自噬抑制剂3-MA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞表达TNF-α的抑制作用

目的研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对缺氧条件下人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组、缺氧组和3-MA+缺氧组,对照组细胞在常氧条件下培养,缺氧组细胞在缺氧箱(1%O2/5%CO2/94%N2)中进行培养,3-MA+缺氧组先在培养基中加入10 m M 3-MA,然后置于缺氧箱中继续培养。采用Western blot法检测各组细胞的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 B (LC3B)、Beclin-1及p62的表达;采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α的浓度。结果 (1)对照组、缺氧组、3-MA+缺氧组细胞的TNF-α浓度分别为(59. 46±5. 22) pg/ml、(135. 80±11. 30) pg/ml和(105. 88±10. 42) pg/ml,总体比较差异有统计学意义(F=50. 53,P=0. 000),缺氧组的TNF-α浓度明显高于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 01),3-MA+缺氧组的TNF-α浓度高于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01)。(2)对照组、缺氧组、3-MA+缺氧组细胞中的LC3B-II/LC3B-I值、Beclin-1值及p62值分别为(0. 20±0. 03、0. 58±0. 07和0. 40±0. 09)、(0. 32±0. 04、0. 97±0. 05和0. 78±0. 06)和(1. 03±0. 02、0. 32±0. 10和0. 78±0. 08),组间总体比较差异均有统计学意义(LC3B-II/LC3B-I:F=21. 73,P=0. 002; Beclin-1:F=149. 34,P=0. 000; p62:F=69. 53,P=0. 000)。缺氧组细胞中LC3B-II/LC3B-I值和Beclin-1值均明显高于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 05),3-MA+缺氧组的LC3B-II/LC3B-I值和Beclin-1值均高于对照组,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。缺氧组细胞中p62值明显低于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 01),3-MA+缺氧组的p62值低于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01)。结论缺氧激活RPE细胞自噬并促进其TNF-α的表达,自噬抑制剂3-MA可在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞表达TNF-α的作用。     

血管内皮细胞生长因子抑制剂对视网膜血管内皮细胞自噬的促进作用

目的　观察血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）抑制剂对小鼠视网膜血管内皮细胞（retinal vascular endothelial cells,RVECs）自噬水平的影响。方法　将RVECs随机分为五组:正常对照组、缺氧对照组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组、VEGF抑制剂（anti-VEGF）组和3-MA+anti-VEGF组。采用Western blot法检测RVECs中两种自噬标志蛋白微管相关蛋白1 轻链 3 （LC3）及Beclin-1的表达;计算绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）阳性斑点细胞占比;透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬体的超微结构。结果　正常对照组、缺氧对照组、3-MA组、anti-VEGF及3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为0.182±0.125、0.587±0.101、0.309±0.151、0.914±0.037及0.585±0.098;Beclin-1分别为0.205±0.035、0.590±0.120、0.425±0.082、0.842±0.087及0.607±0.022;GFP阳性斑点细胞比例分别为17.107%±3.521%、90.278%±2.684%、82.591%±4.490%、94.798%±1.760%及89.472%±3.764%。与正常对照组相比,缺氧对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达增高,GFP阳性斑点细胞的比例增加（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与缺氧对照组相比,3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少;anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率升高（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与anti-VEGF组相比,3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少。结论　VEGF抑制剂对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的自噬水平有促进作用。     

