基于转录组数据对七叶树中三萜皂苷合成途径的研究

七叶树是七叶树科七叶树属高大乔木,集药用与观赏于一身。七叶树种子是其主要的药用部位,主要有效成分为齐墩果烷型三萜皂苷类化合物七叶皂苷。为了解七叶树三萜化合物生物合成的分子基础,该研究采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序获得七叶树种子与花的转录组数据,并对其代谢途径相关基因进行挖掘;使用Trinity软件实现unigene的de novo拼接;并将转录组的测序结果运用KEGG数据库进行注释,从而预测七叶树三萜代谢的具体途径。结果显示七叶树转录组共有2个三萜代谢途径相关数据集,分别为萜类物质前体代谢途径(途径编号为ko00900)和倍半萜与三萜代谢途径(途径编号为ko00909),对应的基因分别有47,27条。进一步根据催化酶与活性产物的总结比较分析发现萜类物质前体代谢途径相关酶共有8种,三萜代谢途径相关酶有3种。该研究首次在七叶树中解析出5条与三萜环化酶对应的基因,它们可能参与β-香树精合成进而形成七叶皂苷。通过种子与花的转录组表达差异分析显示,ko00900和ko00909途径相关的差异基因有33个;相对于花器官,种子中有17个unigenes表达量上调,16个unigenes表达量下调。该研究运用qRT-PCR实验对SQE(Unigene25806),HMGS(Unigene36710),β-AS(Unigene33291) 3个差异显著的关键酶基因的表达进行了试验验证,实验结果qRT-PCR结果与转录组数据一致。该研究所发现的七叶树的三萜皂苷合成相关候选基因能对七叶树三萜代谢合成与调控方面提供理论依据。     

茉莉酸甲酯诱导下远志幼苗转录组分析及三萜类生物合成途径关键酶基因挖掘

目的获得远志Polygala tenuifolia响应茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理的转录组学信息,挖掘远志三萜类化合物骨架生物合成的关键酶基因。方法以生长30 d的远志组培苗为材料,分别用无菌水(CK)、50μmol/L MeJA、100μmol/LMeJA处理24h,采用Illunima Hiseq~(TM)2000 150PE进行转录组测序,使用Trinity软件完成Unigene的denovo拼接,基于BLAST实现Unigene的分类、功能注释、代谢通路分析、蛋白功能注释、差异基因分析和筛选等。结果最终获得52.19 Gb数据,通过de novo拼接注释得到Unigene 54 426条,平均长度为1 604 bp,注释成功率100%。通过对MeJA处理前后基因进行差异分析,共筛选出差异基因3 390个,其中有1 287个上调,2 103个下调,且以100μmol/L MeJA处理的差异基因总数及上调数最高。KEGG富集分析表明,差异基因主要富集于苯丙烷类生物合成、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、淀粉蔗糖代谢、光合生物的固碳作用、萜类骨架生物合成等KEGG通路中。找到与远志三萜类骨架生物合成相关的基因59条,其中AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、DXS、IDI、FPPS、SQS、SE和β-AS受MeJA诱导后表达量上调。结论对MeJA处理后的远志幼苗转录组进行分析,获得远志三萜类骨架生物合成相关的候选基因,MeJA可以诱导其三萜类骨架合成相关基因的表达,为远志的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后期开展远志三萜皂苷类化合物次生代谢途径解析奠定了基础。     

三萜皂苷生物合成途径及关键酶的研究进展

三萜皂苷是植物界中具有多种生物活性的一类重要的植物次生代谢产物,是许多药用植物或中药材的重要活性成分之一,阐明三萜皂苷的生物合成途径具有重要的理论意义与广阔的应用前景。近年来,三萜皂苷整个生物合成途径的阐明,尤其是三萜碳环骨架合成及环上复杂官能化等相关酶基因的确定与克隆,仍是众多学者关注与研究的热点。本文对三萜皂苷的生物合成途经和有关“鲨烯及三萜碳环骨架合成和碳环上的复杂官能化”的关键酶进行了综述,为深入阐明三萜皂苷生物合成途径及人工生物合成提供理论基础。     

