表皮细胞体外去分化模型的建立

目的 探讨表皮细胞体外去分化模型的建立方法.方法 人表皮角质形成细胞(HEK)体外培养至24代,细胞体积膨大,形态发生明显改变.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导48 h后,观察细胞贴壁培养4、12、24、48、72 h时的生长及集落形成情况.以同期培养的表皮细胞作为阴性对照,采用免疫组织化学的方法检测实验组及对照组,β1整合素、CK19、CK14、CK10在表皮细胞中的表达差异;流式细胞仪测定细胞周期的改变.结果 bFGF诱导培养48 h后老化的表皮细胞周围分散出现幼稚型细胞,这些细胞体积小,形态均一,折光性强,核浆比大,并呈克隆样生长.免疫组织化学染色结果显示,bFGF诱导培养后,表皮细胞中CK19、CK14表达增强,而CK10表达减弱.流式结果显示:bFGF诱导培养后,细胞周期中G0/G1的细胞为53.08%,S期细胞为32.71%,G2期细胞为14.21%,而对照组中处于G0/G1、S期及G2期的细胞分别为63.9%、18.98%及17.12%.结论 bFGF能够在体外诱导表皮细胞逆转分化形成幼稚型克隆形成细胞,具体机制需要进一步深入研究.     

GFAP启动子与骨髓基质干细胞神经胶质分化的筛选

目的 研究骨髓基质干细胞体外诱导分化，结合特异性GFAP启动子控制的EGFP的表达来筛选诱导的骨髓基质干细胞。方法 构建报告载体pGFAP-EGFP，原代培养的骨髓基质干细胞，在pME、RA、Iorskolin、bFGF、PDGF-AA、HRG-β等复合物的诱导7d后，pGFAP-GFP载体转染，G418抗生索筛选。荧光显微镜下观察存活细胞体内的EGFP表达情况，流式细胞仪测定荧光细胞的比率。结果 报告载体pGFAP-EGFP构建成功，转染骨髓基质干细胞后部分细胞存活，流式细胞仪测定82．74％的细胞表达EGFP。筛选出的细胞GFAP免疫细胞化学鉴定阳性。体外扩增后可以得到大量的目的细胞。结论 特异性GFAP启动子控制的EGFP的表达可以在体外有效的进行骨髓基质干细胞的筛选和扩增。筛选后的细胞具有胶质细胞表型，可提供足够的胶质细胞进行神经系统的细胞替代治疗。     

热损伤与碱性成纤维细胞生长因子联合处理诱导表皮细胞去分化的实验研究

目的：体外建立表皮细胞去分化模型,为深入阐明表皮细胞去分化过程奠定基础。方法：离体条件下选择热损伤与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为联合诱导因素处理成熟表皮细胞。通过Giemsa染色和电镜观察细胞形态的改变;通过细胞培养和滋养层培养体系观察细胞的增殖能力,包括克隆形成和复层生长情况;采用器官培养体系体外构建三维皮肤,观察细胞再分化形成表皮情况;应用基因芯片技术观察细胞基因表达的改变。结果：经联合诱导后,细胞形态发生改变,表现为体积减小,细胞器数目减少,核浆比增大。增殖和再分化能力的改变体现在诱导后的表皮细胞能形成克隆,在滋养层培养条件下可以形成复层生长,并能够在体外构建出包括基底层和基底上层在内的表皮结构。基因水平的改变表现为与角质化相关基因下调和与有丝分裂相关基因上调。结论：在热损伤与bFGF联合诱导下,已分化的表皮细胞会发生形态、功能和基因表达的改变,表现为干细胞的特性。     

不同培养条件对人脂肪源性干细胞生长状态的影响

目的 观察不同培养条件对人脂肪源性干细胞(hADSCs)体外生长状态的影响.方法 取腹部手术患者皮下脂肪组织,用0.1％的Ⅰ型胶原酶消化法分离出hADSCs,将获得的细胞分别在以下3组培养条件下培养:高糖DMEM培养基、高糖DMEM培养基+碱性成纤维生长因子(bFGF)、间充质干细胞培养基(MSCM).取第2代或者第3代细胞进行以下实验:细胞免疫荧光及流式细胞仪行细胞表面标志物CD31、CD34和Stro-1鉴定;绘制细胞生长曲线观察3组细胞的生长状态;采用不同的培养条件对3组细胞进行体外培养,观察细胞的增殖.结果 通过胶原酶消化法可成功地分离出hADSCs.流式细胞仪检测DMEM组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为0.9％、2.9％、56.7％;DMEM+ bFGF组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为1.3％、2.5％、73.5％;MSCM组CD31、CD34、Stro-1阳性率分别为0.7％、2.4％、84.5％.采用不同的培养条件对hADSCs进行培养,DMEM组、DMEM+ bFGF组、MSCM组细胞的倍增时间分别为93.7、64.5、49.1h,差异有统计学意义(p＜0.01).此外,各组中所培养的细胞在MSCM和高糖DMEM+ bFGF的培养条件下的增殖速率明显高于高糖DMEM培养条件(P＜0.05).结论 采用MSCM培养hADSCs可以在短期内获得大量细胞,在传统的高糖DMEM培养基中加入bFGF后也可以获得相似的效果,可以满足组织工程研究的种子细胞数量的要求.     

