骨髓基质细胞体外分化移植治疗大鼠脊髓损伤的初步研究

[目的]探讨大鼠骨髓基质细胞体外分化为神经干细胞后移植治疗大鼠脊髓损伤的可行性。[方法]骨髓基质细胞经培养及定向分化为神经干细胞，后者由5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记，制备大鼠脊髓损伤模型，伤后第9d移植神经干细胞，实验分组：细胞移植组、PBS填充组、正常对照组。应用组化法观察移植细胞是否存活，取材前24h显露坐骨神经，行辣根过氧化物酶逆行示踪法观察脊髓损伤处的修复重建。[结果]骨髓基质细胞在定向分化为神经干细胞后标记并移植于脊髓损伤区，标记的阳性细胞可在受体脊髓内检测到，辣根示踪技术显示细胞移植组较PBS填充组阳性细胞明显增多，差别有统计学意义。[结论]大鼠骨髓基质细胞在体外分化为神经干细胞后移植于脊髓损伤区，移植细胞可以存活，并参与脊髓损伤处神经传导通路的结构重建。     

骨髓干细胞诱导分化构建组织工程神经

[目的]探讨组织工程化神经修复周围神经缺损的作用。[方法]以DMEM为培养基体外诱导人骨髓基质干细胞分化为雪旺细胞，与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经；建立坐骨神经缺损10mm的Wistar大鼠动物模型，A组：经诱导骨髓基质干细胞分化雪旺细胞与天然细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）凝胶及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经桥接神经缺损；B组：单纯将ECM凝胶注入可降解聚乳酸导管桥接神经缺损；C组：自体神经移植组。术后12周进行神经电生理检测、新生神经组织学观察和轴突计数等检测坐骨神经功能恢复情况。[结果]1．诱导后骨髓基质干细胞呈梭形、胞核大、周围有光晕、突起细长呈纵形排列，GAFP及S-100免疫组织化学染色阳性。动物模型各组经移植术后12周，再生神经已通过缺损区长至神经远端。A组、C组组织学及电生理检测指标均优于B组（PAB=0．021，PBC=0．001），A组与C组无显著性差异（PAC=0．065）；A、B组聚乳酸导管降解吸收明显。[结论]骨髓基质干细胞在体外可诱导分化为雪旺氏细胞，利用其与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经可以修复周围神经缺损。     

去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复周围神经缺损的实验研究

目的 探讨去细胞异种神经(acellular xenogeneic nerve,AXN)复合骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)修复周围神经缺损的效果.方法 体外培养大鼠BMSCs;取雌性Wistar大鼠60只,随机分为3组,每组20只,建立右坐骨神经10 mm缺损修复模型.A组:BMSCs与AXN复合修复神经缺损;B组:单纯AXN修复神经缺损;C组:自体神经移植组.术后4、12周依次进行干细胞的转归、移植免疫、神经电生理检测、新生神经组织学观察和小腿三头肌肌纤维横径等检测,判断坐骨神经功能恢复情况.结果 术后移植物内均可见细胞生长,A、C组细胞数目较多,排列整齐,只有A组S-100免疫组化染色阳性细胞内可见BrdU阳性表达,术后12周再生神经已通过远端缝合口.A组、C组组织学及电生理检测指标均优于B组(P＜0.05),A组与C组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs作为种子细胞可以在体内存活,并可分化为SCs,其与AXN复合构建组织工程神经修复神经缺损的效果接近于自体神经移植.     

冻干去细胞同种异体神经种植类许旺细胞修复坐骨神经缺损的实验研究

目的研究冻干去细胞异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法50只成年雌性DA大鼠随机分为5组，每组10只，分别用5种移植物桥接大鼠1．5cm坐骨神经缺损。A组：冻干去细胞异体神经种植类许旺细胞移植组；B组：冻干去细胞异体神经移植组；C组：去细胞异体神经移植组；D组：新鲜异体神经移植组；E组：自体神经移植组。术后4、24周通过大体观察、神经电生理、肌肉湿重及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果术后24周A、E组间差异无统计学意义（P〉0．05），A、E组的各项指标均优于B、C、D组（P〈0．05或P〈0．01）。结论冻干化学去细胞神经是良好的神经移植替代材料。     

