siRNA干扰对NIT-1细胞株G蛋白偶联受体40表达的影响

目的 利用siRNA技术抑制G蛋白偶联受体40（GPR40）在小鼠胰岛NIT-1细胞中的表达。方法 化学合成3对GPR40 siRNA 和1对FITC标记GAPDH siRNA, siPORT NeoFX 转染试剂介导siRNA转染到NIT-1细胞中,通过转染FITC标记GAPDH siRNA以优化转染条件,在优化条件下转染三对GPR40 siRNA, 分别于转染24、48和72 h后利用RT-PCR和western blotting 检测GPR40 mRNA和蛋白表达抑制率。 结果 根据优化的转染条件转染三对GPR40 siRNA, 三对siRNA均能有效降解GPR40的mRNA并进一步抑制其蛋白表达,这一作用持续72 h以上,其中siRNA1表现了最高的抑制效率。 结论GPR40 siRNA可高效、特异地抑制NIT-1细胞GPR40表达。     

siRNA干扰对NIT-1细胞株G蛋白耦联受体40表达的影响

目的 利用siRNA技术抑制G蛋白耦联受体40(GPR40)在小鼠胰岛NIT-1细胞中的表达.方法 化学合成3对GPR40 siRNA和1对FITC标记GAPDH siRNA,siPORT NeoFX转染试剂介导siRNA转染到NIT-1细胞中,通过转染FITC标记GAPDH siRNA以优化转染条件,在优化条件下转染三对GPR40 siRNA,分别于转染24、48、72 h后利用RT-PCR和western blotting检测GPR40 mRNA和蛋白表达抑制率.结果 根据优化的转染条件转染三对GPR40 siRNA,三对siRNA均能有效降解GPR40的mRNA并进一步抑制其蛋白表达,这一作用持续72 h以上,其中siRNA1表现了最高的抑制效率.结论 GPR40 siRNA可高效、特异地抑制NIT-1细胞GPR40表达.     

Ras/Raf/ERK信号通路与肝脏疾病

蛋白质的磷酸化与去磷酸化作为传递外界各种信息的信号传导机制,在细胞的生物学活动中发挥重要作用.一系列的蛋白激酶(PK)及其磷酸化构成了信号传导的级联反应.丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内一类丝氨酸/苏氨酸PK,存在于真核生物的大多数细胞内.目前真核细胞内已确定出四条MAPK传导通路,即细胞外信号调节激酶(ERK)通路、c-jun通路、P38通路及ERK5通路[1].其中Ras/Raf/ERK通路是迄今研究得最为活跃信号通路之一,该通路参与了细胞生长、发育、增殖、分化以及细胞间的功能同步和细胞恶性转化等多种生理、病理过程.     

MAPK 信号通路与非酒精性脂肪肝关系的研究进展

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen －activated protein kinase, MAPK）信号通路是哺乳动物体内广泛存在的信号通路,主要调节细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、坏死等多种生理病理过程,包括 ERK1／2、P38MAPK、JNK 与 ERK54条信号通路,有研究发现 MAPK 信号通路参与了非酒精性脂肪肝（non －alco－holic fatty liver disease,NAFLD）的发生发展过程,本文就近年来 MAPK 信号通路与 NAFLD 形成关系的研究作一综述。     

细胞外信号调节激酶1/2信号转导通路与细胞凋亡的研究进展

细胞外信号调节激酶1/2(extracellular-signa1regulated kinase,ERK1/2)是广泛存在于真核细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成员.从信号转导角度看,活化后的ERK1/2作用于胞浆或胞核内的底物蛋白,引起特定蛋白的表达或活化,调控细胞的增殖、分化、凋亡等.目前关于ERK1/2信号通路在神经细胞凋亡的研究尚处在起步阶段.本文对ERK1/2信号转导通路在细胞凋亡中的作用机制进行综述.     