血小板裂解物支持人骨髓基质细胞的扩增

目的探讨血小板裂解物体外培养、扩增人骨髓基质干细胞的可行性。方法将富含血小板血浆以冻融裂解法处理,培养人骨髓基质干细胞;体系中加入不同浓度的裂解物,MTT法检测细胞体外增殖情况;流式细胞仪分析细胞表型特征,并应用细胞化学染色法观察细胞体外成骨和成脂肪能力。结果血小板裂解物培养的骨髓基质干细胞呈典型的成纤维细胞形态,均一呈现CD14、CD31、CD34、CD45及HLA-DR阴性和CD73、CD90、CD105、CD166阳性,具备体外成骨、成脂分化能力。此外,与经筛选的胎牛血清比较,低浓度血小板裂解物即具有支持骨髓基质干细胞扩增的能力。结论血小板裂解物可替代胎牛血清,用于骨髓基质干细胞的体外扩增。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠胎肝干细胞培养的优化作用

：目的 观察以重组腺相关病毒（rAAV）为载体介导碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因转染对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响.方法 体外培养鼠胎肝干细胞,经rAAV作为载体介导bFGF基因转染,分为对照组、空载病毒转染组和bFGF转染组.用逆转录PCR和蛋白质印迹法检测鼠胎肝干细胞转染前、后bFGF基因和蛋白的表达.应用细胞生长曲线和CCK-8法观察细胞生长速度;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化.结果 转染bFGF后,bFGF转染组与对照组、空载病毒转染组相比,bFGF基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度增快（q=20.43,P=0.001;q=26.52,P=0.001）,G0/G1期细胞减少,S期细胞增多（q=72.56,P=0.000;q=32.28,P=0.001）.结论 通过rAAV作为载体介导bFGF基因转染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用.     

人表皮干细胞的体外分离和培养

目的:建立人表皮干细胞的体外分离和培养体系的方法,探索表皮干细胞体外大量扩增的途径.方法:采用0.375%的DispaseⅡ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,采用MTF法筛选表皮细胞基础培养基和表皮细胞生长因子(epidermal growthfactor,EGF)的最适浓度,建立表皮干细胞培养的干预体系.逐日观察培养的细胞呈表皮干细胞样的形态,免疫组化方法检测β1整合素和角蛋白19的表达.结果:以表皮细胞数量和活性作指标,不同浓度EGF干预条件细胞活性不同,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液为最适培养液,可使细胞呈表皮干细胞克隆样生长,β1整合素和角蛋白19表皮干细胞活性表达呈阳性.结论:采用0.375%的Dispase Ⅱ和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,以15 ng/mL EGF的无血清SFM培养液培养,此方法是一种简便、快速、经济的表皮干细胞分离和培养的方法.     

成体神经干细胞培养方法的建立

目的 探讨体外建立培养成体神经干细胞(MSC)的方法.方法 从6周龄大鼠脑组织中分离神经干细胞,用神经干细胞培养液[DMEM/F12培养液添加1%N2、2%B27、20 μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]使其稳定增殖,10%胎牛血清诱导其贴壁分化.倒置显微镜下观察神经干细胞形态学变化;流式细胞仪检测神经干细胞表面标记物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇酶(NSE,成熟神经元的特异性标志)、半乳糖脑苷脂(Galc-C,成熟少突胶质细胞的标记物)的表达.结果 分离所得细胞能在体外传代培养,流式细胞仪检测显示Nestin阳性细胞为97.6%,细胞经胎牛血清诱导分化后能形成NSE、Galc-C阳性细胞.结论 采用无血清的神经干细胞培养液能培养出具有分化潜能的成体神经干细胞.     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论:运用Ⅳ型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。     