用去细胞同种异体神经构建猕猴组织工程化神经的实验研究

目的评价用自体源骨髓间充质干细胞(MSCs)或许旺细胞(SCs)作种子细胞,与去细胞同种异体神经构建的组织工程化外周神经修复猕猴尺神经4cm缺损的实验效果,为临床研究提供资料。方法分别用4种移植物桥接猕猴4cm尺神经缺损。A组:种植自体MSCs的去细胞同种异体神经;B组:种植自体SCs的去细胞同种异体神经;C组:去细胞同种异体神经;D组:自体神经移植。通过功能学、神经电生理学及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果A、B组术后6个月能引起小鱼际肌群产生复合动作电位的潜伏期、复合动作电位的最大振幅、神经传导速度和再生的神经纤维数目与自体神经移植组相比无统计学意义(P>0.05);但A、B、C、D组分别与C组相比,差异有统计学意义(P>0.05)。结论用自体源SCs或MSCs作种子细胞,与去细胞同种异体神经构建的组织工程化外周神经修复猕猴4cm尺神经缺损,均能取得与自体神经移植相近的效果。     

犬化学去细胞神经同种异体移植的早期观察

目的：以化学去细胞同种异体神经，移植修复犬粗大神经的长段缺损，观察早期功能恢复及神经再生。方法：去细胞神经移植组和自体神经移植组各3犬，分别桥接坐骨神经5.0cm缺损。术后3个月观察其运动功能及神经再生。结果：实验组和对照组在术后功能恢复；移植段内新生神经纤维、新生血管及许旺细胞；吻合口远端有髓神经纤维等方面非常相似。结论：化学去细胞神经作为同种异体神经移植物，在修复粗大和长段神经缺损时不会被宿主排斥和吸收，其早期功能恢复及神经再生与自体神经移植无明显差别。     

神经干细胞移植对大鼠脊髓半切空洞损伤的修复作用

[目的] 观察神经干细胞移植后对大鼠损伤脊髓形态和功能的修复作用。[方法] 30只Wistar大鼠，分为半切洞损伤组、D-Hanks液对照组和神经干细胞移植治疗组。4、8周后取损伤部位脊髓组织进行HE、Nissl、Holmes银染观察神经纤维和神经细胞的再生情况。同时在伤后1、4、8周进行伤侧下肢MEP和SEP检测，了解感觉和运动功能的恢复情况。[结果] （1）治疗组4周后，分化的细胞基本闭合空洞，形成一空腔。8周时，在损伤处可见大量星形胶质细胞，及少数长出突起、存活的神经元，而且移植物与宿主之间在形态上形成纤维联系；（2）术后1周各组运动诱发电位和感觉诱发电位峰潜时明显延长，无显著差异性，手术后4、8周，C组的峰潜时较A、B组明显缩短，有显著的差异性（P〈0．01）。[结论] 神经干细胞移植到损伤脊髓组织后，能够存活、分化并从结构和功能上较好地修复组织缺损区域。     

骨髓间充质干细胞与嗅鞘细胞联合移植治疗脊髓损伤的早期观察

[目的]探讨自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞共培养及其联合移植修复脊髓损伤的可行性，为临床治疗提供一种新方法。[方法]无菌条件下采集自体骨髓间充质细胞和胎龄4～6个月的引产胎儿的嗅鞘细胞，分别培养至传代后再共培养，将共培养的混合细胞通过手术直视下移植至脊髓损伤部位。[结果]8例脊髓损伤患者接受自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞联合移植，并获得1～6个月的随访，所有接受细胞移植的8例患者术后均无不良反应，其中1例术后1个月开始出现双下肢深浅感觉恢复，其余7例比细胞移植前无明显改善。[结论]自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞共培养两者之间无相互抑制现象，近期观察二者联合移植修复脊髓损伤是安全的。     