茜草转录组分析及其蒽醌类化合物合成相关基因的挖掘

目的获得茜草Rubia cordifolia转录组学信息及挖掘其蒽醌类化合物生物合成的关键酶基因,为茜草的功能基因克隆与分析提供参考。方法采用Illunima Hiseq TM 2000 150PE高通量测序技术对茜草进行转录组测序,使用Trinity软件完成Unigene的de novo拼接,基于BLAST实现Unigene的分类、功能注释、代谢通路分析和蛋白功能注释等。结果最终获得7.3 Gb数据,通过de novo拼接注释得到Unigene 66 646条,平均长度为1 424 bp,所有Unigene能被NCBI nonredundant protein sequences(NR)、NCBI nucleotide sequences(NT)、kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)、A manually annotated and reviewed protein sequence database(Swissprot)、gene ontology(GO)、eu Karyotic ortholog groups(KOG)和protein family(Pfam)数据库所注释,注释成功率100%,找到与茜草蒽醌类化合物生物合成相关的基因64条。结论首次对茜草转录组进行了分析,并获得了茜草蒽醌类化合物生物合成相关的候选基因,为茜草的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后期开展茜草蒽醌类化合物次生代谢途径解析奠定了基础。     

大青转录组测序及生物信息学分析

【目的】 利用高通量测序技术获得大青的转录组信息特征。【方法】 通过高通量测序平台Illumina HiSeqTM 2500 对大青进行转录组测序,采用Trinity软件de novo组装获得Unigene,并基于序列同源性对Unigene 进行功能注释,得到大青转录组的遗传信息。【结果】 测序数据经过质控后共获得26 394 223个高质量的Reads,通过de novo组装获得100 191个Unigene,N50长度为1 055 bp,平均长度724.4 bp。其中59 690个（59.58%）Unigene 在NR、SwissProt、KOG、GO、KEGG数据库中均得到注释。其中KEGG数据库注释到38 260个Unigene,涉及136条代谢通路。在大青转录组中共鉴定到407个Unigene参与萜类化合物的生物合成,165个Unigene 涉及类黄酮生物合成,29个Unigene参与黄酮和黄酮醇生物合成,37个Unigene参与异黄酮生物合成,同时,还鉴定到210类转录因子。MISA分析发现6 680个Unigene 包含8 640个简单重复序列。【结论】 利用高通量测序技术和生物信息分析获得了大青的转录组信息特征,这些数据可为后期开展功能基因鉴定、解析黄酮类化合物次生代谢途径及其调控机制奠定研究基础。     

盾叶薯蓣转录组分析及其皂苷元生物合成关键酶基因的挖掘

目的分析比较盾叶薯蓣根茎与叶片的转录组,挖掘与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina Hi Seq2000高通量测序技术对盾叶薯蓣根茎与叶片进行转录组测序,对测序结果进行注释分析;并结合根茎与叶片中皂苷元的含量测定结果,挖掘与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径相关的关键酶基因;最后利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对部分候选基因的表达模式进行分析。结果共获得了81 660个Unigene,有64.33%在NT、NR、Swiss-Prot、KOG、GO、KEGG数据库中得到注释;根据其表达量与代谢通路分析筛选出29种共227个可能参与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径的催化酶基因,部分催化酶基因的表达模式与皂苷元含量具有一定相关性;并发现5个盾叶薯蓣内生菌基因。结论研究初步获得了盾叶薯蓣中参与皂苷元生物合成的候选关键酶基因,部分候选酶基因可能参与盾叶薯蓣中皂苷类成分的后修饰过程,并发现盾叶薯蓣根茎中内生菌可能参与其皂苷元的生物合成,为进一步阐明盾叶薯蓣中皂苷元生物合成的分子机制奠定基础。     

赶黄草的转录组测序及分析

目的获得赶黄草Penthorum chinense转录基因参考序列和表达量信息,探索赶黄草药用活性成分生物合成的遗传基础,为赶黄草的重要功能基因研究提供参考。方法采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序技术,对赶黄草进行转录组测序,对获得的数据进行过滤组装,对得到的unigene进行比对注释,同时对本研究获得赶黄草活性成分合成相关代谢通路基因进行分析。结果共获得了40 005 442条有效的短读序,通过de novo拼接得到42 306个unigene,开放阅读框(ORF)分析共计得到518个ORF,其中75个ORF具有转录因子结构域。通过KEGG分析,检测到33、32、59、68个unigene分别参与黄酮类生物合成、固醇类生物合成、萜类骨架生物合成和羧酸代谢。结论本研究发现的这些基因对赶黄草遗传改良和药用活性物质的生物合成路径相关基因研究有着重要意义。     