自噬抑制剂3-MA对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的并发症之一,视网膜色素上皮(RPE)细胞作为视网膜重要的组成细胞在DR的发生和发展中至关重要. 目的 探讨自噬抑制剂3-MA对高糖培养的人RPE细胞(hRPECs)增生的影响.方法 将体外培养的hRPECs分为对照组、高糖组和3-MA+高糖组,对照组细胞用含5 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,高糖组采用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,干预组细胞先在DMEM/F12培养基中添加10 mmol/L的3-MA处理1h后,再添加30 mmol/L葡萄糖溶液进行培养.将培养的细胞以1×105/孔的密度接种于24孔细胞培养板中,待细胞80％融合后用含体积分数0.5％胎牛血清的培养基继续孵育24 h,使细胞周期同步化.倒置光学显微镜和透射电子显微镜下观察各组jRPECs的形态及超微结构;采用CCK-8法检测各组hRPECs的增生率;采用Western blot法检测各组hRPECs中自噬相关基因微管相关蛋白轻链3B(LC3B)蛋白的表达.结果 对照组细胞生长状态良好,细胞排列整齐;高糖组细胞体积稍增大,细胞数量明显多于对照组,而3-MA+高糖组细胞形态不规则,排列紊乱.透射电子显微镜下可见对照组细胞核呈圆形或卵圆形,亚细胞器形态均正常,未发现自噬小体;高糖组细胞中可见自噬溶酶体,而3-MA+高糖组可见自噬小体.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞的增生率分别为(100.0±2.0)％、(116.9±5.2)%和(103.7±4.7)％,总体比较差异有统计学意义(F=13.526,P=0.006),高糖组的细胞增生率明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞增生率的差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,高糖组细胞中LC3B-Ⅰ蛋白表达减弱,LC3B-Ⅱ蛋白表达增强,而3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ蛋白的表达强度与对照组接近.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值分别为0.131±0.065、2.504±0.097和0.274±0.007,组间总体比较差异有统计学意义(F=1 694.676,P=0.000),高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖可激活自噬过程并促进hRPECs增生,而自噬抑制剂3-MA在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞增生的作用.     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用

背景 白细胞介素-1β(IL-1β)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)早期释放的重要炎性因子,研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚. 目的 观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响,探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响.方法 采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验,在无血清DMEM培养基中分别添加0、0.1、1.0和10.0 μg/L的IL-1β作用于细胞24 h,分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β最佳质量浓度.将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素+IL-1β组,分别在无血清培养基中添加1.0 μg/L IL-1β和1.0μg/L IL-1β联合10 μg/ml姜黄素作用于细胞24、48和72 h,仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组.培养的细胞行苏木精-伊红染色,于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数,比较各组细胞的移行能力;分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量,采用Western blot法检测并比较各组细胞中核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白和核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)的相对表达量;采用免疫化学染色法检测NF-κBp65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位. 结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,接近融合的细胞形态为长梭形,呈拉网状分布.免疫细胞化学染色法结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质呈阳性表达.对照组在培养24、48和72 h移行的细胞数分别为(31.93±1.21)、(36.27±2.50)和(38.33±2.40)个,IL-1β组分别为(45.73±2.30)、(71.13±1.92)和(80.60±1.71)个,而姜黄素+IL-1β组分别为(13.13±2.20)、(14.93±1.10)和(12.60±1.51)个,各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组,而姜黄素+IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β质量浓度为1.0 μg/L时,RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰,以1.0 μg/L IL-1β的剂量进行后续实验.细胞培养后24、48和72 h,姜黄素+IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β作用于细胞后48 h,细胞中NF-κBp65蛋白的相对表达量最高,与IL-1β组相比,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中NF-κBp65蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β组药物作用于细胞后48 h细胞中IκB-α降至最低,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫细胞染色结果显示,IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF-κBp65呈强阳性表达,对照组表达较弱,姜黄素+ IL-1β组细胞中NF-κBp65的表达强度较IL-1β组明显降低;与对照组相比,IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱,而COX-2表达明显增强;与IL-1β组比较,姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强,而COX-2表达明显减弱.结论 姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行,IL-1β通过激活NF-κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达,姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达,从而发挥抗炎作用.     

铁死亡在高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤中的作用及机制

目的：观察铁死亡在高糖(HG)诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤中的作用及机制,为糖尿病视网膜病变(DR)的治疗提供新思路。

方法：将体外培养的ARPE-19细胞分为正常对照组(NC组)、高糖组(HG组)、高糖+铁死亡抑制剂组(Fer-1组)。采用CCK-8法检测各组细胞活力; 使用ELISA试剂盒检测白细胞介素6(IL-6)、IL-1β及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达水平; 使用化验试剂盒检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)水平; 使用铁离子检测试剂盒检测细胞铁含量; 通过透射电子显微镜观察细胞线粒体变化; 通过Western blotting和免疫荧光染色技术检测铁死亡相关蛋白长链脂酰CoA合成酶4(ACSL4)、GPX4以及血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达。