Ras／Raf／ERK信号通路与肝脏疾病

蛋白质的磷酸化与去磷酸化作为传递外界各种信息的信号传导机制，在细胞的生物学活动中发挥重要作用。一系列的蛋白激酶(PK)及其磷酸化构成了信号传导的级联反应。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内一类丝氨酸／苏氨酸PK，存在于真核生物的大多数细胞内。目前真核细胞内已确定出四条MAPK传导通路，即细胞外信号调节激酶(ERK)通路。     

细胞外信号调节激酶(ERK)与宫颈癌关系的研究进展

细胞外信号调节激酶(ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员之一,ERK家族有5个亚族,包括ERK1-ERK5。其中ERK1和ERK2是MAPK/ERK通路中的两个重要成员;参与调节细胞的生长、发育、分化、分裂、死亡等多种生理过程,并在细胞的恶性转化中起重要作用。由ERK介导的信号转导通路接受来自细胞内外的各种丝裂原刺激和应激,激活ERK底物,通过调控细胞周期,抑制细胞凋亡。促进细胞增殖、迁移和侵袭等与肿瘤的发生发展密切相关。ERK在肿瘤发生发展和防治中的重要作用,是目前肿瘤研究的重要热点。本文就ERK信号通路与子宫颈癌的关系,以及ERK通路抑制剂在肿瘤防治方面的临床应用前景进行综述。     

细胞外信号调节激酶1/2在心血管系统疾病中的作用

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路是细胞内的重要信息传递系统,细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)作为MAPK家族的重要组成部分,是将信号从细胞表面受体转导至细胞核的关键。ERK1/2磷酸化参与了心肌细胞肥厚、凋亡的过程以及血管平滑肌细胞增殖等多种生物学反应。然而,对于ERK1/2在心血管系统疾病发生、发展过程中所起的作用仍有争议,且未阐明在具体的病理生理过程中其上游激活物及下游作用靶点。     

丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在金黄色葡萄球菌α-毒素所致人外周血单核细胞凋亡中的作用

目的研究丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在金黄色葡萄球菌α-毒素所致人外周血单核细胞凋亡中的作用。方法以Annexin V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染流式细胞仪检测人外周血单核细胞的凋亡率,以Western blot法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及c-Jun N末端激酶(JNK)等蛋白的表达。结果随着α-毒素作用时间的延长,磷酸化-p38 MAPK和JNK1/2等蛋白的表达逐渐增高,而磷酸化-ERK1/2蛋白的表达不变。用SB203580和SP600125阻断p38 MAPK和JNK1/2后,单核细胞凋亡率明显降低,分别为(17.7±1.8)%和(15.3±1.6)%,与感染60 min时(35.7±3.6)%比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MAPK信号通路的成员p38 MAPK和JNK1/2在金黄色葡萄球菌的致病过程中起重要作用。     

阻断MAPK通路对前列腺癌细胞增殖的影响

目的：研究前列腺癌进展中细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的变化，探讨阻断此通路对前列腺癌细胞增殖的影响。方法：用MTT法检测表皮生长因子（EGF）、PD98059对前列腺癌细胞系LNCaP、PC 3和DU145增殖的影响；用Western blot法检测细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）表达和磷酸化ERK1/2水平的差异，以及EGF、PD98059对细胞ERK1/2磷酸化水平的影响。结果：EGF促进LNCaP、PC 3和 DU145的增殖，PD98059抑制细胞增殖；Western blot结果显示，3株前列腺癌细胞的总ERK1/2无明显差异。在血清饥饿的状态下，LNCaP细胞无ERK1/2的活化,而PC 3和 DU145细胞ERK1/2处于持续活化的状态。PD98059能够阻断EGF对3株前列腺癌细胞ERK1/2的激活。结论：MAPK通路的持续活化在前列腺癌的恶性进展中起重要作用，阻断此通路可以抑制前列腺癌细胞的增殖。     