三叶青根与茎叶转录组和差异性表达分析

目的采用Illumina Hi Seq 4000测序技术获得三叶青转录组数据,为三叶青分子生物学研究提供重要分子信息。方法以三叶青根和茎叶为材料,进行转录组测序,对测试数据进行基因功能注释、代谢途径及微卫星等的生物信息学分析。结果共获得24.13 Gb Clean Data,拼接组装得到84 433条Unigene,与7个基因数据库进行比对,最终获得47 766个有注释信息的Unigene。在GO数据库中注释27 790条,其根和茎叶的差异表达基因数目为4989个,其中上调为3511个,下调为1478个;COG数据库得到16 152条三叶青Unigene的同源序列,共分为25个类别;在KEGG数据库有14 511条Unigene获得对应的Ko编号,可分为130个信号代谢分支,其中核糖体合成途径的Unigene数量最多,有1042条,而异黄酮的生物合成途径只有1条Unigene。结论对三叶青转录组进行拼接、组装和功能注释得到大量转录本信息,为三叶青分子生物学研究提供基因组数据库资源。     

利用转录组分析款冬萜类化合物生物合成关键酶基因及表达特征

目的挖掘与款冬萜类化合物生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina HiSeq2500测序平台对野生款冬花蕾和叶进行转录组测序,使用Trinity软件de novo从头组装,并通过基因功能注释、差异表达基因分析等生物信息学方法进行分析,挖掘款冬中萜类化合物生物合成途径相关的酶基因。结果转录组测序获得39 912 371条高质量reads(SRA号:SRR9113366,SRR9113367),组装获得91 118条Unigene,55 830条Unigene在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等数据库得到注释。鉴定出参与款冬萜类化合物生物合成相关酶基因的129个Unigene,包括91个参与三萜骨架生物合成酶基因,32个萜类合成酶基因,6个细胞色素P450基因,其中差异表达基因25个,涉及上游MVA途径的4个差异基因在花蕾中表达量高于叶,MEP途径的5个差异基因在叶中表达高于花蕾,另外还有10个基因在叶中高表达,9个基因在花蕾中高表达。根据差异基因HMGR、TPS、AS、CYP450基因在花蕾中高表达,推测可能与花蕾中萜类物质含量高有关。结论从款冬转录组数据库中初步获得了可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因,为进一步阐明款冬萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。     

夏枯草的转录组测序与次生代谢产物生物合成相关基因的挖掘

目的获得夏枯草转录组信息,探索夏枯草次生代谢产物生物合成的分子基础。方法利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对夏枯草果穗、茎和叶等部位进行转录组测序,经Trinity软件组装后获得Unigene,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得77 863条Unigene,平均长度为716.72 nt。通过与NR、Swiss-Prot、COG等7个公共数据库进行BLAST比对,共有41 367个Unigene获得注释,注释率为53.13%。在KEGG数据库中,有1 406条Unigene被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与夏枯草三萜类骨架合成的Unigene共有60个,参与酚酸类合成的Unigene共有24个,参与次生代谢后修饰的Unigene共有259个,参与其他次生代谢合成的Unigene共有118个。结论夏枯草转录组数据为探索夏枯草次生代谢产物的生物合成机制提供了重要的资源,也为利用代谢工程增加夏枯草中重要次生代谢产物含量提供了基础信息。     

珠子参种质资源遗传多样性的ISSR分析

目的研究珠子参Panax japonicus种质资源的遗传多样性。方法采用ISSR分子标记技术,通过聚类分析和主坐标分析,研究3个主要产地珠子参的19个样本的遗传多样性和亲缘关系。结果 13条ISSR引物扩增出181条带,其中有166条呈现多态性,占91.71%,遗传相似系数变化范围0.60~0.83。聚类分析和主坐标分析结果一致,将源于同一地区的珠子参样本聚在一起,呈现出一定的地域性分布规律。结论珠子参样本之间的遗传多样性水平较高,种质间的亲缘关系和地理位置有一定关系。     

白鲜根转录组高通量测序与数据分析

目的获得白鲜Dictamnus dasycarpus根转录组信息特征。方法以白鲜根为研究对象,采用Illumina HiSeq TM 2000150PE进行高通量转录组测序并进行数据分析。结果转录组测序共获得69 643 286条高质量序列(clean reads),Trinity denovo组装获得49 050条unigenes,平均长度841 nt。BLAST分析显示分别有31 636(64.49%)、22 367(45.60%)、19 246(39.23%)、12 595(25.68%)条unigenes在NR、Swiss-port、KOG、KEGG数据库得到注释信息,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类42分支,涉及132个KEGG标准代谢通路,其中包括18个次生代谢标准通路。进一步分析获得90个基因参与多种生物碱生物合成通路。蛋白编码框序列1 908个,高等植物转录因子55个家族;借助MISA软件发现4 579个SSRs,三碱基重复最丰富,有2 021个,出现频率为44.1%;五碱基重复SSRs仅占3.5%。结论利用高通量测序技术获得白鲜根转录组信息特征,为后期白鲜基因功能鉴定、次生代谢途径解析及其调控机制研究奠定基础。     