结果：与NC组相比,HG组细胞活力显著下降,细胞上清液中炎症因子表达水平升高,细胞中氧化应激指标MDA和铁含量显著升高,GSH含量和GPX4活性显著降低(均P<0.01),且线粒体皱缩,ACSL4及VEGF蛋白表达增加,GPX4蛋白表达降低(均P<0.01)。与HG组相比,Fer-1组细胞活力明显增加,细胞上清液中炎症因子表达水平下降,细胞中MDA和铁含量明显下降,GSH含量和GPX4活性显著提高(均P<0.05),且线粒体形态改善,ACSL4及VEGF蛋白表达减少,GPX4蛋白表达升高(均P<0.05)。

结论：铁死亡参与高糖诱导的RPE细胞损伤,抑制铁死亡能改善细胞活性,降低炎症及氧化应激水平,减轻高糖诱导的RPE细胞损伤。     

NLRP3/IL-1β通路在增殖性糖尿病视网膜病变中的作用机制

目的：探究核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)/白介素-1β(IL-1β)通路在增殖性糖尿病视网膜病变中的作用机制。

方法：收集2015-09/2018-03我院眼科收治的增殖性糖尿病视网膜病变患者49例49眼(研究组)和特发性黄斑裂孔患者41例41眼(对照组)。检测研究组患者视网膜增殖前膜与对照组患者黄斑前膜中NLRP3蛋白表达情况、活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)水平与超氧化物歧化酶(SOD)活性,测定两组患者玻璃体中IL-1β与IL-18浓度。

结果：研究组患者视网膜增殖前膜中NLRP3蛋白阳性表达率明显高于对照组患者黄斑前膜(90% vs 5%,P<0.05),且研究组患者视网膜增殖前膜中ROS与MDA水平明显升高,而SOD活性明显降低。研究组患者玻璃体中IL-1β、IL-18浓度(30.84±7.15、97.61±15.73pg/mL)均明显高于对照组(4.63±0.92、52.07±11.38pg/mL)。

结论：NLRP3与IL-1β在增殖性糖尿病视网膜病变组织中呈高表达,NLRP3/IL-1β通路可上调炎性因子与氧化因子表达水平,促进疾病发展。     

NLRP3炎症复合体与原发性青光眼视神经损伤程度相关性

目的：探讨NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症复合体与原发性开角型青光眼(POAG)视神经损伤程度的相关性。

方法：选取2016-05/2017-05我院收治并确诊的POAG患者65例98眼，纳入同期30例49眼白内障患者为对照组。根据视野平均缺损(MD)分为轻(A组)、中(B组)及重度损伤(C组)3组。ELISA检测血清IL-1β、IL-18浓度； 流式细胞仪检测血液中NLRP3、凋亡相关微粒蛋白(ASC)、胱冬肽酶-1(Caspase-1)阳性巨噬细胞比例。

结果：POAG组IL-1β、IL-18浓度及NLRP3、ASC、Caspase-1阳性细胞比例均高于对照组(P<0.05)。C组IL-1β、IL-18浓度及NLRP3、ASC、Caspase-1阳性细胞比例均显著高于A、B组(P<0.05)。POAG患者血清中IL-1β、IL-18浓度与视野损伤程度呈正相关(r=0.432、0.765)； NLRP3、ASC、Caspase-1的阳性细胞比例与视野损伤程度呈正相关(r=0.517、0.481、0.340)。

结论：血清IL-1β、IL-18浓度及NLRP3、ASC、Caspase-1阳性巨噬细胞比例与POAG患者视神经损伤程度呈正相关。     

胃饥饿素对高糖下人视网膜血管内皮细胞的保护作用及机制

目的：探讨胃饥饿素(ghrelin)对高糖下的人视网膜血管内皮细胞的保护作用及机制。

方法：以人视网膜血管内皮细胞为研究对象,建立高糖损伤模型。胃饥饿素处理细胞后,采用CCK-8试剂盒检测不同浓度胃饥饿素对高糖下细胞增殖的影响,以筛选最佳浓度。将细胞分为正常对照组(NC)、胃饥饿素组(ghrelin)、高糖组(HG)和胃饥饿素+高糖组(ghrelin+HG)。采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,Annexin-APC/7-AAD试剂盒检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的表达。