Expression of EPO Receptor in Pancreatic Cells and Its Effect on Cell Apoptosis

In order to explore the expression of erythropoietin receptor （EPOR） in pancreatic cell line NIT-1 and its effect on cell apoptosis after binding with erythropoietin （EPO）, NIT-1 cells were cultured and expanded. The expression of EPOR was detected using electrophoresis. NIT-1 apoptosis was induced by cytokines and their effects on cell apoptosis and cell insulin secretion were assayed after binding of EPO to EPOR. The results showed that EPOR was expressed in NIT-1 cells. Recombinant human EPO （rHuEPO） had no effect on cell apoptosis but significantly inhibited apoptosis induced by cytokines, rHuEPO had no effect on cell insulin secretion but significantly improved insulin secretion inhibited by cytokines. From these findings, it was concluded that EPOR was expressed in NIT- 1 cells and EPO could protect NIT- 1 cells from apoptosis induced by cytokines.     

JNK信号通路对胰岛βTc3细胞脂性凋亡的影响及吡格列酮的干预作用

目的：探讨c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路对胰岛βTc3细胞脂性凋亡的影响及吡格列酮（PGZ）的干预作用.方法：采用游离脂肪酸（FFA）诱导小鼠βTc3细胞凋亡;以MTT法观察FFA对细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞化学和Western Blot法检测在FFA、特异性JNK抑制剂SP600125及PGZ作用下磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化c-jun（p-c-jun）的表达.结果：FFA对体外生长的βTc3细胞具有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,JNK阻断剂及PGZ可显著减少这一过程引起的凋亡;且FFA诱导βTc3细胞凋亡伴随着JNK信号通路中p-JNK和p-c-jun的升高;用SP600125预处理细胞后,可明显减少p-JNK和p-c-jun的活化;而PGZ未能抑制FFA引起的JNK活化.结论：JNK信号通路参与了FFA诱导的小鼠βTc3细胞凋亡;PGZ可明显抑制胰岛βTc3细胞凋亡,但这一过程可能没有通过JNK信号通路.     

苯丙酸诺龙对胰岛NIT-1细胞Nampt表达和胰岛素分泌的影响

目的：观察雄性激素苯丙酸诺龙(BPN)干预下胰岛NIT-1细胞中烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）和胰岛十二指肠同源盒-1（PDX-1）蛋白表达、细胞周期和胰岛素分泌的变化,探讨高浓度葡萄糖氧化应激状态下BPN对NIT-1细胞Nampt表达和胰岛素信号分子的影响。方法：应用4种不同浓度（5.6、11.1、16.7和27.6mmol•L^-1）葡萄糖培养NIT-1细胞,以10 mg•L^-1 BPN干预NIT-1细胞48 h,以未加BPN处理的相应浓度葡萄糖为对照组。应用Western blotting法检测各组细胞中Nampt、IRS-2 和 PDX-1蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞周期;放射免疫法测定细胞胰岛素分泌水平。结果：与相应浓度葡萄糖对照组比较,各BPN处理组NIT-1细胞中Nampt、ISR-2和PDX-1蛋白表达水平增加（P<0.05或P<0.01）;与相应对照组比较,在低糖（5.6 mmol•L^-1）时,BPN能够明显解除细胞G0/G1期阻滞（P<0.01）,在高糖（27.6 mmol•L^-1）时,能够解除细胞的G2/M阻滞（P<0.01）;除正常葡萄糖浓度11.1mmol•L^-1组之外,各处理组细胞的胰岛素分泌水平均明显增加（P<0.01）。结论：BPN能够增加胰岛NIT-1细胞中Nampt、ISR-2和PDX-1蛋白表达水平,NIT-1细胞中Nampt表达与胰岛素信号传导途径的相关分子间可能存在密切关联,雄性激素在一定条件下能够改善胰岛细胞的胰岛素抵抗状态。     