多次移植骨髓基质干细胞有利于脊髓损伤修复

[目的] 研究多次经蛛网膜下腔移植骨髓基质干细胞对Wistar大鼠脊髓损伤的功能修复作用.[方法] 骨髓基质干细胞经体外分离、培养并用Hoecst33342标记.按照Allen方法把60只在T_(10)-T_(12)平面损伤的Wistar大鼠随机分4组,A、B、C、D组(对照组).在损伤平面蛛网膜下腔中段放置一硅胶管,在7 d后,注入1×10~6个骨髓基质干细胞.在2、3、5、7、12周荧光显微镜、免疫组化检测骨髓基质干细胞在损伤段脊髓的存活、分布、分化情况并作计数观察.使用BBB评分观测后肢功能恢复.[结果] 移植后7～14 d骨髓基质干细胞达到高峰,在7 d后表达巢蛋白及神经丝蛋白阳性.随时间的延长,移植在损伤部位的骨髓基质干细胞数量及神经元样细胞均有减少,但移植3次的细胞数减少速度较其他两组慢.移植3次组大鼠的BBB评分较移植1、2次组有明显的提高,P＜0.01,有统计学意义.[结论] 多次移植骨髓基质干细胞更有利于脊髓损伤的恢复.     

经嗅鞘细胞条件培养液诱导的骨髓基质干细胞移植对脊髓损伤修复的影响

[目的]研究经嗅鞘细胞条件培养液诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对脊髓损伤的治疗作用。[方法]采用脊髓挤压损伤方法,制造SD大鼠脊髓损伤动物模型(共24只),随机分成A、B、C三组(每组8只),立即分别将DMEM、BMSCs和经诱导的BMSCs移植入脊髓损伤部位,分别于移植4、8周后处死动物,均采用HE染色观察脊髓损伤处空洞面积改变情况;并采用抗神经丝(NF)抗体、生长相关蛋白-43(GAP-43)抗体和神经元特异性核蛋白(Neu N)抗体免疫组织化学荧光染色,观察移植的BMSCs存活和分化情况及损伤部位神经纤维再生情况。[结果]移植4、8周后,脊髓损伤区空洞为移植细胞充填,空洞面积明显减少,差异有统计学意义(P0.01),BBB评分结果 C组和A、B组之间存在统计学差异(P0.05)。B、C组均可见再生神经纤维形成,同时部分移植细胞呈Neu N染色阳性,在C组上述改变更加显著。[结论]经嗅鞘细胞条件培养液诱导的BMSCs可以在脊髓损伤区存活,能够显著减小脊髓损伤处空洞面积,并可以促进脊髓损伤区神经纤维的修复再生,促进大鼠双下肢运动功能的恢复。     

冲击波与地塞米松对自体血清培养的骨髓间充质干细胞成骨分化的比较研究

[目的]观察冲击波(shock waves)与地塞米松对自体血清培养的人骨髓间充质干细胞(human mesenchyreal stem cells,hMSCs)体外成骨分化的影响比较.[方法]选择10名健康志愿者,每名健康志愿者抽取骨髓60 ml,抽取外周静脉血100 ml,然后分离出自体血清.把每名志愿者的骨髓分别...     

新型神经支架材料的构建及其与骨髓基质干细胞复合的实验研究

[目的]研制出一种可用于修复周围神经缺损的组织工程支架材料,并观察体外培养的骨髓基质干细胞在支架材料中的生长情况。[方法]以I型胶原蛋白和明胶通过冷冻干燥技术制备胶原蛋白支架材料。扫描电镜观察内部结构的排列规律及走行,测量其孔径大小、孔隙率等指标。将骨髓基质干细胞复合到胶原蛋白支架材料中共培养5 d后,扫描电镜下观察其在材料内部的生长情况。[结果]构建的材料均为圆柱状,内部为孔径均匀且平行排列的微管结构,体外培养的骨髓基质干细胞成功种植在支架材料上,在材料内部生长良好。[结论]构建的支架材料具有良好的三维空间构形和生物相容性,为神经损伤的修复提供了一种新型的支架材料。     