人表皮干细胞的体外分离与培养

目的 探索人表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）的分离方法和培养体系。方法 用Ⅳ型胶原纯化、富集ESCs，将黏附细胞（实验组）和未黏附细胞（对照组）分别接种在Ⅳ型胶原摹质（实验组为A1，对照组为A2）和3T3细胞滋养层（实验照组为B1，对照组为B2），培养体系为：低糖无钙DMEM培养基（添加10％胎牛血清、表皮生长因子10μg／L、氯化钙0．05mmol／L、氢化可的松0．8mg／L），观察细胞能否呈克隆状生长，用流式细胞仪和免疫细胞化学染色，对ECSs周期和表型进行分析。结果 实验组细胞呈克隆状生长，G0／G1期细胞和α6^briCD71 dim细胞百分率明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），实验组角蛋白19免疫细胞化学染色呈阳性，对照组呈刚性。结论 人ESCs可通过Ⅳ型胶原快速黏附分选，并可在适当的培养体系里扩增。     

Feasibility of using early mesencephalic neural plate for intracerebral grafting

The purpose of this study was to elucidate the biological significance and the possibility of intracerebral grafting of neuroepithelial stem cells derived from the mesencephalic neural plate. Immunohistological studies of embryonic day 10.5 (E10.5) Wister rats revealed strong nestin expression in the mesencephalic part of the neural plate. Mesencephalic neural plates removed from E10.5 rats were processed to either tissue or cell dissociation culture. They were cultured in vitro under various conditions and were analyzed 7 days after the primary culture. When they were cultured as a tissue, cell proliferation and differentiation into neurons extending long neurites were obvious in a serum-free medium, in a medium containing 3% serum, and in a medium containing 20 ng/ml epidermal growth factor. On the other hand, in a medium containing 10 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF), both vigorous cell proliferation and sphere formation were recognized. Furthermore, marked neurite growth was rarely seen in this culture. When they were plated in a dissociation culture, cell proliferation and neurosphere generation were also recognized only in a medium containing bFGF, depending on the initial cell concentration. The spheres, generated 7 days after the primary cell culture, were positively stained by nestin. These data suggested that bFGF was able to amplify the stem cell population present in the mesencephalic neural plate derived from early embryos. This might make it possible to obtain a large number of stem cells as donor material for neural transplantation on demand.     

诱导成鼠骨髓源神经干细胞的实验研究

目的：探讨体外诱导成鼠骨髓源神经干细胞的可行性。方法：以含20ng／ml碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)与表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的无血清培养液培养成鼠骨髓细胞，待细胞球形成后进行传代培养与单细胞克隆试验．以含100ng／ml bFGF培养液诱导分化，细胞免疫组化染色进行细胞鉴定。结果：骨髓细胞在诱导条件下形成表达Nestin抗原的细胞球．亦表达造血干细胞标志性抗原CD90。分离成单细胞后很快形成新的细胞球，并可分化出神经元与胶质细胞。结论：骨髓细胞可在体外诱导为能自我增殖的神经干细胞。     

两种细胞因子联合应用对骨髓基质干细胞增殖和成骨活性的影响

目的 研究骨形态发生蛋白融合基因-4/7(BMP-4/7)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合应用对体外培养兔骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖和成骨活性的影响.方法 体外培养BMSCs,在第3代细胞培养液中加入不同浓度的BMP-4/7和bFGF,依据加入不同基因浓度组合的不同分为5个实验组(A组:80 ng/mL BMP-4/7,B组:80 ng/mL bFGF,C组:30 ng/mL BMP-4/7+30ng/mL bFGF,D组:50 ng/mL BMP-4/7+50 ng/mL bFGF,E组:80 ng/mL BMP-4/7+80 ng/mL bFGF)和对照组(不加任何因子),采用绘制生长曲线,甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测细胞增殖活力,碱性磷酸酶(ALP)和降钙素(OC)活性检测法比较各组间差异,观察不同浓度的BMP-4/7和bFGF联合应用对兔BMSCs增殖和成骨活性的影响. 结果 传代后第5天对照组个别单核细胞贴壁,呈长梭形;A组细胞增殖,呈旋涡状排列;B组细胞较为密集,部分融合成片;C组细胞呈集落式生长,生长旺盛;D组细胞生长密集,可见明显的钙结节;E组细胞密集,可见细胞性钙结节形成.各组OD值、ALP含量、OC含量随着作用时间的延长而增加,各组不同培养时间的OD值差异均有统计学意义(P<0.01);且C、D、E组均高于A、B组,差异均有统计学意义(P<0.05).C、D、E组内随着作用浓度的增加,细胞增殖及成骨活性增强,呈浓度依赖关系,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 合理的联合应用BMP-4/7和bFGF可促进BMSCs细胞增殖,促进成骨活性,两者对BMSCs有明显的协同增强效应.     

碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对骨骼肌源性干细胞的促增殖效应

目的观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）单独及联合应用对骨骼肌源性干细胞（muscle derived stem cells，MDSCs）生长的影响。方法取出生24h内的昆明小鼠15只，采用连续预贴壁法从小鼠后肢肌分离培养MDSCs，用含2％胎牛血清的DMEM培养基促进其向骨骼肌细胞分化。取原代MDSCs及MDSCs分化细胞，采用免疫细胞化学染色检测干细胞标志Sca-1和骨骼肌细胞标志α-Sarcomeric肌动蛋白的表达。HE染色观察细胞肌管形成。MTT比色法检测不同浓度（6．25、12．50、25．00、50．00、100．00ng／ml）的bFGF和EGF单独应用96h对MDSCs增殖的影响以及二者（100．00ng／ml）联合作用24、48、72和96h对MDSCs增殖的影响。结果从新生小鼠后肢肌成功分离培养MDSCs，免疫细胞化学染色90％以上的MDSCs呈Sca-1阳性，分化形成的肌管呈α—Sarcomeric肌动蛋白阳性。HE染色可见肌管形成。bFGF、EGF对MDSCs的促增殖效应随浓度的增加而增加。与阴性对照组比较，bFGF于12．50ng／ml出现促增殖效应（P〈0．05）；25．00ng／ml组与12．50ng／ml组比较，作用提高（P〈0．01）；50．00、100．00ng／ml组较25．00ng／ml组无明显提升（P〉0．05）；EGF的作用与bFGF类似，但于50．00ng／ml时趋于饱和。与阴性对照组比较，EGF于72h、bFGF于96h表现促增殖效应（P〈0．01），而二者联合应用于24h即表现促增殖效应（P〈0．01），并于48、72和96h增殖效应均较单独应用显著提高（P〈0．05）。结论bFGF和EGF都能促进MDSCs的增殖，联合作用更快、更强。     

成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及复合因子对兔ACL、MCL体外增殖作用

目的观察酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor，aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)以及复合因子对兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)和内侧副韧带(medial collateral ligament，MCL)的促增殖作用。方法分离传代培养10周龄新西兰大白兔骨关节韧带的ACL和MCL的成纤维细胞，接种96孔板，并加入浓度为0(对照组)、1、5、10、50、100ng／ml的aFGF或bFGF，浓度为0(对照组)、1．56、3．13、6．25、12．50、25、50ng／ml的EGF，单独或aFGF EGF两种因子联用与细胞(n=4)共同培养48h，以XTT方法测定其促细胞增殖作用。结果3种生长因子单独应用对ACL和MCL都有促进作用，aFGF对两种细胞均存在量效关系；bFGF 1ng／ml，EGF 5ng／ml对ACL作用最好，而对MCL则是bFGF和EGF均存在量效关系。浓度为5ng／ml的aFGF与50ng／ml的EGF联合1ng／ml aFGF与3．13ng／mlEGF作用于ACL或MCL均有协同作用。结论3种生长因子对ACL和MCL均有促进作用，单独应用aFGF或联用EGF优于单一因子促进兔ACL和MCL细胞的增殖，并且提示低浓度的aFGF联用EGF优于单一生长因子。     

诱导表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究

目的通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源。方法分别收集正常皮肤表皮细胞．利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF（50～1000ng／mL）作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型（NHE-1,NKCC-1）流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性。结果50ng／mL和100ng／mL EGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异（P〉0．05）：500ng／mL和1000ng／mL EGF抑制细胞增殖。1000ng／mL EGF对细胞增殖的抑制作用更明显（P〈0．05）。表皮干细胞经过50ng／mLEGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1。结论表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。50ng／ml EGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件。     

bFGF对体外关节软骨细胞创伤愈合与增殖的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ｂＦＧＦ）对关节软骨细胞创伤愈合与增殖行为的影响。方法;采用体外创伤愈合模型及ＭＴＴ比色方法,对软骨细胞创伤愈合与增殖行为进行分析。结果：ｂＦＧＦ浓度为５ｎｇ／ｍｌ时,即可显著促进软骨细胞创伤愈合,浓度为５０ｎｇ／ｍｌ时,其促进作用达到最大值。     

透明质酸联合碱性成纤维细胞生长因子对韧带细胞增殖的影响

目的 观察透明质酸（HA）和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF）对内侧副韧带和前十字韧带细胞增殖行为的影响。方法 培养成年新西兰白兔内侧副韧带和前十字韧带细胞,在培养淮中分别加入HA、bFGF或两者的合物,以MTT方法测定细胞的增殖行为。结果 单独使用HA对前十字韧带细胞的增殖作用不明显,对内侧副韧带细胞的增殖有一定的促进作用。bFGF在1ng/ml时即对两种细胞显著的促增殖作用,其浓度达50ng/ml时,促进作用最大。100μg/mlHA与100ng/ml bFGF联合使用时,对两种细胞增殖的促进作用较单独使用HA或bFGF强。结论 HA可以作为bFGF的载体联合使用以促进韧带创伤愈合。