以芽孢杆菌为优势细菌类群,华重楼茎腐病植株以假单胞菌为优势细菌类群。华重楼健株相比病株具有更为丰富的内生细菌群落多样性。     

黄连WRKY基因家族鉴定及表达分析＊

目的 本研究使用生物信息学方法鉴定黄连WRKY基因家族成员并对其表达模式进行分析，为进一步研究黄连WRKY基因家族的功能及其对黄连生物碱合成途径的调控机制提供参考。方法 利用HMMER、BLAST、TBtools、IQ-Tree等软件，ExPASy、WOLF PSORT、MEME在线网站等对黄连基因组中的WRKY基因家族进行鉴定、可视化分析和表达模式分析。结果 从黄连基因组中鉴定出了41个WRKY基因，其ORF长度为252-2796 bp，编码蛋白的氨基酸数量为84-931 aa，分子质量为9649.32-103620.60 Da，等电点为4.96-10.17，95%以上蛋白预测亚细胞定位于细胞核；41个CcWRKY（黄连WRKY）基因不均一地分布在9条染色体上；系统发育分析将41个CcWRKY蛋白分为3大类，第Ⅰ类有6个，第Ⅱ类有31个，第Ⅲ类有4个；同一类CcWRKY蛋白结构域高度保守，大多CcWRKY基因外显子数量为3-7，内含子数量为2-6。表达分析结果为，除了保守结构域高度缺失的CcWRKY38、CcWRKY40外，所有的CcWRKY都至少在一个组织中有表达，且多数是特异性表达。结论 全面分析了黄连基因组中的WRKY基因家族，有助于进一步解析WRKY基因家族在黄连生物碱生物合成途径的调控机制。