结果：与NC组(100.00%±0.00%)相比,HG组细胞增殖率(69.87%±0.68%,P<0.05)明显下降。与HG组相比,ghrelin+HG组细胞增殖率(92.31%±3.62%,P<0.05)明显升高。与NC组(4.94%±0.15%)相比,HG组细胞凋亡率(28.33%±1.37%,P<0.05)明显升高。与HG组相比,ghrelin+HG组细胞凋亡率(14.24%±0.32%,P<0.05)明显降低。与NC组相比,HG组细胞表达NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白均明显升高(均P<0.05)。与HG组相比,ghrelin+HG组细胞表达NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白均明显下降(均P<0.05)。

结论：胃饥饿素能对高糖损伤的视网膜血管内皮细胞起到保护作用,可能是通过抑制NLRP3炎症小体信号通路发挥其功能。     

IL-6对体外培养的牛眼小梁细胞中纤维连接蛋白的影响

目的：探讨不同浓度白细胞介素-6(IL-6)刺激下体外培养的牛眼小梁细胞中纤维连接蛋白的表达变化。

方法：采用组织块培养法取新鲜牛眼的小梁网组织,提取并培养第3代牛眼小梁细胞,采用细胞形态学对细胞进行鉴定。经终浓度为0、0.1、0.5、1ng/mL的IL-6药物刺激24h后,采用荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测各浓度IL-6刺激下牛眼小梁细胞中FN mRNA和蛋白的表达。

结果：培养出的牛眼小梁细胞符合第3代牛眼小梁细胞形态特征。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法显示,不同浓度IL-6刺激下的牛眼小梁细胞所产生的FN mRNA量分别为1.000±0.000、0.213±0.004、0.056±0.001、0.019±0.002,FN蛋白表达量分别为1.167±0.012、0.662±0.009、0.238±0.011、0.061±0.011,均呈下调趋势(r_s=-0.713、-0.901,均P<0.05),4组间FN mRNA和蛋白表达均有差异(P<0.05)。

结论：体外培养的牛眼小梁细胞在外源性IL-6刺激下影响FN mRNA和蛋白的表达,且IL-6浓度与蛋白表达呈负相关性,推测IL-6可能通过影响FN基因与蛋白的表达,进而改变小梁网组织结构。     

紫外线B照射在抑制人视网膜色素上皮细胞自噬中的作用

目的　探讨紫外线B(ultraviolet B,UVB)照射在抑制人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19细胞自噬中的作用。方法　不同剂量UVB照射ARPE-19细胞后不同时间收集细胞,应用MTT法检测UVB照射对细胞存活的影响;Western blot检测细胞中自噬蛋白LC3的表达及LC3-II/LC3-I比率、Beclin-1蛋白表达水平;应用细胞自噬增强剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）和细胞自噬抑制剂氯化铵（NH₄Cl）进一步验证UVB照射对于细胞自噬的调节;采用环氧霉素（epoxomicin,EPO）检测泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)对于UVB作用的影响。MTT法检测细胞自噬变化对于细胞生存的影响。结果　UVB照射组诱导细胞剂量依赖性的死亡,100 mJ·cm^-2 UVB照射后24 h细胞出现明显死亡,和对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;200 mJ·cm^-2 UVB照射后24 h和对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01);两种剂量的UVB照射后48 h细胞有一定程度的恢复。和对照组相比,UVB照射组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率和Beclin-1蛋白表达水平均降低（均为P<0.05)。和UVB照射组相比,UVB+RAPA组ARPE-19细胞中明显升高了LC3-II/LC3-I比率,UVB+NH₄Cl组进一步降低了LC3-II/LC3-I比率,RAPA和NH₄Cl在一定程度上恢复了UVB照射降低的Beclin-1蛋白表达水平（均为P<0.05)。和对照组相比,EPO组明显增加了ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率、升高了Beclin-1蛋白表达水平（均为P<0.05)。与UVB照射组相比,UVB+EPO组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率无明显改变(P>0.05),而Beclin-1蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,RAPA组细胞死亡率增多,两组间差异有统计学意义（P<0.05）,NH₄Cl组细胞无明显死亡,与UVB照射组相比,UVB+RAPA组和UVB+NH₄Cl组细胞死亡率均无明显改变（均为P>0.05）。细胞自噬的改变不能逆转UVB诱导的ARPE-19细胞死亡。结论　UVB照射抑制了ARPE-19细胞自噬的启动及自噬流,UPS的改变不影响UVB对于自噬流的抑制。UVB照射可通过减少RPE细胞、损害细胞自噬能力增加RPE细胞变性,增加年龄相关性黄斑变性发生的风险。     