葡萄糖对胰岛β细胞CD36表达的影响

目的：观察不同浓度的葡萄糖对胰岛β细胞脂质含量以及脂肪酸转位酶（CD36）表达的影响。方法：分别以5、10、15、20、253、0 mmol/L葡萄糖孵育胰岛β细胞24 h后,测定细胞内甘油三脂（TG）含量及CD36基因表达。结果：（1）在高糖环境下,细胞内TG含量呈浓度依赖性增加。（2）高糖对CD36的基因表达亦有明显的浓度依赖性。结论：高糖对胰岛β细胞CD36表达的影响可能在脂质异位沉积和脂毒性中有着重要的意义。     

siR N A 干扰 A T1 R 基因调控链脲佐菌素诱导NIT －1细胞凋亡的实验研究

目的：用siRNA干扰技术沉默小鼠胰岛素瘤NIT－1细胞血管紧张素Ⅱ1型受体（ AT1R）基因,探讨其对链脲佐菌素（STZ）诱导的胰岛素瘤细胞凋亡的影响。方法针对小鼠AT1R基因,设计并合成3对siRNA序列,脂质体法转染至NIT－1细胞,荧光显微镜观察荧光强度检测转染效率,Real－time PCR检测AT1R mRNA表达量判断不同干扰序列及干扰时间的基因沉默效果;分4组：空白组不予任何干预,STZ组予5 mmoL／L STZ干预30 min,si－AT1R组予40 nmol／L si－AT1R转染24 h,si－AT1R＋STZ组予40 nmoL／L si－AT1R转染24 h后5 mmoL／L STZ干预30 min;Real－time PCR检测Caspase－3 mRNA表达量,Hoechst33342染色荧光显微镜和Annex-in V－FITC／PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果40 nmol／L siRNA转染的荧光强度最强,转染后AT1R mRNA表达量明显下降,si－AT1R－2转染24 h的沉默效果最佳（92.20％）;Caspase－3 mRNA表达量：STZ组与空白组比增加了2.37倍（P＜0.05）,si－AT1R＋STZ组与STZ组比减少了11.28％,但差异无统计学意义;细胞凋亡率：STZ组与空白组比增加了3.27倍（P＜0.05）,si－AT1R＋STZ组与STZ组比减少了26.82％（P＜0.05）。结论本研究建立了稳定的胰岛细胞AT1R基因沉默模型;RNA干扰沉默胰岛细胞AT1R基因可通过下调Caspase－3 mRNA表达量降低STZ诱导的细胞凋亡率,提示AT1R介导了STZ诱导的胰岛细胞凋亡过程。     

GPR40 shRNA表达载体构建及其稳定转染βTC6细胞系的建立

目的构建G蛋白偶联受体40（Gprotein coupled receptor 40,GPR40）shRNA表达载体质粒,获得干扰质粒稳定转染的小鼠βTC6细胞系。方法将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pSilencer4.1-CMVneo表达载体,并测序鉴定。脂质体法把重组质粒转染至βTC6细胞,通过G418筛选建立稳定转染的βTC6细胞系,采用蛋白印迹（Western blotting）技术检测GPR40蛋白表达。结果构建了GPR40 shRNA重组真核表达载体,并成功地下调了βTC6细胞的GPR40表达。结论成功构建了GPR40 shRNA真核表达载体,获得稳定表达GPR40 shRNA的βTC6细胞系。     

Lipopolysaccharide-enhanced early proliferation of insulin secreting NIT-1 cell is associated with nuclear factor-kappaB- mediated inhibition of caspase 3 cleavage

Background  Increased levels of plasma lipopolysaccharide (LPS) have been found in obesity and diabetes patients. This study was to investigate the effect of LPS on pancreatic beta-cell viability and the involvement of caspase 3 in NIT-1 cell line.

Methods  Mouse insulinoma NIT-1 cells were treated with LPS for the indicated time and dose. Cell viability was measured by cell counting kit-8 reagent. Toll-like receptor 4 (TLR4), caspase 3 and cleaved caspase 3 were detected by Western blotting. Insulin was determined by radioimmunoassay (RIA).