基于RNA-seq的银线草转录组分析

目的获得银线草Chloranthusjaponicus根茎转录组信息特征。方法用高通量测序平台IlluminaHiSeq TM2000150PE进行银线草根茎转录组测序分析。结果转录组测序共获得68458750条高质量序列(cleanreads),Trinitydenovo组装获得56 096个unigenes,平均长度801 nt。BLAST分析显示分别有25 773(45.94%)、17 801(31.73%)、16 082(28.67%)、9649(17.20%)个unigenes在NR、Swiss-port、KOG、KEGG数据库得到注释信息,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类40分支,涉及131个KEGG标准代谢通路,其中包括16个次生代谢标准通路。进一步分析获得170个基因参与单萜、二萜、倍半萜、三萜等萜类化合物生物合成通路。同时,转录组预测编码蛋白框序列1 887个;高等植物转录因子54个家族。借助MISA软件发现8 987个简单重复序列(SSRs),二碱基重复SSRs数量最丰富,有5 948个,出现频率为66.2%,五碱基重复SSRs相对较少,占1.3%。结论基于RNA-seq分析获得银线草根茎转录组信息特征及萜类合成代谢通路关键基因,为后期银线草活性成分次生代谢途径解析及调控研究奠定基础。     

采用一测多评法同时测定人参-柴胡药对及其制剂中5种皂苷成分

目的采用一测多评法对临床常用药对人参-柴胡及其制剂中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d进行测定。方法以人参皂苷Rg1为参照,建立该成分与其他4种皂苷成分间的相对校正因子,并以此计算其他4种皂苷成分的含量;同时采用外标法实测5种成分的含量进行对比。使用不同色谱柱确定相对保留时间,评价一测多评法在人参-柴胡药对中测定皂苷成分的可行性和准确性。结果建立了5种皂苷成分的定量控制方法,方法学考察结果良好。采用一测多评法及外标法测定人参-柴胡药对、小柴胡汤、开心解郁方中5种皂苷成分,采用t检验分析,一测多评法与外标法结果无显著性差异。结论一测多评法适用于常用药对人参-柴胡中皂苷成分的含量测定,可为复方中人参-柴胡药对有效成分的测定提供借鉴,以及为复方质量控制方法的建立提供参考。     

长柱重楼中主要甾体皂苷类成分的定性定量分析

为了从化学成分上研究长柱重楼是否具有重楼药材代用品的开发价值,该研究利用UPLC-Q-TOF MS比较了长柱重楼和滇重楼的化学成分,并进一步利用HPLC-UV同时测定了77株不同来源的长柱重楼中8种重楼皂苷的含量。结果显示长柱重楼和滇重楼的化学成分相似,长柱重楼化学成分更为复杂,鉴定的22个主要共有峰均为甾体类化合物。不同株长柱重楼中重楼皂苷的含量具有一定的差异,其中药典规定4种甾体皂苷(重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ)总量最高的为3.30%,最低的为0.068%,8种甾体皂苷总量最高的为6.18%,最低的为0.71%。长柱重楼中78%的样品符合《中国药典》要求,整体质量较为稳定,可以作为重楼替代品种进行研究开发。     

基于转录组测序的山茱萸次生代谢生物合成相关基因的挖掘

为探讨山茱萸中环烯醚萜等次生代谢产物合成的遗传基础,采用新一代高通量测序技术对其果实进行转录组测序,共获得得96 032条unigenes,平均长度590.53 bp;其中共有35 478条unigene能被NR,Swissprot,COG,GO,KOG,Pfam和KEGG等7个公共数据库注释。通过对注释所得的unigene进行KEGG代谢通路的分析发现,共有84个unigene与环烯醚萜类成分的生物合成有关;487条unigene参与山茱萸其他次生代谢相关物质代谢调控。研究发现,共有153条unigene参与山茱萸次生代谢产物的氧化/羟基化;72条unigene参与次生代谢产物的糖基化。该研究首次对山茱萸转录组进行了分析,并获得了山茱萸环烯醚萜类等次生代谢生物合成相关的候选基因,为山茱萸的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后续探讨候选基因的功能奠定了基础。