Dickkopf-1调控Wnt通路在缺氧诱导的晶状体上皮细胞转分化中的作用

目的：探讨缺氧条件下Wnt/β-catenin通路在晶状体上皮细胞上皮-间充质转化(EMT)中的作用，分析Dickkopf-1(DKK-1)的表达对晶状体上皮细胞EMT的影响。

方法：将体外培养人晶状体上皮细胞(HLEB3细胞)分为正常氧培养组(加入含10% FBS的DMEM培养液)和缺氧培养组(加入含100μmol/L CoCl₂溶液的培养液进行缺氧处理6、12、24、48h)。利用免疫荧光染色法检测Wnt3a和DKK-1蛋白的表达及β-catenin蛋白的表达和定位； 利用qRT-PCR法检测DKK-1 mRNA的表达。

结果：免疫荧光染色结果显示，随着缺氧时间的延长，HLEB3细胞中Wnt3a和DKK-1蛋白表达水平明显上调，β-catenin蛋白在细胞核内积聚逐渐增多。qRT-PCR检测结果显示，与正常氧培养组相比较，缺氧培养6h组细胞中DKK-1 mRNA无显著差异(P>0.05)，而缺氧培养12、24、48h组细胞中DKK-1 mRNA表达明显增加(P<0.001)。

结论：缺氧可以激活晶状体上皮细胞Wnt/β-catenin通路，并诱导Dickkopf-1的表达，参与调控Wnt/β-catenin通路，影响EMT进程。     

高糖对体外培养视网膜Müller细胞自噬及凋亡的影响

目的：探究高糖诱导体外培养的视网膜Müller细胞自噬及凋亡的变化。方法：实验研究。将体外培养的SD大鼠视网膜Müller细胞根据不同糖浓度分为5.5 mmol/L葡萄糖组（正常组）及20、30、40、 50 mmol/L高糖组,并对40 mmol/L高糖处理Müller细胞组采用不同时间3、6、12、24、36 h进行培 养。使用蛋白免疫印迹法及细胞免疫荧光检测自噬指标LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、自噬信号通路P62、Beclin-1 蛋白表达及细胞定位;使用透射电镜及GFP-LC3慢病毒转染观察自噬小体的形成情况;使用TUNEL 实验检测细胞凋亡状态。不同组别间数据比较采用单因素方差分析。结果：正常组及20、30、40、 50 mmol/L高糖组中Müller细胞质的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相对表达量总体比较,差异均有 统计学意义（F=131.21,P=0.029;F=197.25,P=0.012;F=100.02,P=0.045）,其中与正常组比较各浓 度高糖组Müller细胞质内Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白均明显降低（P<0.05）,P62蛋白相对表达量明显 增加（P<0.001）。正常组以及6、12、24、36 h高糖组中Müller细胞质的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ 蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义（F=98.46,P=0.015;F=109.48,P=0.004;F=99.27, P=0.032）,其中6 h高糖组LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白明显增加（P=0.002、0.015）,12、24、36 h高糖组与正常组相比较LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白均明显下降（P<0.05）,P62蛋白明显增加（P<0.001）。 正常组及6、24 h高糖组视网膜Müller细胞中GFP-LC3转染阳性颗粒、自噬小体相对数量组间总体差 异有统计学意义（F=240.49,P=0.014;F=198.98,P=0.001）,其中与正常组比较,6 h高糖组GFP-LC3 转染阳性颗粒、自噬小体相对数量增加（P=0.002、0.029）,24 h高糖组明显降低（P=0.019、0.036）。 正常组及6、24 h高糖组及3MA组视网膜Müller细胞凋亡指数分别为3.14±1.01、15.34±3.87、 25.82±4.96、24.79±4.01,总体比较差异有统计学意义（F=234.12,P=0.003）,与正常组比较,6、24 h 高糖组TUNEL阳性细胞增多（P=0.022、0.039）,24 h高糖组与6 h高糖组比较TUNEL 阳性细胞进一 步增加（P=0.017）。结论：高糖诱导体外培养的视网膜Müller细胞早期自噬增加,细胞凋亡抑制,随着时间不断延长,高糖抑制自噬形成,增加细胞凋亡。高糖抑制自噬可能是促进Müller细胞凋亡的重要原因。     