BMSC定向分化为神经干样细胞后移植改善脊髓损伤大鼠的神经功能

目的 研究骨髓间充质干细胞(BMSC)定向分化为神经干样细胞后进行移植,改善脊髓损伤大鼠神经功能的作用及其机制,探讨适宜的移植时间.方法 取培养至第3代的BMSC,将其定向分化为神经干样细胞,并采用免疫荧光染色法进行鉴定.移植前用5溴2脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记细胞,移植时将其缓慢输注到损伤部位.实验分3组,移植Ⅰ组和移植Ⅱ组分别于脊髓损伤后1和2周进行移植,对照组操作同移植Ⅰ组,仅将移植用细胞悬液改为等量的生理盐水.移植后1~6周,对各组大鼠进行运动功能评分,采用荧光免疫化学染色检测移植细胞的存活、分化及神经纤维再生的情况.采用HE染色观察脊髓损伤区的病理学改变.结果 BMSC诱导培养3 d后,神经巢蛋白呈阳性表达,将诱导后的细胞球继续培养,可见细胞均有不同程度的神经丝蛋白(NF200)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性表达.移植后两移植组大鼠的运动功能评分均显著高于对照组(P＜0.05),移植Ⅰ组尤为明显.2个移植组均有大量的5溴2脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经巢蛋白双阳性细胞及部分BrdU和NF200双阳性细胞填充于脊髓损伤区,同时可见明显的神经纤维再生,脊髓损伤处的空洞面积明显小于对照组(P＜0.05),而移植I组神经功能的改善较移植Ⅱ组更加明显.结论 BMSC可定向诱导、分化为神经干样细胞,将其移植后可有效改善脊髓损伤大鼠的神经功能,脊髓损伤1周后的移植效果优于损伤2周后移植.

Abstract：

Objective To study the effect and mechanism of the neurological function recovery in rats with spinal cord injury (SCI) rats after the transplantation of neural stem cells which are directly differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC), and to investigate the suitable engraftment time.Methods The BMSC at 3rd passage were differentiated into neural stem cells (NSC), and immunofluorescence staining was used to identify the NSC. The oriented-induced cells were labeled with Brdu 3 days before they were transplanted, and they were slowly injected into the injured site of the SCI rats. The SCI rats were randomly divided into group Ⅰ (transplantation at first week postinjury), group Ⅱ (transplantation at 2nd week postinjury) and control group (the operation was the same as group Ⅰ, but the cell suspension was replaced by the equal volume of normal saline). The BBB scores after transplantation were recorded. The distribution and differentiation of transplanted cells were observed by using immunofluorescence staining with antibodies against Brdu combined with Nestion and Brdu combined with NF200. NF200 immunofluorescence staining was used to show the regeneration of nerve fibers. The pathological changes of the injured site were observed by HE staining.Results The nestin expression was positive after the BMSC were differentiated for 3 days, and if the induced spherical cells were cultured continuously, the different levels of NF200 and GFAP were found. BBB scores in group Ⅰ and group Ⅱ were significantly higher than in control group (P<0.05), especially in group Ⅰ. The immunofluorescence showed that a large number of Brdu and Nestin double-positive cells and some Brdu and NF200 double-positive cells filled the injured site and linked the two sides of the injured area in group Ⅰ and group Ⅱ, and the lesion area of the spinal cord was reduced as compared with control group (P<0.05). More importantly, further reduction in lesion area and improvement in neurological function were observed in group Ⅰ.Conclusion The BMSC can be differentiated into NSC. The transplantation of the NSC could effectively promote the nerve function recovery after SCI, and the effect of transplantation at first week postinjury was better than at 2nd week postinjury.     

同种异体血清在体外培养骨髓间充质干细胞的作用研究

[目的]适当的血清浓度可维持骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养,血清浓度过低不利于细胞的生长,而高浓度血清则易引起细胞分化。而血清的不同来源对MSCs的培养同样产生影响。传统的培养方法用胎牛血清作为营养支持,临床应用时存在潜在的风险。本研究探讨同种异体血清在体外培养人骨髓间充质干细胞(hBM-SCs)的可行性。[方法]无菌条件下收集人骨髓悬液,分离hBMSCs,分别用含胎牛血清和人血清的培养基培养。分别测定2种方法培养的hBMSCs细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测分析培养的hBMSCs表面抗原类型;并将培养的hBMSCs诱导分化为软骨细胞及神经细胞,诱导后的软骨细胞及神经细胞采用免疫组化染色分析。[结果]2种方法培养的间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性,表达强度无显著性差异;人血清培养的hBMSCs细胞生长速度快于胎牛血清培养组,但分化效率低于后者。[结论]通过生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,人血清培养hBMSCs与胎牛血清培养差别不大,可以作为一种适合临床的安全培养方法。     