Results  LPS promoted NIT-1 cell proliferation at 1 µg/ml, peaked at 72 hours of incubation. A reduction in cleavage of caspase 3 was observed upon LPS treatment. Bay11-7082, a specific inhibitor of nuclear factor (NF)-κB, blunted LPS-induced inhibition of caspase 3 cleavage. Reduction in chronic insulin secretion was observed after treatment with LPS at 1 µg/ml for 48 and 72 hours, not for 24 hours. TLR4 protein was upregulated when NIT-1 cells were treated with LPS at 1 µg/ml for 24 hours.

Conclusions  LPS promotes early NIT-1 cell proliferation in association with NF-κB-mediated inhibition of caspase 3 cleavage. LPS exerts a time-dependent inhibitory effect on chronic insulin secretion from NIT-1 cells.

     

环孢霉素A抑制NIT-1胰岛β细胞胰岛素释放并下调线粒体氧化磷酸化酶系基因的表达

目的 研究免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)对NIT-1胰岛β细胞胰岛素分泌的影响及在基因水平上对线粒体氧化磷酸化水平的影响。方法 体外培养NIT-1胰岛β细胞，用10μmol／LCsA处理24和48h。放射免疫测定法(RIA)检测胰岛素释放，半定量RT-PCR检测CsA处理NIT-1胰岛β细胞后线粒体氧化磷酸化酶系中的几种主要成员(Nuox23、Cox7c和Atp5K)在mRNA水平上的表达。结果 CsA处理24和48h可显著抑制胰岛素的释放并下调Nuox23、Cox7c和Atp5K基因mRNA表达。结论 CsA下调线粒体氧化磷酸化酶系基因的表达可能是其降低ATP合成引起胰岛素释放下降的机制之一。     

Detrimental effects of homocysteine on insulin release and apoptosis of pancreatic beta cells

OBJECTIVE: To study the effects of homocysteine (Hcy) on the insulin secretion and apoptosis of pancreatic beta cells. METHODS: Clonal mouse pancreatic beta cells of the line NIT-1 were cultured and exposed to Hcy of 50, 100, 250, 500 and 1000 micromol/L for 6, 12, 24, and 48 hours respectively, then glucose of the concentrations of 5.6 mmol/L or 16.7 mmol/L was added for 1 h, and then the insulin concentration in the culture medium was determined by radioimmunoassay, and MTT method was used to detect the survival rate of the cells. NIT-1 cells were exposed to Hcy of the concentrations of 0, 50, 100, 250, 500 and 1000 micromol/L respectively for 24 h, another NIT-1 cells were exposed to Hcy of the final concentration of 250 micromol/L for 0, 6, 12, and 48 h respectively, then flow cytometry (FC) was used to detect the apoptosis of the cells. After exposure to Hcy of the concentrations of 50, 100, 250, 500 and 1000 micromol/L for 72 h DNA agarose gel electrophoresis was performed. RESULTS: Hcy inhibited the basal and glucose-induced insulin secretion in a time- and dose-dependent manner. The insulin secretion amounts of the NIT-1 cells after exposure to 50 micromol/L Hcy for 24 hours and to 100 micromol/L Hcy for 12 hours were significantly lower by 17.1% and 10.8% compared with the control group (all P < 0.01). Incubated with 100 micromol/L Hcy for 12 hours and 24 hours respectively, the survival rates of the NIT-1 cells were 94.56% and 87.93% respectively (P < 0.05, P < 0.01). Incubated with 100 micromol/L Hcy for 24 hours, the apoptosis rate of the NIT-1 cells was 7.21% (P < 0.01); and incubated with 250 micromol/L Hcy for 12 hours, the apoptosis rate of the NIT-1 cells was 12.93% (P < 0.01). Both FC and agarose gel electrophoresis indicated that Hcy induced cell apoptosis time- and concentration-dependently. CONCLUSION: Hcy impairs insulin secretion and induces cell apoptosis of pancreatic beta cells time- and concentration-dependently.