左旋肉碱促进碱烧伤后角膜上皮修复的作用及机制

目的：探讨在角膜碱烧伤所致高渗和炎症环境中,左旋肉碱(LC)对角膜上皮修复的作用及其调控的分子机制。

方法：将96只健康C57/6J小鼠随机分为空白对照组、磷酸缓冲盐溶液(PBS)组和LC组,空白对照组不做任何处理、LC组及PBS组制备急性碱烧伤模型。自模型制作前1d,LC组给予60mmol/L LC滴眼液,PBS组给予磷酸缓冲盐溶液连续每天点眼,每天6次。建模后0h,3、7d裂隙灯显微镜下荧光素钠染色观察角膜上皮修复情况。在第3d,取眼球进行冰冻切片免疫荧光检测Ki-67、IL-1β蛋白表达情况; 提取角膜上皮全蛋白进行Western blot检测P63、NLRP3、Caspase-1的表达及STAT3的活化水平。

结果：角膜荧光素钠染色结果显示在碱烧伤后3、7d时PBS组与LC组比,残留角膜上皮缺损面积占原始缺损面积的百分比分别为(29.38±6.83)% vs(17.78±4.11)%、(14.23±4.51)% vs(4.10±2.10)%(P<0.01)。LC组比PBS组角膜上皮修复快。造模后3d,与空白对照组比,碱烧伤处理的各组小鼠角膜上皮中焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1表达上调,P63表达降低,p-STAT3/STAT3水平升高,除cleaved Caspase-1空白对照组vs LC组,差异均有意义。与PBS组比,LC组的NLRP3、pro Caspase-1、cleaved Caspase-1蛋白表达降低,P63表达量上调,p-STAT3/STAT3水平升高,差异均有意义。免疫荧光显示,碱烧伤后3d,PBS组和LC组与空白对照组比IL-1β、Ki-67表达上调。与PBS组比,LC组Ki-67蛋白表达上调,IL-1β表达降低。

结论：LC可通过抑制细胞焦亡信号通路,促进STAT3信号通路的活化,促使小鼠角膜上皮干/祖细胞增生,进而促进碱烧伤后角膜上皮的修复。     

原发性急性闭角型青光眼患者外周血IL-2和IL-6水平与视神经损伤相关性分析

目的：检测原发性急性闭角型青光眼与对照组围手术期外周血IL-2和IL-6水平差异,探讨细胞因子水平与原发性急性闭角型青光眼视神经损伤的相关性。

方法：收集2013-05/2014-10我院眼科住院原发性急性闭角型青光眼患者作为病例组,按视神经损伤程度分为轻、中、重3组。同期住院白内障患者作为对照组,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定研究对象外周血IL-2、IL-6浓度,分别比较病例组、对照组患者间以及不同视野损伤程度三组患者间细胞因子质量浓度的差异,分析原发性急性闭角型青光眼患者机体中细胞因子水平与视神经损伤程度的相关性。

结果：病例组血清中IL-2、IL-6浓度显著低于对照组(P<0.05)。重度视神经损伤组 IL-2、IL-6浓度显著低于轻度视神经损伤组(P<0.05)。视野损伤程度不同的三组IL-2、IL-6水平与视神经损伤严重程度进行多重线性回归分析,IL-2水平差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：原发性急性闭角型青光眼患者机体内IL-2、IL-6水平降低。原发性急性闭角型青光眼患者IL-2水平可能与视神经损伤有关。     

眼表化学伤患者泪液炎症细胞因子浓度与预后的相关分析

目的：探讨眼表化学伤患者泪液中炎症介质TNF-α,IL-1β和IL-6浓度变化与眼表化学伤病情轻重及预后的相关性。

方法：眼表化学伤患者66例80眼,按Roper-Hall标准分度将眼表化学伤分为4度,其中Ⅰ和Ⅱ度35 例44眼,Ⅲ度22 例25眼、Ⅳ度9 例11眼,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定泪液中TNF-α,IL-1β和IL-6的浓度,并以12例健康成年人作为对照。

结果：眼表化学伤组 TNF-α,IL-1β和IL-6水平均高于对照组(P<0.01); 眼表化学伤患者中Ⅳ度组>Ⅲ度组>Ⅰ和Ⅱ度组(P<0.01); Ⅳ度组致盲率高于Ⅲ组和Ⅰ,Ⅱ组(P<0.05)。