Study of in vivo differentiation of rat bone marrow stromal cells into schwann cell-like cells

In order to raise an abundant and accessible reservoir for Schwann cells (SCs), which are used as seed cells for constructing tissue-engineered nerve grafts, we investigated the feasibilty of in vivo differentiation of bone marrow stromal cells (MSCs) into SC-like cells. In this study, MSCs were harvested from adult rats' bone marrow, culture-expanded, and characterized. Subcultured MSCs were then labeled with Hoechst 33342, followed by transplantation into the nerve regeneration chamber, which was made of a silicone tube bridging the sciatic nerve defect of the rats. Four weeks after surgery, some of the differentiated MSCs turned into SC-like cells immunopositive to S-100 protein, accompanied by myelination of the regenerated nerve fibers. Walking-track analyses provided evidence that transplantation of MSCs contributed to reconstruction of the sciatic nerve and reinnervation of target tissues. The experimental results suggest that MSCs are capable of differentiating into SC-like cells in vivo, making them a promising candidate for cell transplantation in peripheral nerve repair.     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中降钙素基因相关肽受体的表达

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)受体的表达变化。[方法]采用全骨髓法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,分为诱导成骨组与未诱导组,在传代培养的不同时期(1、2、3周),采用免疫细胞化学、Western Blot对骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化进行鉴定,采用RT-PCR、Western Blot检测各组细胞CGRP受体mRNA、蛋白的表达情况。[结果]RT-PCR结果显示同一时间点诱导组CGRP受体mRNA表达量高于未诱导组,诱导组CGRP受体mRNA表达以时间依赖性的方式不断增高;Western Blot结果显示同一时间点诱导组CGRP受体的蛋白水平高于未诱导组,诱导组CGRP受体蛋白水平以时间依赖性的方式增高。[结论]本实验从mRNA、蛋白水平证实大鼠骨髓间充质干细胞表达CGRP受体,随着成骨诱导的不断进行,CGRP的表达量随之上升。     

大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脊髓神经干细胞分化的研究

[目的]观察大鼠嗅神经鞘细胞上清液对脊髓神经干细胞共培养发生的诱导分化作用。[方法]采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞，分时段Mr丌法检测细胞活性，选取最佳状态细胞无血清培养后取上清液，与3代纯化后的神经干细胞共培养，观察分化过程，免疫荧光法鉴定诱导结果。[结果]MTT法分6个时段检测纯化后的嗅鞘细胞，发现9d及12d细胞活性最高。使用无血清嗅鞘细胞上清液与脊髓神经干细胞共培养发现诱导作用明显，向神经元样细胞及胶质细胞分化的比例分别达到53％和42％。[结论]嗅鞘细胞在体外培养的不同时间段活性不同，无血清的嗅鞘细胞上清有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用。     

神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究

[目的]观察神经干细胞静脉移植对损伤大鼠脊髓功能的治疗作用。[方法]取孕14—16dSD胎鼠的脑室下区组织，体外培养后鉴定细胞。制作脊髓全切模型，伤后1周将Brdu标记好的神经干细胞通过尾静脉注射移植到大鼠体内，移植后及8周行皮层体感诱发电位（CSEP）检测和BBB功能评分，并留损伤脊髓处作病理切片及免疫组化染色。[结果]（1）移植后8周BBB评分损伤组、移植组都有所恢复，但都未达到正常水平，移植组恢复较好；（2）模型制作后，CSEP波均消失，细胞移植后8周移植组的波形有不同程度的恢复，但潜伏期延长；（3）移植组大鼠脊髓损伤处存在大量Brdu染色阳性细胞，表明移植的细胞在体内可到达损伤脊髓处并能存活；脊髓损伤部位NF-200及GFAP染色阳性的细胞表明移植的细胞可以分化为具有神经元和胶质细胞特性的细胞。[结论]静脉移植的神经干细胞能到达损伤区代替受损的神经元及神经胶质细胞，使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。