结论：眼表化学伤患者TNF-α,IL-1β和IL-6水平明显升高,且随着Roper-Hall标准分度增高而增高。TNF-α,IL-1β和IL-6水平越高,致盲率则越高。炎症细胞因子水平对判断眼表化学伤患者病情严重程度及预后有重要意义。     

[已撤稿]人视网膜色素上皮细胞在缺氧和高糖环境中VEGF165及VEGF165b的表达及意义

目的：研究体外培养的人视网膜色素上皮细胞在人工模拟的缺氧和高糖环境中VEGF₁₆₅ 及VEGF_165b 表达的情况。

方法：正常接种并体外培养人视网膜色素上皮细胞,待细胞稳定生长后以150μmol/L CoCl₂ 和25mmol/L 葡萄糖浓度分别模拟细胞缺氧和高糖环境,将接种细胞分为正常组(5.56mmol/L 葡萄糖)、缺氧组(5.56mmol/L 葡萄糖+150μmol/L CoCl₂)、高糖组(25mmol/L 葡萄糖,不加CoCl₂)、联合组(25mmol/L 葡萄糖+150μmol/L CoCl₂)共四组。每组分别于12、24、36、48h提取RNA。MTT 比色法检测细胞活力及增长趋势; RT-PCR 法检测不同时间点四组RPE 细胞VEGF₁₆₅ mRNA 和VEGF_165b mRNA 的相对表达量。

结果：缺氧和高糖环境下RPE 细胞分裂增殖受限,细胞活力降低。同一组细胞不同时间点比较,正常组VEGF₁₆₅和VEGF_165b随时间变化的表达差异无统计学意义(P >0.05),而缺氧组、高糖组、联合组VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达则随时间变化而变化,差异有统计学意义(P<0.05)。同一时间点各组相互比较,在缺氧模型建立后12h 各组细胞间VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达差异无统计学意义(P >0.05),而24、36、48h 时各组细胞VEGF₁₆₅和VEGF_165b的表达差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：体外培养RPE细胞能够正常表达VEGF_165b,缺氧和高糖是在转录水平诱导VEGF₁₆₅ mRNA的表达上调,同时降低了VEGF_165b mRNA的表达量。     

小干扰RNA沉默 HIF-1α对缺氧状态下脉络膜黑色素瘤细胞中MMP-2 表达的影响

目的：以小干扰RNA沉默人眼脉络膜黑色素瘤细胞中的低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)基因,在缺氧状态下观察其对人眼脉络膜黑色素瘤(human uveal melanoma cell,OCM-1)细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。

方法：将脉络膜黑色素瘤细胞分为正常组与缺氧组,其中将缺氧组再分成单纯缺氧组、干扰组、脂质体对照组、阳性对照组和阴性对照组; 对正常组细胞用含有浓度为10%的胎牛血清和1%的双抗(青-链霉素混合液)的DMEM高糖培养基进行培养。在缺氧组人眼OCM-1细胞的培养瓶中加入100μmol/L CoCl₂以构建肿瘤细胞内部的缺氧微环境。干扰组转染HIF-1α siRNA,阴性对照组转染无义siRNA,阳性对照组转染β-actin siRNA,脂质体对照组转染空脂质体。RT-PCR检测细胞中HIF-1α和MMP-2 mRNA的表达,行Western-blot检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达。

结果：与正常组相比,单纯缺氧组HIF-1α蛋白的表达增高(P<0.05),而其mRNA表达量无明显变化(P>0.05); MMP-2 mRNA及蛋白的表达升高(P<0.05)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(P<0.05),证实转染成功; 干扰组HIF-1αmRNA和MMP-2 mRNA和蛋白表达均下降(P<0.05),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。

结论：缺氧条件下可以提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞中HIF-1α蛋白的表达,而且HIF-1α蛋白的表达水平可以影响MMP-2的转录与翻译,从而可能进一步影响人眼脉络膜瘤细胞的外周浸润和远处转移能力。     

人脐带间充质干细胞源外泌体对高糖环境下RPE细胞自噬和VEGF表达的影响

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUMSC)源外泌体对高糖环境下ARPE-19细胞自噬及VEGF表达情况的影响。方法:原代培养hUMSC,分离纯化hUMSC外泌体,Western blot鉴定hUMSC外泌体标志蛋白CD63表达,透射电镜观察外泌体形态。将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组和外泌体+高糖组(75μg/mL外泌体预处理)。培养48h后,电镜观察三组细胞内自噬体的超微结构,MTT法检测各组细胞增殖情况,Western blot检测各组细胞中自噬标志性蛋白LC3B、Beclin-1及p62的表达,ELISA法检测细胞上清液中VEGF的质量浓度。结果:分离纯化后的外泌体为直径30~100nm的球状膜性囊泡,表达特异性标识蛋白CD63。外泌体+高糖组中自噬体的数量明显少于高糖组。外泌体+高糖组的细胞增殖率较高糖组明显升高(P<0.01)。对照组、高糖组、外泌体+高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和p62值分别为(0.214±0.019、0.461±0.067和0.332±0.079),(0.186±0.029、0.615±0.044和0.464±0.046)和(0.771±0.051、0.364±0.016和0.547±0.039)。高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ值和Beclin-1值均明显高于对照组和外泌体+高糖组(均P<0.05),高糖组细胞中p62值明显低于对照组和外泌体+高糖组(均P<0.01),外泌体+高糖组VEGF的质量浓度较高糖组明显降低(P<0.01)。结论:高糖环境激活ARPE-19细胞自噬,并促进其VEGF的表达。hUMSC外泌体可有效抑制高糖环境下ARPE-19细胞自噬水平,并下调VEGF的表达。     

Caspase-1对氧诱导视网膜病变中小胶质细胞参与视网膜新生血管生成的促进作用及其机制

目的：探讨Caspase-1对小鼠氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)中小胶质细胞参与视网膜新生血管生成的作用及其机制。

方法：随机将12只7日龄(P7)C57BL/6J小鼠分为正常组、OIR组和OIR+VX-765组,正常组在正常氧环境中饲养,其余两组构建OIR模型; P12～P16,OIR+VX-765组和OIR组分别每天腹腔注射Caspase-1抑制剂VX-765(4mg/kg)和等量0.4%聚乙二醇(VX-765溶剂); 于P17制作视网膜铺片行Lectin染色,比较三组间视网膜无血管区和新生血管区面积的大小; 采用免疫荧光染色法观察视网膜组织中Caspase-1的表达和活化小胶质细胞的分布。培养小胶质细胞BV-2细胞分为对照组、缺氧组及抑制剂组,抑制剂组和缺氧组分别经VX-765和0.4%聚乙二醇预处理3h后,缺氧条件下培养24h; 对照组常规培养相同时间。通过Western blot检测Caspase-1、p20(Caspase-1活化形式)、IL-1β和VEGF的蛋白表达变化; 用各组BV-2细胞培养上清液作为条件培养基,刺激培养血管内皮细胞RF/6A,进行管腔形成和细胞迁移实验,并比较各组间的差异。

结果：P17正常组小鼠视网膜血管化完全,未见明显无血管区及视网膜新生血管; OIR组视网膜无血管区和新生血管面积百分比分别为16.58%±1.14%、4.00%±0.41%; OIR+VX-765组两者明显减少,分别为12.23%±1.02%和2.16%±0.52%(P<0.01)。免疫荧光染色结果显示,Caspase-1在正常小鼠视网膜组织中表达较弱,在OIR小鼠中主要在神经节细胞层和内丛状层有明显的阳性表达,并与活化的小胶质细胞有明确的共定位。Western blot检测结果显示,缺氧处理的培养小胶质细胞BV-2中Caspase-1、p20、IL-1β和VEGF蛋白表达明显提高,而Caspase-1抑制剂则可明显下调p20、IL-1β和VEGF的蛋白表达水平(P<0.05)。管腔形成和细胞迁移实验结果显示,RF/6A细胞经缺氧组BV-2培养上清液处理后,管腔形成长度和细胞迁移数目分别为271±12和347±34个,而加入抑制剂后,二者明显减少,分别为171±22和212±27个(P<0.05)。

结论：在小鼠OIR中,Caspase-1能够调节小胶质细胞促进视网膜新生血管的生成,其作用机制可能与Caspase-1活化小胶质细胞中其下游炎性效应分子IL-1β,并释放VEGF相关。